楊星星，畢思遠(yuǎn)，朱 海，顧大勇

(1.廣東省深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳 518102；2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，廣東 深圳 518045 )

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滴滴涕單克隆抗體的制備及其評價(jià)

楊星星1，畢思遠(yuǎn)1，朱 海1，顧大勇2*

(1.廣東省深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東 深圳 518102；2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，廣東 深圳 518045 )

以滴滴涕(DDT)的特征部分為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)并合成了半抗原4-{4-[2,2,2-三氯-1-(4-氯-苯基)-乙基]-苯基}-丁酸(DDT-H1)、4-[4-(2,2,2-三氯-1-對甲苯基-乙基)-苯基]-丁酸(DDT-H2)，并采用活潑酯法制備免疫原 DDT-H1-BSA，以及混合酸酐法制備包被原DDT-H1-OVA、DDT-H2-OVA；用DDT-H1-BSA對小鼠進(jìn)行免疫，通過細(xì)胞融合、篩選、克隆等步驟得到1株能穩(wěn)定分泌DDT農(nóng)藥抗體的單克隆細(xì)胞株。細(xì)胞株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，注射小鼠體內(nèi)產(chǎn)生腹水，并將其用辛酸-硫酸銨和protein A柱子純化出單克隆抗體。其分泌的單克隆抗體免疫球蛋白亞類為IgG1，單抗腹水的效價(jià)為1.68×105，親和力Ka為5.238×1011L·mol-1，與其它幾種代謝物有一定的交叉反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，利用獲得的單抗研究建立DDT的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附檢測法(icELISA)。結(jié)果表明，所建立的間接競爭 ELISA 方法的線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為 6.6～521.8 ng/mL，可用于檢測農(nóng)副產(chǎn)品、環(huán)境中殘留的DDT及其代謝物。

滴滴涕；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫檢測；代謝物

有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕(DDT)作為廣譜殺蟲劑從20世紀(jì)50年代開始在全世界范圍內(nèi)廣泛使用。這一類含氯原子的有機(jī)合成殺蟲劑，具有極高的脂溶性和穩(wěn)定性，可在生物體內(nèi)富集很高的濃度，且在環(huán)境中降解緩慢,其活性成分為p,p′-DDT，屬持久性有機(jī)污染物(POPs)[1-2]。DDT在沉積物中的兩種主要分解物為2，2-雙(4-氯苯基)-1，1-二氯乙烯(DDE)和2，2-雙(4-氯苯基)-1，1-二氯乙烷(DDD)，而DDD 本身也用作殺蟲劑。DDT在動(dòng)物組織內(nèi)可以緩慢降解為2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)，但是DDA本身并不在體內(nèi)積累，而是作為人或動(dòng)物與DDT暴露接觸的指標(biāo)[3]。由于這些代謝物具有較高的親脂性和生物富集作用，易在動(dòng)物脂肪中積累，造成長期毒性[4-6]。此外，DDT還具有潛在的基因毒性、內(nèi)分泌干擾作用和致癌性，可能造成包括糖尿病在內(nèi)的多種疾病[7-10]。盡管從2004年起，DDT已被列為違禁化學(xué)物，但目前仍有25個(gè)國家將其作為控制瘧疾的藥物繼續(xù)使用，其對生態(tài)環(huán)境和人體健康存在的風(fēng)險(xiǎn)使人們對DDT及其代謝物的殘留劑量和分布日益關(guān)注。

目前國內(nèi)外對DDT及其代謝物殘留的檢測主要依靠儀器分析方法[11-14]，其樣品前處理復(fù)雜，所需儀器昂貴，不適于大量樣品的分析檢測。免疫分析方法因操作簡便、快捷、靈敏度高、通量高，已成為食品安全快速篩選檢測的主要方法之一。而國內(nèi)目前只有針對DDT代謝物DDA的免疫檢測方法[15-16],該方法以DDA作為半抗原，通過碳二亞胺法與載體蛋白偶聯(lián)制備抗原，其制備的抗體只能檢測DDA，不能檢測DDT及其它種類的代謝物。本研究嘗試制備可用于檢測DDT及其多個(gè)代謝物的高靈敏度的“寬譜”單克隆抗體，在文獻(xiàn)方法[17]的基礎(chǔ)上對半抗原的結(jié)構(gòu)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，并在抗體篩選過程中對包被抗原進(jìn)行適當(dāng)挑選，研發(fā)出可用于快速檢測DDT及其關(guān)鍵有害代謝物的檢測試劑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、TLC薄層層析板(GF254)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過氧化物酶(HRP)、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)均為 Sigma 產(chǎn)品，農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer GmbH，德國)，其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c小鼠，雌性，7～8周齡，體重20～22 g；普通級雌性昆明鼠(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0(深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.1.3 儀 器 倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Multiskan MK3酶標(biāo)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；酶標(biāo)板自動(dòng)洗滌機(jī)(美國Bio-tech公司)；API 3000液質(zhì)聯(lián)用儀(美國AB公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 半抗原的合成 稱取3.28 g水合氯醛、2 mL氯苯(或者2 mL甲苯)和1.6 g 4-苯基丁酸，置于圓底燒瓶中，水浴加熱攪拌直至所有晶體溶解，將圓底燒瓶置于冰浴下，緩慢加入7 mL 96%的濃硫酸，0 ℃下磁力攪拌，1.5 h后將混合物倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，蒸干有機(jī)溶劑后用硅膠柱純化得到終產(chǎn)物DDT-H1(X=Cl)、DDT-H2(X=CH3)，具體合成路線如圖1所示。

圖1 DDT半抗原的合成路線Fig.1 The synthesis scheme of DDT hapten

1.2.2 免疫原與包被原的制備 活潑酯法制備免疫原DDT-H1-BSA：將16.05 mg半抗原DDT-H1(50 mmol)、6.8 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，50 mmol)和12.15 mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，50 mmol)溶于1 mL無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫下攪拌反應(yīng)18 h，反應(yīng)液于4 000 r/min離心5 min，吸取上清活化液。再稱量120 mg BSA溶于8 mL碳酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 9.6)中，緩慢分次滴加400 μL活化液，室溫下攪拌反應(yīng)3 h，再將黃色反應(yīng)液裝入透析袋，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)透析，每4 h換液1次，換液7～8次，透析后于4 000 r/min離心5 min，上清液于-20 ℃保存。

混合酸酐法制備包被抗原DDT-H1-OVA和DDT-H2-OVA：稱取5.4 mg半抗原DDT-H1(或DDT-H2)約18 mmol溶于200 μL無水DMF中，按順序依次加入4.27 μL(約18 mmol)三正丁胺和2.34 μL(約18 mmol)氯甲酸異丁酯，室溫下攪拌反應(yīng)1 h。將30 mg OVA 溶于2 mL碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌下緩慢滴加100 μL上一步反應(yīng)液，室溫下攪拌反應(yīng)3 h后，透析、離心，于-20 ℃保存。

1.2.3 免疫方案 取7～8周齡Balb/c雌性小鼠，將制備的免疫抗原與弗氏完全佐劑等量混合，完全乳化后，腹部皮下注射，劑量為含DDT-H1-BSA 100 μg，以后每隔3周以同劑量取人工抗原與弗氏不完全佐劑混合乳化后皮下多點(diǎn)注射，免疫4次后測定其效價(jià)和抑制率，選取效價(jià)和抑制率較高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，融合前3 d加倍劑量強(qiáng)化免疫1次。

1.2.4 抗血清效價(jià)的測定 利用間接ELISA測定，以不同濃度的DDT-H1-OVA和DDT-H2-OVA分別包被酶標(biāo)板，小鼠抗血清倍比稀釋。采用方陣滴定法優(yōu)化包被抗原濃度和抗血清工作濃度，選擇吸光值A(chǔ)450 nm約為1.0時(shí)的抗原濃度和抗體稀釋度作為工作濃度，采用間接競爭ELISA檢測血清的抑制效果。效價(jià)高、抑制效果好的小鼠加強(qiáng)免疫，用于細(xì)胞融合。

1.2.5 細(xì)胞融合及單克隆抗體制備 將小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞以5∶1的比例混合，在50%PEG下融合，洗滌、離心后以HAT培養(yǎng)基懸浮，接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，在37 ℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.6 雜交瘤細(xì)胞篩選及亞克隆 融合后6～9 d用HT培養(yǎng)液半量換液1次，在12～14 d后根據(jù)增殖情況改用完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁至占板孔1/3時(shí)，取上清液，采用間接ELISA和間接競爭ELISA法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞篩選，對陽性并有競爭抑制反應(yīng)的微孔進(jìn)行顯微克隆和有限稀釋(亞克隆)。如此反復(fù)克隆2～5次，待所克隆的所有孔上清液中抗體陽性率為100%時(shí)，挑取單克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，建株。

1.2.7 腹水制備及抗體亞型鑒定 提前1周注射0.5 mL液體石蠟至Balb/c小鼠腹腔。將細(xì)胞(每只小鼠1 mL，含約(1～2)×108個(gè)細(xì)胞)腹腔注射小鼠腹部10～15 d，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)采集腹水。ELISA法測定其效價(jià)，間接ELISA法鑒定單克隆抗體的免疫球蛋白類型和亞類。

1.2.8 抗體純化 采用飽和硫酸銨沉淀法除去雜蛋白，再經(jīng)過Protein A柱子純化出IgG，并采用考馬斯亮藍(lán)G250法檢測蛋白濃度。

圖2 DDT半抗原DDT-H1的質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectrum of DDT-H1 hapten

圖3 DDT半抗原DDT-H2的質(zhì)譜圖Fig.3 MS spectrum of DDT-H2 hapten

1.2.9 單克隆抗體的親和常數(shù)(Ka)測定 以1 μg/mL DDT-H2-OVA包被，間接ELISA法測定不同濃度的抗DDT單克隆抗體與包被抗原反應(yīng)的A450 nm，以單克隆抗體濃度為橫坐標(biāo)，A450 nm值為縱坐標(biāo)，繪制反應(yīng)曲線，并在曲線上找到趨于平坦段A450 nm值的50%所對應(yīng)的單克隆抗體濃度，以其倒數(shù)作為親和常數(shù)Ka。

1.2.10 單克隆抗體間競爭ELISA方法的建立 用棋盤滴定確定最佳包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)，采用常規(guī)ELISA操作步驟，建立穩(wěn)定靈敏的ELISA間接競爭方法。四參數(shù)擬合曲線，計(jì)算IC50，定量檢測范圍并確定檢出限。

2 結(jié)果與討論

2.1 半抗原的鑒定

上述合成的目標(biāo)物DDT-H1、DDT-H2經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)測定，結(jié)果如圖2～3所示。從圖2可知，DDT-H1的分子離子峰為m/z406.6[M+H]+，且該峰旁有一系列同位素峰m/z411.6和m/z412.7等；從圖3可知，DDT-H2的分子離子峰為m/z383.1[M-H]-，且該峰旁有一系列同位素峰m/z382.3和387.2等。這些峰均與該化合物的分子量相符。

2.2 人工抗原的鑒定

在波長200～350 nm區(qū)間，對各人工抗原的紫外吸收光譜進(jìn)行測定，以鑒定半抗原與載體蛋白(BSA或OVA)是否偶聯(lián)成功[18]。圖4A中DDT-H1-BSA的波峰偏移至245～246 nm，波谷偏移至241 nm，OD值均明顯增大；DDT-H1-OVA的波峰波谷均消失，OD變化不大。圖4B中DDT-H2-OVA的波谷稍偏移至254～256 nm，OD值變化不大。以上結(jié)果說明3種人工抗原均已成功合成。

Fig.4 UV spectra of DDT-H1-BSA/OVA(A)and DDT-H2-OVA(B)

2.3 抗血清效果分析

血清中抗體的效價(jià)越高，說明有效抗體濃度越高，即小鼠的脾臟中激活的 B淋巴細(xì)胞越多，越有利于細(xì)胞融合。分別用濃度為1 μg/mL的DDT-H1-OVA和 DDT-H2-OVA于4 ℃過夜包板，測試抗血清的競爭變化，兩者的包被濃度皆由棋盤滴定法初步確定，其中小鼠C免疫產(chǎn)生的血清效價(jià)最高。采用濃度分別為0，200 ng/mL的DDT-H1-OVA和 DDT-H2-OVA作為抑制藥物，對不同小鼠的血清進(jìn)行間接競爭ELISA檢測，結(jié)果以A450 nm值表示。抑制情況如表1所示，3只小鼠中，當(dāng)以DDT-H2-OVA作為篩選的包被原，添加200 ng/mL藥物時(shí)，小鼠B血清的抑制率高達(dá)70.5%，因此選擇小鼠B進(jìn)行細(xì)胞融合。

表1 不同包被原對DDT的抗血清抑制效果

Table 1 Inhibitory effects of DDT antiserum by using different coating antigens

RatserumDilutionratioDDT-H1-OVADDT-H2-OVA0ng/mL200ng/mLInbibition/%0ng/mL200ng/mLInbibition/%A30001152080130510210531480B45001130064642810850320705C55000958079317212160624487

圖5 抗體親和力的測定Fig.5 Determination of affinity of antibody

2.4 單克隆抗體亞類的鑒定與腹水效價(jià)測定

經(jīng)過細(xì)胞融合、篩選、克隆得到1株穩(wěn)定分泌抗DDT抗體的雜交瘤細(xì)胞3C5。以1 μg/mL的DDT-H2-OVA包被酶標(biāo)板，采用icELISA方法檢測其腹水抗體亞型。檢測結(jié)果抗體亞型為IgG1，用icELISA得到腹水的效價(jià)為1.68×105。

2.5 單克隆抗體的親和常數(shù)測定

以1 μg/mL的DDT-H2-OVA包被酶標(biāo)板，icELISA法測定單克隆抗體的親和力，結(jié)果如圖5所示，取趨于平坦段即A450 nm為2.4的50%所對應(yīng)的單克隆抗體濃度，以其倒數(shù)作為親和常數(shù)(Ka)，所獲單克隆抗體的Ka為5.238×1011L·mol-1。

圖6 DDT的 icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 icELISA standard curve of DDT

2.6 抗體靈敏度的測定

采用Originlab 7.5的四參數(shù)擬合模塊對間接競爭ELISA反應(yīng)曲線進(jìn)行S擬合，如圖6所示，計(jì)算曲線IC50值為61.1 ng/mL，其線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為6.6～521.8 ng/mL。

2.7 抗體特異性的測定

通過表2 的交叉反應(yīng)率可以看出，該抗體具有較寬的特異性，對p,p′-DDD的交叉反應(yīng)率高于100%，對o,p′-DDT、p,p′-DDE、o,p′-DDE、o,p′-DDD 4個(gè)藥物的交叉反應(yīng)率在10%～100%之間，而對三氯殺螨醇(Dicofol)的交叉反應(yīng)率則低于10%。說明氯苯基三氯乙烷部分是其重要的決定簇，直接影響抗體的特異性；三氯殺螨醇則由于在此部分多了1個(gè)羥基而導(dǎo)致其與抗體的結(jié)合能力大大減弱；此外，另1個(gè)苯環(huán)上氯的相對位置也決定了交叉反應(yīng)率，其中對位的交叉反應(yīng)率最高，鄰位較低，可能是鄰位結(jié)構(gòu)的藥物的空間位阻較大不能深入抗體的口袋腔中導(dǎo)致不能與之緊密結(jié)合。

表2 單克隆抗體與p,p′-DDT類似物的交叉反應(yīng)率

Table 2 Cross reactivity of polyclonal antibody with analogous compound ofp，p′-DDT

CompoundStructureIC50(μg/L)CR(%)p，p′?DDT611100o，p′?DDT1465417p，p′?DDE801763o，p′?DDE2212276p，p′?DDD4561340o，p′?DDD1389440Dicofol>6000<001

3 結(jié) 論

本文篩選出一株細(xì)胞株3C5，采用icELISA方法檢測其腹水抗體亞型為IgG1，腹水的效價(jià)為1.68×105，單克隆抗體的Ka為5.238×1011L·mol-1。該抗體對p,p′-DDT 的 IC50為61.1 μg/L，檢測的線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為6.6～521.8 ng/mL，與其它幾種代謝物有一定的交叉反應(yīng)率。實(shí)驗(yàn)制備的單抗完全滿足檢測要求，為研制快速檢測DDT的其它免疫檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

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Preparation and Evaluation of DDT Monoclonal Antibody

YANG Xing-xing1,BI Si-yuan1,ZHU Hai1,GU Da-yong2*

(1.Shenzhen Bioeasy Biotechnologies Co.Ltd.，Shenzhen 518102，China；2.Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine，Shenzhen 518045，China)

The haptens 4-{4-[2,2,2-trichloro-1-(4-chloro-phenyl)-ethyl]-phenyl}-butyric acid(DDT-H1)，4-[4-(2,2,2-trichloro-1-p-tolyl-ethyl)-phenyl]-butyric acid(DDT-H2) were designed and synthesized on the basis of characteristics part of DDT,and artificial antigens DDT-H1-BSA(immmue antigen),and DDT-H1-OVA.DDT-H2-OVA(coating antigens)were prepared by coupling with the carrier proteins using active ester method and mixture anhydrides method,respectively.The monoclonal antibody(MAb)against DDT was produced by immunity DDT-H1-BSA,cell fusion,screening,cloning.The MAb was prepared from ascetic fluids of Balb/c,which was purified with saturated ammonium sulfate followed by affinity chromatography on protein A.The monoclonal antibody characterized by IgG1 isotype showed a high cross-reactivity to some metabolites.The enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)titer of ascites was 1.68×105,and the affinity of antibody(Ka)was 5.238×1011L·mol-1.An indirect competitive ELISA was founded base on the monoclonal antibody.The results of indirect competitive ELISA showed that the linear range of the calibration curves ranged from 6.6 ng/mL to 521.8 ng/mL.The method could be applied in the detection of DDT and its metabolites in agriculture products and environment.

dichlorodiphenyltrichloroethane(DDT);monoclonal antibody;ELISA;metabolites

2015-07-27；

2015-09-15

深圳市科技研發(fā)資金項(xiàng)目(CXZZ20130322112111131)；深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金(GCZX20140509163151273)；廣東省特支計(jì)劃-科技創(chuàng)業(yè)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目(2014TY01R099)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.003

O766.1;R392.11

A

1004-4957(2016)03-0271-06

*通訊作者：顧大勇，博士，研究員，研究方向：生物芯片、生物傳感器技術(shù)，Tel：0755-83391344，E-mail:wanhood@163.com