王媛，王稚英，王明

（錦州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院口腔科，遼寧 錦州 121000）

同種異體牙源性骨移植材料修復兔顱骨缺損的實驗研究

王媛，王稚英，王明

（錦州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院口腔科，遼寧 錦州 121000）

目的通過組織學檢測評估兔同種異體牙源性骨移植材料的成骨作用，為口腔種植區(qū)骨量不足的修復提供質優(yōu)價廉的修復材料。方法將兔同種異體離體牙制備成骨移植材料。選用成年健康日本長耳兔28只，建立顱骨缺損模型（3個直徑為8 mm的洞形缺損），植入同種異體牙源性骨移植材料作為實驗組、人工骨修復材料作為對照組、空白對照組不植入任何材料。取標本前3 d、7 d向兔腹腔注射四環(huán)素，分別于術后4、8、12周取標本，進行大體觀察、X線檢查、制備硬組織切片及HE染色。結果術后4、8和12周的組織形態(tài)學分析表明，實驗組和對照組的新骨生成量呈遞增趨勢，且實驗組優(yōu)于對照組，骨小梁結構更為飽滿；空白對照組骨小梁結構稀少且變化不明顯。結論同種異體牙源性骨移植材料能夠很好地促進骨缺損的修復，且成骨效果優(yōu)于一些人工骨修復材料。

顱骨缺損；同種異體牙源性骨移植材料；人工骨修復材料；成骨作用

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在口腔種植手術中通常會面臨牙體長期缺失或牙周炎而造成骨量不足的情況。自體骨移植雖是缺損區(qū)成骨的“金標準”［1-2］，但因供骨區(qū)術后出現疼痛、出血、疤痕等并發(fā)癥，患者難以接受。為了解決這一問題，對骨移植材料的研究和應用一直是學者們追蹤的熱點。理想的骨移植材料應該具備良好的骨誘導性、骨傳導性并能促進新骨的生成和重建［3-4］。牙體組織的主要成份為磷灰石晶體、少量蛋白和膠原等有機物，其中，牙釉質中羥基磷灰石含量高達90%以上，較骨組織高。已有韓國口腔種植醫(yī)生利用牙齒這一特性制備的自體牙骨移植材料應用臨床，但國內尚未見類似報道和臨床學術交流。本研究擬用同種異體牙制備骨移植材料進行動物實驗并探討其成骨作用，為以后的臨床廣泛應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物、材料和儀器

健康成年日本大耳白兔28只，體質量2.5～3.0 kg（遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供）；兔離體前牙20個；牙科高速手機；離體牙制骨移植材料加工設備（韓國VacuaSonic LLK?3）；硬組織磨片機（德國EXAKT 400CS）；硬組織切片機（德國EXAKT 300CP）；顯微鏡（Nikon ECLIPSS 38i）；人工骨修復材料（北京奧精醫(yī)藥科技有限公司）；水合氯醛（遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供）；鹽酸四環(huán)素（成都中牧生物藥業(yè)有限公司）。

1.2方法

1.2.1制備同種異體牙源性骨移植材料：用牙科高速手機將收集的兔離體牙去除牙石、齲壞組織，并用根管銼去凈牙髓后，將其制備成大小2種組織顆粒，大顆粒約0.5～1 mm，小顆粒＜0.5 mm。按照韓國VacuaSonic加工設備的說明書進行操作制備成同種異體牙源性骨移植材料封存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實驗動物分組、骨缺損模型的建立及材料植入：28只日本長耳兔按術后飼養(yǎng)時間不同隨機分成3組，A組4周、B組8周、C組12周。在每只兔的顱骨中縫兩側區(qū)域分別鉆取3個直徑為8 mm的洞形缺損，并保持腦膜完整，3個缺損區(qū)分別植入同種異體牙源性骨移植材料作為實驗組、人工骨修復材料作為對照組、空白對照組不充填任何材料。術后肌肉注射青霉素（20萬U/只）預防感染，并于取材前3 d和7 d腹腔注射四環(huán)素（30 mg/kg濃度不超過25 mg/L）做熒光標記。

1.2.3標本制備及觀察方法：術后觀察實驗動物飲食、日?；顒幽芰靶g區(qū)傷口愈合情況。實驗動物處死后取材拍攝X線片。于術后4、8、12周分別處死實驗動物，切取顱骨按實驗區(qū)分別制成1.0 cm× 1.0 cm組織塊固定以備用。將各組織塊制備成硬組織切片并進行蘇木精-伊紅（hematoxylin?eosin，HE）染色于光鏡下觀察和熒光顯微鏡下觀察。然后每個切片任取5個觀察視野進行拍照，用Image?Pro?Plus 6.0圖像分析軟件測量圖像中新生骨所占面積百分比，每張切片取5組數值的均數作為測量數值。

1.3統(tǒng)計學分析

在統(tǒng)計軟件SPSS 19.0中進行配伍組方差分析和組間兩兩比較，數據以表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1標本的大體觀察

術后分別于4、8和12周制取標本，各組標本未見植入材料的移位、脫落等。B組與C組標本中實驗組和對照組有骨樣組織隆起，用探針探及時其質地與宿主骨組織相似；A組標本中部分實驗組表面可見牙體組織顆粒，質地堅硬；空白對照組均呈凹陷狀，見圖1。

圖1　術后12周時的大體標本觀察結果Fig.1　Observation of the specimen after 12 weeks

2.2X線檢查結果

4周時，實驗組和對照組的骨缺損區(qū)均可見材料的阻射影像，但密度不均，與周圍正常骨組織界限清晰?？瞻讓φ战M低密度影像明顯。8周時，實驗組和對照組骨缺損區(qū)的阻射影像區(qū)域較4周時增大。密度均與正常骨組織相近，界限不清。12周時，實驗組和對照組骨缺損區(qū)的阻射影像密度較均勻，可見骨小梁結構，部分界限消失與周圍骨組織融合?？瞻讓φ战M缺損邊緣可見區(qū)域性密度增高影像，但中心部密度仍較低。

2.3組織形態(tài)學結果

4周時，實驗組和對照組中可見少量骨小梁結構，其周圍由淡粉色的類骨質不連續(xù)性包繞，成骨細胞排列在類骨質表面呈圓形或橢圓形。實驗組中似未吸收材料與骨組織緊密結合共同形成網狀支架結構，在材料與骨組織交界處，骨基質將成骨細胞包埋其中。熒光顯微鏡下觀察，2組骨組織表面可見綠色熒光帶狀新生類骨質，標記線清晰，但雙標記間距較窄，提示新骨形成速度較慢。8周時，實驗組和對照組中骨小梁結構增多。實驗組中粉染類骨質明顯多于對照組。熒光顯微鏡下，實驗組綠色熒光帶較對照組寬，其間距不明顯。12周時，實驗組和對照組出現大量新生骨小梁，骨小梁之間骨髓腔隙變窄，邊緣可見成骨細胞被自身分泌的基質包埋。實驗組似未吸收材料與骨小梁共同形成的網狀支架結構廣泛而密集。熒光顯微鏡下觀察2組綠色熒光帶清晰，但雙標記間距仍不明顯或融合在一起，見圖2、3。

圖2　術后12周3組的觀察結果 HE×10Fig.2　Observation results of three groups after 12 weeks HE×10

圖3　術后12周3組在熒光顯微鏡下觀察結果 ×10Fig.3　Results of three groups under a fluorescence microscope after 12 weeks×10

組織形態(tài)學分析測量結果表明，術后4、8和12周的實驗組新生骨面積百分比呈遞增趨勢，且各時間點中實驗組優(yōu)于對照組；空白對照組無明顯變化，見表1。統(tǒng)計分析結果表明，各時間點實驗組和對照組的新生骨量均明顯多于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；實驗組新生骨量優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1　不同時間各組新骨生成百分比（x±s，n=9）Tab.1　New bone quantity in each group at each time point（x± s，n=9）

3　討論

治療頜骨骨組織缺損和牙種植區(qū)骨量不足的最好方法是自體骨移植［2］，但是由于自體骨移植存在一定的缺陷，如供骨區(qū)的再次損傷、供區(qū)的受限、手術時間的延長和術后疼痛等問題，在臨床上自體骨移植受到限制。目前人工合成的骨替代材料是臨床常用的移植材料，其在口腔種植骨量不足的修復中取得了良好的效果，但是由于價格昂貴，給中低層收入的患者帶來不便，限制了口腔種植義齒修復的開展。牙源性骨移植材料是1種新型的移植材料，異體牙齒作為移植材料的優(yōu)點是來源廣泛，并且其無機成分多、有機成分少。常用的異種骨去抗原處理方法有深低溫冷凍、反復凍融、煅燒、交聯、脫蛋白、輻照或多種方法聯合運用［5］。許慧芬等［6］通過實驗研究發(fā)現應用物理聯合化學方法制備的異種骨移植材料具有良好的生物相容性。但是高溫煅燒又使材料的力學強度和溶解性降低，同時還會影響新生骨組織細胞的長入［7?8］。韓國Cosmobio?medicare公司研發(fā)了應用復合酸、氯仿、H2O2結合超聲震蕩的牙源性骨移植材料加工設備，目前已將自體牙加工的材料應用于臨床，并取得了很好的臨床效果。

本研究考慮到臨床工作中往往因為自體牙的丟失或骨缺損較大而使原材料使用受限，而異體牙來源廣泛，因而本研究應用兔的同種異體牙進行實驗。兔的同種異體牙源性骨替代材料植入后組織愈合良好，無明顯排斥反應。在各時期的大體觀察結果中，4周時實驗組的表面可見白色牙體組織顆粒鑲嵌其中，8周和12周時的實驗組中牙體組織顆粒不明顯或被骨組織包埋。在12周時的硬組織切片觀察中實驗組的骨小梁結構明顯多于8周和4周，且同期的各組間比較，實驗組優(yōu)于對照組，空白對照組均無明顯變化。本研究還可發(fā)現在各時期實驗組中，似未吸收的牙體組織結構未見減少或變化不明顯，均勻而廣泛地與骨組織緊密結合，期間不存在纖維組織也未見炎癥細胞。熒光顯微鏡下觀察，各時期的實驗組中綠色熒光帶較對照組多，表明實驗組的成骨活動廣泛存在。以上結果表明牙源性骨替代材料可作為一種支架結構有效促進骨缺損的修復愈合。

本研究結果表明，同種異體牙源性骨移植材料無明顯排斥反應，且具有良好的成骨作用，其新骨生成質量和速度較一些臨床常見的人工骨修復材料好。因此，同種異體牙源性骨移植材料具有很好臨床應用前景。

［1］SHIBUYA N，JUPITER DC.Bone graft substitute：allograft and xe?nograft［J］.Clin Podiatr Med Surg，2015，32（1）：21-34.DOI：10.1016/j.cpm.2014.09.011.

［2］JAMES R，DENG M，LAURENCIN CT，et al.Nanocomposites and bone regeneration［J］.Front Mater Sci，2011，5（4）：342-357.

［3］TOMS AD，BARKER RL，JONES RS，et al.Impaction bone?grafting in revision joint replacement surgery［J］.J Bone Joint Surg Am，2004，86（9）：2050-2060.

［4］FINKEMEIER CG.Bone?grafting and bone?graft substitutes［J］.J Bone Joint Surg Am，2002，84（3）：454-464.

［5］陳學英，李寶興，李靖，等.異種骨移植材料制備及其骨誘導活性實驗研究［J］.中國修復重建外科雜志，2009，23（3）：362-365.

［6］許慧芬，何慧宇，唐小雪，等.不同方法制備異種骨支架材料的生物相容性評價［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（47）：8749-8752.

［7］JAHN K，BRAUNSTEIN V，FURLONG PI，et al.A rapid method for the generation of uniform acellular bone explants：a technical note［J］.J Orthop Surg Res，2010，5（1）：32.DOI：10.1186/1749?799X?5?32.

［8］HASHIZUME H，TAMAKI T，OURA H，et al.Changes in the extra?cellular matrix on the surface of sintered bovine bone implanted in the femur of a rabbit：an immunohistochemical study［J］.J Orthop Sci，1998，3（1）：42-53.

（編輯于溪）

Experimental Study of the Repair of Rabbit Skull Defects with Allogeneic Tooth Derived Bone Graft Material

WANG Yuan，WANG Zhiying，WANG Ming
（Department of Stomatology，The Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China）

ObjectiveTo evaluate the osteogenesis of rabbit allogeneic tooth derived bone graft material by histological detection，so as to provide quality and cheap repair materials for the repair of bone defects in dental implants.MethodsThe bone graft materials were prepared using rab?bits allogeneic extracted teeth.A total of 28 adult Japanese healthy rabbits were selected to establish the cranial defect model with three 8 mm diam?eter holes.The allogenic tooth derived bone graft material were implanted into the experimental group.The artificial bone repair material was used as the control group，and the control group did not receive any implantion.Tetracycline labeling was performed after operation，the specimens were taken at 4，8 and 12 weeks after operation，and then the gross observation，X?ray examination，preparation of hard tissue sections，and HE staining were carried out.ResultsHistological analysis at 4，8 and 12 weeks after operation showed that there was an increasing trend the new bone for?mation in both experimental group and the control group，and the experimental group was better；the trabecular bone structure of the blank group was scarce and the change was not obvious.ConclusionAllogenic tooth derived bone graft materials can promote the repair of bone defect，and the effect is better than that of artificial bone repair materials.

skull defect；allogenic tooth derived bone graft materials；artificial bone repair materials；osteogenesis

R782

A

0258-4646（2016）12-1082-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.12.006

遼寧省省直醫(yī)院改革重點臨床科室診療能力建設項目（LNCCC?C10?2015）

王媛（1988-），女，碩士研究生.

王稚英，E-mail：wzyfsey@126.com

2016-03-03

網絡出版時間：