彭心聲,朱麗麗,劉彥蕊,杜江燕,2,3*

(1.南京師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046；2.江蘇省生物功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

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三維有序金摻雜納米TiO2修飾電極用于抗腫瘤藥物與DNA相互作用的研究

彭心聲1,朱麗麗1,劉彥蕊1,杜江燕1,2,3*

(1.南京師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046；2.江蘇省生物功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

江蘇 南京 210046；3.江蘇省新型動(dòng)力電池重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046)

利用模板法在氧化銦錫(ITO)電極表面制備了三維有序多孔結(jié)構(gòu)的金摻雜納米TiO2薄膜修飾電極(3DOM GTD/ITO)，并在此修飾電極上成功固定小牛胸腺DNA(ctDNA)，從而構(gòu)建了一種新型的DNA生物傳感器(DNA/3DOM GTD/ITO),并通過(guò)透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)對(duì)修飾電極的表面形貌進(jìn)行表征。采用電化學(xué)交流阻抗(EIS)法研究了ctDNA在3DOM GTD/ITO修飾電極表面的固定情況，結(jié)果表明，ctDNA已被成功地固定在3DOM GTD/ITO修飾電極表面。采用循環(huán)伏安法、微分脈沖伏安法等電化學(xué)方法研究了抗腫瘤藥物槲皮素(Qu)在3DOM GTD/ITO修飾電極表面的電化學(xué)性質(zhì)及與ctDNA的相互作用。結(jié)果表明，Qu在3DOM GTD/ITO修飾電極表面有1對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，其氧化還原反應(yīng)為2電子和2質(zhì)子的轉(zhuǎn)移過(guò)程。Qu可與固定在修飾電極上的ctDNA發(fā)生較強(qiáng)的結(jié)合作用，其結(jié)合常數(shù)(K)為3.61×106L/mol。循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)、紫外-可見(jiàn)吸收光譜、分子熒光光譜、圓二色性光譜均表明Qu與ctDNA之間的相互作用模式為嵌插作用。Qu與ctDNA的堿基結(jié)合具有序列選擇性，對(duì)Qu與聚(dG-dC)及聚(dA-dT)的結(jié)合常數(shù)進(jìn)行計(jì)算，得到結(jié)合常數(shù)比K(dG-dC )/K(dA-dT)=3.5，表明Qu與ctDNA發(fā)生嵌插作用時(shí)更傾向于結(jié)合在GC富集區(qū)域。

三維有序多孔結(jié)構(gòu)；金摻雜納米TiO2；DNA修飾電極；槲皮素；嵌插作用；序列選擇性

DNA(脫氧核糖核酸)是所有生物的基本遺傳物質(zhì)，一些藥物分子與DNA的作用，會(huì)引起DNA生理和物理化學(xué)性質(zhì)的變化，從而影響其轉(zhuǎn)譯和復(fù)制過(guò)程。研究藥物分子與DNA的相互作用，有助于人們了解DNA與藥物分子的相互作用方式，對(duì)新型藥物的設(shè)計(jì)合成具有重要意義。DNA電化學(xué)傳感器能對(duì)許多重要的小分子化合物(包括環(huán)境污染物、致癌物、藥物等)進(jìn)行分子識(shí)別，可用于DNA與這些物質(zhì)相互作用的研究[1]。通過(guò)研究DNA修飾電極上小分子與DNA作用前后的電化學(xué)信號(hào)變化，可以探討小分子與DNA的相互作用機(jī)理、作用模式及結(jié)合位點(diǎn)，以及結(jié)合常數(shù)、堿基選擇性等信息[2]。

槲皮素( Quercetin，Qu) 是許多天然中草藥如銀杏葉、高良姜、魚腥草、柴胡等的主要成分[3]，屬于黃酮醇類化合物，化學(xué)命名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，具有抗病毒、抗過(guò)敏、抑制血小板聚集、抗炎和抗腫瘤活性。槲皮素能顯著抑制促癌劑的作用，抑制離體惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制艾氏腹水癌細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成，是目前已知的最強(qiáng)抗癌劑之一[4-6]。

目前，關(guān)于Qu與DNA相互作用的電化學(xué)研究已有報(bào)道，如周晶等[7]研究了Qu與DNA的作用，指出其作用模式為靜電作用；李南強(qiáng)等[8]對(duì)Qu與DNA作用的活性作用位點(diǎn)及其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和作用機(jī)理進(jìn)行了研究，指出DNA與Qu的活性作用位點(diǎn)為Qu的B環(huán)上3′,4′位的羥基。但上述研究大部分在Qu與DNA溶液中進(jìn)行，所需試劑量大，且存在較大的背景干擾。因此，研制新型的DNA電化學(xué)傳感器，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展抗腫瘤藥物與DNA的相互作用研究，具有重要的理論意義及應(yīng)用價(jià)值。

在電化學(xué)生物傳感器的制備中，生物活性分子在電極表面的固定直接關(guān)系到生物傳感器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、靈敏度等性能，是制備過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。本課題組采用模板法制備了三維有序金摻雜納米TiO2薄膜修飾電極(3DOM GTD/ITO)，并在修飾電極表面成功固定了辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、肌紅蛋白(HB)、細(xì)胞色素C(Cyt C)以及DNA等生物分子[9-13]，構(gòu)建了酶及DNA生物電化學(xué)傳感器。該修飾電極比表面積大，吸附能力強(qiáng)，具有良好的生物相容性和電催化活性。此外，該材料的三維有序多孔結(jié)構(gòu)可以有效控制DNA在電極上固定的取向，避免固載過(guò)程中引起DNA的變性和失活。

本研究基于在3DOM GTD/ITO電極表面構(gòu)建的DNA電化學(xué)傳感器(DNA/3DOM GTD/ITO)，通過(guò)電化學(xué)及紫外-可見(jiàn)吸收光譜、分子熒光光譜、圓二色性光譜等實(shí)驗(yàn)方法研究了Qu與DNA相互作用的結(jié)合模式、結(jié)合常數(shù)，以及Qu與DNA作用的序列選擇性，為該DNA修飾電極用于抗腫瘤藥物分子與DNA等生物大分子的相互作用研究提供了新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

小牛胸腺DNA(ctDNA，美國(guó)Sigma公司)，槲皮素(Qu，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，氯金酸(分析純,上海試劑一廠)，聚苯乙烯微球(PS，1%，290±15 nm，實(shí)驗(yàn)室自制);ITO玻璃(西安泰金工業(yè)電化學(xué)技術(shù)有限公司，R<20 Ω/cm2)，實(shí)驗(yàn)時(shí)切割成60 mm ×10 mm ×1.2 mm。其他試劑均為分析純，溶液用二次水配制。

ctDNA溶液的配制：取5 mg 的ctDNA置于10 mL離心管中，向其中加入5 mL二次水，將此離心管放入冰浴中攪拌6 h，直至DNA完全溶解，即得到1 mg/mL的ctDNA儲(chǔ)備液。ctDNA儲(chǔ)備液用1 mL離心管分裝，置于-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆?。ctDNA溶液的濃度通過(guò)測(cè)定DNA在260 nm處吸光度來(lái)確定(摩爾吸光系數(shù)ε260=6 600 mol·cm-1[14])。實(shí)驗(yàn)所用ctDNA溶液的質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，濃度為1.13×10-4mol/L。

DNA寡核苷酸序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，分別為：(dA-dT)26:AAATTTAATTAATTTTAAATTAATTA;(dG-dC)26:GGGCCCGGCCGGCCCCGGGCCGGCCG。

CHI 760型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，JSM 7600F型掃描電子顯微鏡(日本電子公司)，H-7650型透射電鏡(日本Hitachi公司)，Cary50型紫外吸收分光光譜儀(北京普析通用公司)，Chriascan型數(shù)字式圓二色性光譜儀(Applied Photophysis公司)，Cary Eclipse型分子熒光光譜儀(美國(guó)瓦里安公司)。

1.2 修飾電極的制備

清洗ITO玻片：首先將ITO玻片在堿液(氫氧化鈉和乙醇混合溶液配制)中浸泡30 min，再依次在異丙醇、乙醇、二次水中各超聲30 min，用二次水沖洗玻片3次，自然晾干后備用。

組裝模板：利用蒸發(fā)自組裝法，將1%的PS小球乙醇溶液置于稱量瓶中(35 mm×70 mm)，然后將處理好的ITO玻片懸于其中，40 ℃下在真空干燥箱中放置約3 d。隨著乙醇的揮發(fā)，PS小球?qū)⒆詣?dòng)組裝在ITO玻片上，之后將該玻片于95 ℃烘箱中恒溫2 h，使PS小球在ITO電極上固化，即得PS小球模板。

灌裝溶膠：摻金納米TiO2溶膠按文獻(xiàn)[15]方法制備。將制備的溶膠超聲10 min，得到金納米TiO2溶膠懸濁液。取5 μL懸濁液，沿模板斜面緩緩滴下，直至溶膠浸潤(rùn)整片模板。室溫晾干，再次滴加制備的溶膠，重復(fù)上述灌裝過(guò)程2次，室溫晾干，備用。

高溫煅燒去除模板：采用馬弗爐高溫煅燒去除模板中的PS小球，以2 ℃/min升溫至500 ℃后恒溫2 h，再以2 ℃/min降至室溫，留在ITO玻片上的多孔有序結(jié)構(gòu)即為三維有序金摻雜納米TiO2，記為3DOM GTD/ITO。

圖1 修飾電極的制備過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic diagram of preparation process of the modified electrode

固定DNA：將10 μL CT-DNA溶液滴在上述電極上，至溶液均勻地浸潤(rùn)整片電極，置于4 ℃冰箱中，靜置過(guò)夜。取出電極用二次水清洗3次，以除去非特異性吸附的DNA，置于4 ℃下晾干，即得DNA/3DOM GTD/ITO電極，于4 ℃下儲(chǔ)存，備用。上述DNA修飾電極制備過(guò)程見(jiàn)圖1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

紫外-可見(jiàn)吸收光譜：以0.1 mol/L 的HAc-NaAc緩沖溶液(pH 5.5)為參比溶液，在1 cm的比色皿中，于200～500 nm范圍內(nèi)測(cè)定Qu與DNA作用前后溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。

分子熒光光譜：以0.1 mol/L的HAc-NaAc緩沖溶液(pH 5.5)為參比溶液，λex為421 nm，在λem500～700 nm范圍內(nèi)測(cè)定5.0×10-5mol/L Qu與不同濃度DNA溶液相互作用的分子熒光光譜。

圓二色性光譜：以pH 7.4的PBS為參比溶液，在1 cm的石英比色皿中，以120 nm/min的掃描速率，在260～350 nm范圍內(nèi)連續(xù)掃描DNA與Qu作用前后DNA溶液的圓二色性光譜。

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)：使用傳統(tǒng)的三電極體系，工作電極為制備的修飾電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對(duì)電極為鉑電極，所有電位均相對(duì)于SCE。藥物分子Qu與DNA相互作用的循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)在0.1 mol/L的HAc-NaAc緩沖溶液(pH 5.5)中進(jìn)行，掃速為200 mV/s，電位范圍為0～0.5 V。不同修飾電極的循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)在5.0×10-3mol/L的[Fe(CN)6]4-/3-及0.1 mol/L KCl的支持電解質(zhì)溶液中進(jìn)行，電位范圍為-0.6～1.0 V，掃速為10 mV/s。交流阻抗分析在5.0×10-3mol/L的[Fe(CN)6]4-/3-+0.1 mol/L KCl溶液中進(jìn)行，開(kāi)路電壓為0.211 V，頻率為0.1～10 000 Hz。實(shí)驗(yàn)前通入高純氮?dú)?5 min除氧，實(shí)驗(yàn)中保持氮?dú)夥諊?，所有?shí)驗(yàn)均在25 ℃下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極的形貌表征

采用透射電鏡實(shí)驗(yàn)(TEM)表征納米金在TiO2溶膠中的分布及金納米粒子的粒徑。結(jié)果顯示，金納米粒子均勻分布在納米TiO2溶膠中，且粒徑均一(約20 nm)，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象。

采用掃描電鏡(SEM)對(duì)三維有序多孔結(jié)構(gòu)制備過(guò)程中電極表面的形貌進(jìn)行表征。圖2A為自組裝PS微球模板的SEM圖，可以看到PS微球均勻地排列在ITO上;圖2B為灌裝溶膠后PS模板的SEM圖，摻金的納米TiO2溶膠已均勻地灌裝到PS微球的縫隙中；圖2C為煅燒后在ITO玻片電極表面得到的三維有序多孔結(jié)構(gòu)，制備的三維多孔結(jié)構(gòu)層次清晰、表面整齊有序、孔徑均一。

圖2 PS模板(A)、PS-GTD(B)與3DOM GTD(C)的SEM圖Fig.2 SEM images of PS template(A)，PS template-GTD(B) and 3DOM GTD(C)

2.2 修飾電極的電化學(xué)表征

在掃速為10 mV/s，電位范圍為-0.6～1.0 V時(shí)，考察了不同修飾電極在5.0 ×10-6mol/L[Fe(CN)6]4-/3-和0.1 mol/L KCl的支持電解質(zhì)溶液中的循環(huán)伏安圖(見(jiàn)圖3A)?？捎^察到，在3DOM GTD/ITO修飾電極上，[Fe(CN)6]4-/3-有1對(duì)很好的氧化還原峰，分別為Epa=0.41 V，Epc=-0.041 V,峰電位差ΔEp=0.451 V(圖3曲線a)。在DNA/3DOM GTD/ITO修飾電極上，[Fe(CN)6]4-/3-的氧化還原峰電流明顯降低(圖3A曲線b)，且峰電位差增大為ΔEp=0.559 V，這是因?yàn)閏tDNA分子的磷酸骨架帶負(fù)電荷，排斥同樣帶負(fù)電荷的[Fe(CN)6]4-/3-接近電極，使[Fe(CN)6]4-/3-在電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率降低[2]，因此[Fe(CN)6]4-/3-的氧化還原峰電流降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ctDNA已成功固定在修飾電極上。

Fig.3 Cyclic voltammograms(A) and EIS spectra(B) of different electrodes

a.3DOM GTD/ITO,b.DNA/3DOM GTD/ITO ，c.ITO;buffer：5.0 ×10-6mol/L[Fe(CN)6]4-/3-+0.1 mol/L KCl

電化學(xué)阻抗譜(EIS)可以提供不同修飾電極表面的阻抗變化信息[16]，EIS圖中半圓的直徑越大，表明電極表面電子轉(zhuǎn)移的阻抗值越大。圖3B為不同修飾電極在[Fe(CN)6]4-/3-溶液中的EIS圖，從圖中可以看出，不同電極的交流阻抗值按以下順序減小：DNA/3DOM GTD/ITO>3DOM GTD/ITO>ITO。由于納米TiO2是半導(dǎo)體材料，其修飾到ITO電極上使電極的電阻有所增大。當(dāng)電極表面吸附ctDNA后，其電阻明顯增大，表明ctDNA已成功地固定在修飾電極上，吸附的ctDNA阻礙了[Fe(CN)6]4-/3-和電極之間的電子轉(zhuǎn)移。

圖4 不同修飾電極上Qu在0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液(pH 5.5)中的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of Qu at various electrodes in 0.1 mol/L HAc-NaAc buffer(pH 5.5) a.3DOM GTD/ITO,b.DNA/3DOM GTD/ITO；scan rate：0.2 V/s

在0～0.5 V電位范圍內(nèi)，掃速為200 mV/s時(shí),不同修飾電極置于5.0×10-4mol/L的Qu和0.1 mol/L的HAc-NaAc緩沖溶液(pH 5.5)中的循環(huán)伏安圖見(jiàn)圖4。由圖4a可以看出，在3DOM GTD/ITO修飾電極上，Qu有1對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，其陽(yáng)極峰電位(Epa)和陰極峰電位(Epc)分別為0.289 V和0.178 V，電位差為0.111 V，氧化還原式電位E0′為0.234 V。在DNA/3DOM GTD/ITO修飾電極上(圖4b)，其Epa和Epc分別是0.309 V和0.239 V，電位差為0.07 V，氧化還原式電位E0′為0.274 V。在DNA修飾電極上，Qu氧化還原峰電流均有不同程度地減小，且式電位發(fā)生正移,ΔE0′=0.04 V。

考察了不同pH值的HAc-NaAc緩沖溶液對(duì)Qu電化學(xué)活性的影響。結(jié)果顯示，隨著緩沖液pH值的增加，Qu的氧化峰電流逐漸增加，當(dāng)pH值為5.5時(shí)，峰電流達(dá)到最大，此后隨著pH值繼續(xù)增大，峰電流反而減小。因此，實(shí)驗(yàn)采用pH 5.5的HAc-NaAc緩沖溶液為支持電解質(zhì)。

循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)中，考察了Qu氧化峰電位與支持電解質(zhì)pH值的關(guān)系曲線。根據(jù)線性方程的相關(guān)系數(shù)(r2=0.998 5)和曲線斜率(-0.07)，通過(guò)能斯特方程計(jì)算出Qu氧化還原反應(yīng)中，電子轉(zhuǎn)移數(shù)與質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)均為2，這與文獻(xiàn)[2]報(bào)道的Qu在DNA修飾玻碳電極上的電化學(xué)研究結(jié)論一致。

Qu的氧化還原反應(yīng)過(guò)程如圖5所示，Qu的分子結(jié)構(gòu)中A環(huán)為苯甲酰，B環(huán)為肉桂酰，其中B環(huán)上3′,4′位的羥基是氧化還原活性基團(tuán)。

圖5 槲皮素的氧化還原反應(yīng)過(guò)程[2]Fig.5 The electrochemical reaction process of Qu[2]

2.3 Qu與DNA的結(jié)合模式及結(jié)合常數(shù)

通常認(rèn)為，小分子與DNA之間的作用方式主要有嵌插作用、溝槽結(jié)合及靜電作用。Bard等[17]提出，當(dāng)小分子與DNA發(fā)生作用時(shí)，如果其氧化還原式電位E0′向負(fù)方向偏移，則小分子與DNA發(fā)生靜電作用；如果式電位E0′向正方向偏移，則發(fā)生嵌插作用。本研究的電化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)在3DOM GTD/ITO修飾電極上固定ctDNA后，Qu的氧化還原式電位E0′由0.234 V正移至0.274 V，因此，在DNA/3DOM GTD/ITO修飾電極上，Qu與DNA的作用方式為嵌插作用。在Qu與DNA的嵌插作用中，其分子結(jié)構(gòu)的平面性是關(guān)鍵因素，它的平面結(jié)構(gòu)使其幾乎與DNA含氮堿基相鄰的平面平行，有利于Qu插入到DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中。這種嵌插作用部分掩蔽了Qu的電活性部位，因此電化學(xué)實(shí)驗(yàn)中觀察到Qu的氧化還原反應(yīng)峰電流減小。

Solimani 等[18-20]使用線性二色性光譜研究了Qu與DNA的結(jié)合方式，研究表明，Qu可以嵌插到DNA中形成DNA-Qu復(fù)合物。對(duì)于Qu和DNA形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)，可以根據(jù)引入DNA前后Qu峰電流差值的倒數(shù)1/ΔI與Qu濃度1/[Qu]m的關(guān)系式計(jì)算[21]：1/ΔI=1/ΔImax+1/(K×ΔImax×[Qu]m),式中，ΔI表示引入DNA前后Qu峰電流的差值，ΔImax為峰電流差值的最大值，K為Qu和DNA的結(jié)合常數(shù)。如果Qu與DNA只形成一種簡(jiǎn)單的超分子化合物，則1/ΔI與1/[Qu]m呈線性。本實(shí)驗(yàn)中，1/ΔI與cQu-2呈線性，線性方程為ΔI-1=0.120 6cQu-2+4.35×105，相關(guān)系數(shù)r2=0.996 8，得出結(jié)合數(shù)m=2，即Qu與DNA形成了一種DNA-2Qu的復(fù)合物。由斜率(0.120 6)和截距(4.35×105)，可求出Qu和DNA的結(jié)合常數(shù)K=3.61×106L/mol。

圖6 不同修飾電極上Qu在0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液(pH 5.5)中的示差脈沖伏安圖Fig.6 Differential pulse voltammograms of Qu at various electrodes a.3DOM GTD/ITO,b.(dA-dT)26/3DOM GTD/ITO,c.(dG-dC)26/3DOM GTD/ITO;0.1 mol/L HAc-NaAc(pH 5.5);scan rate:0.2 V/s

圖7 Qu及DNA在0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液(pH 5.5)中的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.7 UV-Vis spectra of Qu and DNA in 0.1 mol/L HAc-NaAc buffer(pH 5.5)a.5.0×10-5 mol/L Qu,b.1.13×10-4 mol/L DNA, c.5.0×10-5 mol/L Qu+1.13×10-4 mol/L DNA

2.4 Qu與DNA結(jié)合的序列選擇性

圖6為Qu在不同修飾電極上的示差脈沖伏安圖。由圖可見(jiàn)，Qu在(dG-dC)26堿基序列DNA修飾電極(曲線c)上的峰電流減小值是(dA-dT)26堿基序列DNA修飾電極(曲線b)的2.3倍。研究了Qu在3DOM GTD/ITO、(dA-dT)26/3DOM GTD/ITO及(dG-dC)26/3DOM GTD/ITO修飾電極上峰電流與Qu濃度的關(guān)系曲線。結(jié)果表明，Qu在(dG-dC)26堿基序列DNA修飾電極上的峰電流值最低，表明Qu對(duì)DNA的GC堿基序列表現(xiàn)出更高的序列選擇性，由此推測(cè)Qu與ctDNA發(fā)生嵌插作用時(shí)更傾向于結(jié)合在GC富集區(qū)域。

ctDNA是典型的B型DNA，具有寬而淺大溝結(jié)構(gòu)，有利于黃酮類化合物Qu的插入。通常稠合芳環(huán)體系與DNA作用時(shí)傾向于結(jié)合在GC富集區(qū)[22]，為進(jìn)一步確定Qu與DNA堿基序列結(jié)合的選擇性，按照“2.3”所述方法分別計(jì)算Qu與(dG-dC)26，(dA-dT)26堿基序列作用的結(jié)合常數(shù)，得到KdA-dT=5.40×106L/mol，KdG-dC=1.90×107L/mol，即K(dG-dC )/K(dA-dT)=3.5。此數(shù)據(jù)表明，Qu與ctDNA發(fā)生嵌插作用時(shí)更傾向于結(jié)合在GC富集區(qū)域。

2.5 Qu與ctDNA相互作用的光譜表征

2.5.1 Qu與ctDNA相互作用的紫外-可見(jiàn)吸收光譜 Qu及DNA在0.1 mol/L的HAc-NaAc緩沖溶液(pH 5.5)中的紫外可見(jiàn)吸收光譜見(jiàn)圖7。其中曲線a 為Qu的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，最大吸收峰為λQu1=254 nm，λQu2=368 nm。曲線b為ctDNA的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，最大吸收峰為λDNA=260 nm。曲線c為Qu與ctDNA混合溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，可觀察到Qu與ctDNA作用后，Qu在368 nm處的最大吸收峰吸光度減小，且最大吸收峰從368 nm紅移至376 nm，表現(xiàn)出減色紅移效應(yīng)。通常認(rèn)為，小分子與DNA發(fā)生相互作用后，如果其吸收光譜上觀察到減色、等吸收點(diǎn)、光譜紅移等3種光譜現(xiàn)象，則表明小分子與DNA以嵌插方式鍵合；若吸收光譜受DNA的影響較小，無(wú)減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象，則說(shuō)明小分子與DNA之間存在靜電作用。這是因?yàn)榍度氲男》肿优cDNA堿基對(duì)可發(fā)生π電子堆積，作用配體的π空軌道與堿基的π軌道發(fā)生偶合，使能量降低，導(dǎo)致π→π躍遷能量減小，從而產(chǎn)生紅移現(xiàn)象；同時(shí)，偶合后的π軌道因部分填充電子，使π→π躍遷幾率減小，產(chǎn)生減色效應(yīng)[23]。因此，紫外-可見(jiàn)光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Qu與ctDNA間的作用方式符合嵌插作用特征。

圖8 Qu及DNA在0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液(pH 5.5)中的圓二色性光譜Fig.8 CD spectra of Qu and DNA in 0.1 mol/L HAc-NaAc buffer(pH 5.5)a.5.65×10-4 mol/L DNA,b.1.0×10-3 mol/L Qu+5.65×10-4 mol/L DNA

2.5.2 Qu與DNA相互作用的分子熒光光譜 在pH 5.5的HAc-NaAc緩沖溶液中，向5.0×10-5mol/L的Qu溶液中加入不同濃度ctDNA后，掃描體系的熒光光譜。結(jié)果顯示，Qu的熒光強(qiáng)度隨著DNA濃度的增大而增大。這是由于Qu分子具有平面結(jié)構(gòu)的共軛π鍵使其具有熒光，當(dāng)其B環(huán)嵌入到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對(duì)之間后，Qu的平面性增加且減少了溶劑分子對(duì)其的碰撞，因此Qu的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[24]。此外有文獻(xiàn)對(duì)Qu及EB與DNA的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合進(jìn)行了研究[25]，發(fā)現(xiàn)Qu可通過(guò)嵌插結(jié)合的方式取代EB-DNA復(fù)合物中的EB分子。

2.5.3 Qu與DNA相互作用的圓二色性光譜 圓二色性光譜(CD)是研究DNA與配基(包括小分子和蛋白質(zhì)等大分子)相互作用的有力工具[26]。DNA的CD信號(hào)是由其骨架結(jié)構(gòu)中的不對(duì)稱糖分子和由這些糖分子的構(gòu)型決定的螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的，根據(jù)配基對(duì)原有DNA的CD信號(hào)的影響，以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的圓二色性光譜新信號(hào)(ICD)的不同特點(diǎn)，不僅可以得知配基與DNA間存在的相互作用，還可以推斷配基與DNA結(jié)合的不同模式[26]。標(biāo)準(zhǔn)B型DNA的CD 正峰出現(xiàn)在280 nm附近，負(fù)峰位于245 nm附近，這些波帶分別源自于堿基和聚核苷酸雙螺旋結(jié)構(gòu)間的堆積作用[27-28]。圖8中曲線a是ctDNA在HAc-NaAc緩沖溶液(pH 5.5)中的CD光譜，其正峰分別為221 nm和276 nm，負(fù)峰為247 nm。曲線b為加入Qu后DNA的CD光譜，其正峰分別為221，272 nm，負(fù)峰為247 nm。由圖可見(jiàn)，加入Qu后DNA在276 nm的CD譜峰位置發(fā)生位移(Δλ=4 nm)，且正、負(fù)峰的強(qiáng)度也發(fā)生明顯變化，說(shuō)明Qu的加入引起了DNA構(gòu)象的改變。通常平面的芳環(huán)分子通過(guò)嵌入作用插入到DNA雙螺旋分子堿基對(duì)的片層間時(shí)，會(huì)引起雙螺旋解旋及DNA分子伸長(zhǎng)，結(jié)合常數(shù)一般在1.0×105～1.0×1011L/mol之間[29-30]。根據(jù)“2.3”計(jì)算得到的Qu與DNA作用的結(jié)合常數(shù)(K=3.61×106L/mol)符合小分子與DNA間嵌插作用方式的結(jié)合常數(shù)特征。此外，當(dāng)小分子與DNA之間以嵌插作用方式結(jié)合時(shí)，小分子嵌入會(huì)導(dǎo)致堿基堆積作用發(fā)生明顯的分裂，使DNA的堿基堆積力強(qiáng)度受到影響，使其CD譜峰信號(hào)強(qiáng)度明顯減小[31]。由圖8可見(jiàn)，隨著Qu的加入，DNA的CD信號(hào)強(qiáng)度明顯減小，符合小分子與DNA間的嵌插結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)了Qu與DNA間的作用方式為嵌插作用。

3 結(jié) 論

本文采用模板法制備了3DOM GTD 薄膜修飾電極，并構(gòu)建了一種新型的DNA生物傳感器(DNA/3DOM GTD/ITO)?；谠揇NA生物傳感器，研究了抗腫瘤藥物小分子Qu與DNA間相互作用的結(jié)合模式、結(jié)合位點(diǎn)及序列選擇性，建立了一種方法簡(jiǎn)便、成本低廉的研究藥物小分子與DNA相互作用的新方法。該DNA生物傳感器也可應(yīng)用于其他藥物小分子與生物大分子(如酶、蛋白質(zhì)等)相互作用的研究，為研究抗癌藥物與生物大分子的作用模式、作用機(jī)理以及設(shè)計(jì)合成新型藥物提供了新的思路，具有較好的實(shí)際意義和應(yīng)用前景。

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Study on Interaction between Antitumor Drug and DNA by Three-dimensionally Ordered Gold-nanoparticle-doped Titanium Dioxide Modified Electrode

PENG Xin-sheng1,ZHU Li-li1，LIU Yan-rui1,DU Jiang-yan1,2,3*

(1.College of Chemistry and Materials Science，Nanjing Normal University，Nanjing 210046，China；2.Jiangsu Key Laboratory of Biofunctional Materials，Nanjing 210046，China；3.Jiangsu Key Laboratory of New Power Batteries，Nanjing 210046，China)

A novel DNA biosensor was fabricated with three-dimensionally ordered macroporous gold-nanoparticle-doped titanium dioxide(3DOM GTD) film on the indium-tin oxide(ITO) electrode surface by the colloidal crystal template technique,and calf thymus DNA(ctDNA)was immobilized on the 3DOM GTD/ITO successfully.The morphology of the modified electrode was characterized by transmission electron microscopy(TEM) and scanning electron microscopy(SEM).The immobilization of ctDNA on the surface of 3DOM GTD/ITO modified electrode was investigated by electrochemical impedance spectroscopy(EIS).The EIS experimental results showed that ctDNA was successfully immobilized on the 3DOM GTD/ITO modified electrode.The electrochemical properties of the antitumor drug quercetin (Qu) and the interaction between Qu and ctDNA were studied on 3DOM GTD/ITO modified electrode by cyclic voltammograms (CV) and differential pulse voltammograms(DPV) method.The result showed that Qu had a pair of quasi-reversible redox peak on 3DOM GTD/ITO modified electrode,and the transfer process of 2 electrons and 2 protons was an involved in the electrode reaction.There was a strong interaction between Qu and ctDNA immobilized on the modified electrode,and the binding constantKwas 3.61×106L/mol.The binding mode between Qu and ctDNA was an intercalation confirmed by CV,UV-Vis absorption spectra (UV-Vis),fluorescence spectra (FL) and circular dichroism spectra (CD) experiments .The sequence selectivity of binding between Qu and ctDNA was investigated,and the binding constants of Qu and poly (dG-dC) and poly (dA-dT) were calculated,respectively,according to the results of CV experiments.The binding constant ratioK(dG-dC )/K(dA-dT)was obtained to be 3.5,indicating that Qu bound to the GC region preferentially when Qu interacted with ctDNA.

three-dimensionally ordered macroporous (3DOM);gold-nanoparticle-doped titaniumdioxide (GTD);DNA modified electrode;quercetin (Qu);intercalation;sequence selectivity

2015-09-17；

2015-09-30

江蘇省常州四藥制藥有限公司合作項(xiàng)目(S11090BY1502)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.004

O657.1;Q523

A

1004-4957(2016)03-0277-08

*通訊作者：杜江燕，教授,研究方向：生物傳感器，Tel：025-85891767，E-mail：dujiangyan@njnu.edu.cn