關(guān)陽(yáng)陽(yáng)，肖明揚(yáng)，潘亮，3，薛萍，張國(guó)培，逯曉波

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；2.本溪鋼鐵（集團(tuán)）有限責(zé)任公司職業(yè)病防治所，遼寧 本溪 117021；3.沈陽(yáng)市第九人民醫(yī)院職業(yè)病科，沈陽(yáng) 110024）

應(yīng)用轉(zhuǎn)染細(xì)胞研究ERCC2/XPD基因多態(tài)與短波紫外線所致DNA損傷修復(fù)的關(guān)聯(lián)

關(guān)陽(yáng)陽(yáng)1，2，肖明揚(yáng)1，潘亮1，3，薛萍1，張國(guó)培1，逯曉波1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；2.本溪鋼鐵（集團(tuán)）有限責(zé)任公司職業(yè)病防治所，遼寧 本溪 117021；3.沈陽(yáng)市第九人民醫(yī)院職業(yè)病科，沈陽(yáng) 110024）

目的探討ERCC2/XPD基因多態(tài)與短波紫外線（UVC）所致細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)的關(guān)聯(lián)。方法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)ERCC2/XPDrs13181 AA（Lys751）和ERCC2/XPDrs13181 CC（Gln751）2種基因型的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞缺陷型UV5，獲得穩(wěn)定表達(dá)ERCC2轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。應(yīng)用MTT法比較2種不同基因型轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)不同照射強(qiáng)度UVC處理后細(xì)胞抑制率的差別；應(yīng)用改良彗星試驗(yàn)檢測(cè)各轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)UVC處理后1、3、6、24 h DNA損傷修復(fù)能力的差異。結(jié)果與UV5ERCC2（AA）相比，突變型細(xì)胞UV5ERCC2（CC）對(duì)UVC所致DNA損傷更加敏感，細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。改良彗星試驗(yàn)結(jié)果顯示，UV5ERCC2（CC）細(xì)胞DNA損傷程度較UV5ERCC2（AA）嚴(yán)重，且修復(fù)UVC所致DNA損傷的能力降低，在20 J/m2UVC處理3、6 h時(shí)點(diǎn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論ERCC2/XPDrs13181多態(tài)C等位基因與UVC所致DNA損傷修復(fù)能力下降相關(guān)，提示ERCC2/XPDrs13181基因多態(tài)性可能在UVC所致DNA損傷修復(fù)中具有一定意義。

ERCC2/XPD；單核苷酸多態(tài)性；轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型；短波紫外線；核苷酸切除修復(fù)

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日光中的紫外線（ultraviolet，UV）依生物學(xué)作用差異可分為長(zhǎng)波紫外線（UVA，320～400 nm）、中波紫外線（UVB，280～320 nm）和短波紫外線（UVC，100～280 nm）。大氣臭氧層對(duì)UVC具有吸收作用，生活在地球表面的人類(lèi)主要受到UVA和少量UVB的照射，UVC常用于實(shí)驗(yàn)室消毒。

日光中的紫外輻射為皮膚癌高發(fā)的重要原因之一［1］。紫外線對(duì)DNA的損傷作用有直接損傷和間接損傷2種，包括鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)、單鏈斷裂和雙鏈斷裂等。研究［2］發(fā)現(xiàn)，UVC對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HacaT細(xì)胞）的DNA損傷較UVA和UVB明顯。UVB和UVC的能量可直接被DNA吸收，從而破壞DNA的分子結(jié)構(gòu)，也可因產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（reactive oxidative species，ROS）對(duì)DNA造成間接損傷［3］。對(duì)于紫外線所致的DNA損傷，細(xì)胞內(nèi)常見(jiàn)的修復(fù)系統(tǒng)是堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）和核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER），其中NER是修復(fù)UV所致DNA光損傷的主要途徑之一，至少30多種因子參與NER過(guò)程。

人類(lèi)著色性干皮病基因D（xeroderma pigmento?sum group D，XPD），又稱(chēng)核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)因子2（excision repair cross complementing group 2，ERCC2），位于q13.3，含23個(gè)外顯子，長(zhǎng)約54 300 bp。其編碼蛋白XPD是核NER途徑的一種重要因子，作為解旋酶在損傷部位打開(kāi)DNA雙鏈以利于后續(xù)修復(fù)，對(duì)于紫外線所致鏈間、鏈內(nèi)DNA交聯(lián)損傷具有修復(fù)功能［4］；此外，XPD還是組成Ⅱ型轉(zhuǎn)錄因子H（transcription factorⅡhuman，TFⅡH）復(fù)合物的重要因子，參與p53介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)和一些基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄過(guò)程［5］。

目前已發(fā)現(xiàn)ERCC2/XPD的編碼區(qū)存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中密碼子312、751發(fā)生變異最為常見(jiàn)，頻率約為42%。其多態(tài)性可以改變DNA損傷修復(fù)能力，與非小細(xì)胞肺癌、食管腺瘤、胃癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、膽道癌等多種腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)［6］。ERCC2/XPD多態(tài)性與紫外輻射的關(guān)聯(lián)研究目前甚少。本研究通過(guò)構(gòu)建ERCC2/XPDrs13181 AA（Lys751）和ERCC2/XPDrs13181 CC（Gln751）2種基因型的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞ERCC2/XPD缺失的突變型細(xì)胞UV5，獲得穩(wěn)定表達(dá)ERCC2/XPD不同基因型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用MTT細(xì)胞抑制率試驗(yàn)、改良彗星試驗(yàn)比較表達(dá)不同基因多態(tài)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞生存率及DNA修復(fù)損傷能力的差異，探討該多態(tài)在UVC所致的DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的功能意義。為ERCC2/XPDrs13181位點(diǎn)基因多態(tài)性與UVC之間可能存在基因—環(huán)境交互作用提供新的科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）AA8（CHO野生型）、UV5（CHO突變性，ERCC2表達(dá)缺失）購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）。

1.1.2主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、二甲基亞砜（DMSO）、G418（GiBCO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、5×SDS?PAGE、ArcyBis、TEMED、過(guò)硫酸銨、低熔點(diǎn)瓊脂糖、6?磷酸葡萄糖（美國(guó)Sigma公司），ERCC2/XPD一抗、β?actin一抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），RT?PCR試劑盒、RT?PCR引物（日本TaKaRa公司），基因探針設(shè)計(jì)（MGB公司）。

1.1.3主要儀器：CO2孵育箱（HF90，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），酶標(biāo)儀（DNM?9602G，北京普朗新技術(shù)有限公司），倒置顯微鏡（imt?413，日本Olympus公司），短波紫外燈光源［發(fā)射波長(zhǎng)為200～290 nm，峰值254 nm，輻射強(qiáng)度調(diào)整至2.5 J/m2，美國(guó)Spectronics（SP）公司SPXX?15N］，CF15D低溫高速離心機(jī)（日本Hitachi公司），GR?15S低溫超速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），Power PAC300普通瓊脂糖凝膠電泳儀（美國(guó)Bio?Rad公司），GDS800凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Gene公司），PCR儀（德國(guó)BIOMETRA公司），計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（日本Luzex?F公司），Nanodrop核酸定量分析儀（美國(guó)Thermo公司），熒光定量PCR儀及相應(yīng)分析軟件（上海Roche公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞AA8（野生型）、UV5（突變型，ERCC2/XPD表達(dá)缺失）用含10%FBS、10 IU/mL青霉素、10 IU/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，UV5ERCC2（AA）、UV5ERCC2（CC）、UV5GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞用含10%FBS，0.5～1 mg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基，置于37°C、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后，充分吹打成單細(xì)胞懸液后鋪板。待細(xì)胞貼壁24 h后，用不同強(qiáng)度UVC處理。

1.2.2ERCC2/XPD751位點(diǎn)不同基因型轉(zhuǎn)染細(xì)胞的建立：質(zhì)粒構(gòu)建、質(zhì)粒鑒定、細(xì)胞轉(zhuǎn)染具體內(nèi)容已在前期完成［7］，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ERCC2/XPD751位點(diǎn)不同基因型細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后待用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證檢驗(yàn)兩變量之間的因果關(guān)系，將變量進(jìn)行格蘭杰因果關(guān)系檢驗(yàn)。兩變量LGDP和LTTL存在協(xié)整關(guān)系，因此，滿足檢驗(yàn)的前提條件。檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

1.2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定：

1.2.3.1鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染細(xì)胞可在含0.5～1 mg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基選擇生長(zhǎng)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以熒光顯微鏡下是否可見(jiàn)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，確定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3.2Western blotting檢測(cè)ERCC2/XPD蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量并調(diào)整濃度。將樣品與5×loading buffer按體積比4∶1混勻后，于100℃加熱變性5 min，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取蛋白上樣行SDS?PAGE電泳。轉(zhuǎn)PVDF膜后，于5%脫脂奶粉/0.1%TBST中封閉過(guò)夜。ERCC2/XPD一抗?jié)舛葹?/1 000，β?actin一抗?jié)舛葹?/1 000。室溫?fù)u床孵育2 h。用TBST洗膜30 min，5 min/次。二抗?jié)舛葹?/8 000。室溫?fù)u床孵育1 h。用TBST洗膜30 min，5 min/次。HRP?ECL法發(fā)光顯像。用Image J軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定，用ERCC2/XPD與β?actin的灰度值之比作為ERCC2/ XPD表達(dá)的相對(duì)含量。

1.2.3.3TaqMan?real?time PCR法檢測(cè)ERCC2/ XPD751位點(diǎn)SNPERCC2/XPDLys751Gln（rs13181）位點(diǎn)引物序列為：Forward5’?CAGGAGTCACCAGGA ACCGT?3’，Reverse 5’?CTCAGCCTGGAGCAGC?TAGAAT?3’；探針序列為A?allele?5’?FAM?ATCCTCTTCAGCGTCT?MGBNFQ?3’，C?allele?5’?VIC?TCCTCTGCAGCGTC?MGBNFQ?3’。反應(yīng)體系包括TaqMan Genotyping Master Mix 5 μL，10 μmol/L引物和探針各0.5 μL，l0 ng/μL基因組DNA 2 μL，超純水2.5 μL，總體系10 μL。反應(yīng)過(guò)程為95℃l0 min進(jìn)行Amplitaq酶的活化，92℃15 s變性，60℃1 min退火及延伸，共40個(gè)循環(huán)。用SDS軟件進(jìn)行分析。

1.2.4DNA損傷修復(fù)能力的檢測(cè)：

1.2.4.1細(xì)胞抑制率試驗(yàn)采用MTT比色法測(cè)定UVC對(duì)UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞懸液，在96孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種（5×103/孔）。待細(xì)胞貼壁24 h后，用UVC熒光燈照射（非實(shí)驗(yàn)組遮蓋1層錫箔紙，用以避光），照射劑量強(qiáng)度為0（對(duì)照組）、2.5、5、7.5、10、15、20、25、30、35 J/m2，每組設(shè)6個(gè)平行孔，照射后加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液200 μL，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h，每孔加5 mg/ mL MTT溶液20 μL，孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加DMSO 150 μL，37℃振蕩5 min。選擇490 nm波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值。以UV強(qiáng)度為橫軸，細(xì)胞存活率為縱軸，繪制曲線。根據(jù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4.2改良彗星試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，接種于6孔板（2×105/孔），待細(xì)胞貼壁24 h后，棄去原培養(yǎng)液。分別采用10、20 J/m2照射細(xì)胞，照射后繼續(xù)用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1、3、6、24 h，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，待用。在預(yù)備上膠的彗星試驗(yàn)專(zhuān)用載玻片中央滴加100 μL 1%NMA，迅速蓋上蓋玻片使凝膠均勻，于4℃避光放置10 min。滴加100 μL細(xì)胞與1%LMA的混合液（體積比為1∶3），4℃避光放置10 min。將凝膠浸泡在細(xì)胞裂解液中（100 mmol/L EDTA?Na2，2.5 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris?HCl，pH10.5，臨用前加入 1%TritonX?100和 10% DMSO），4℃避光裂解60 min。然后在電泳液（1 mmol/L EDTA?Na2，300 mmol/L NaOH，pH13）中進(jìn)行DNA解旋30 min。恒壓20 V電泳25 min后，用0.4 mol/L Tris?HCl漂洗。待凝膠干燥后用20 μg/mL EB染色，ddH2O沖洗。熒光顯微鏡下觀察拍照。用CASP軟件進(jìn)行圖像分析，每組觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算各彗星的Olive尾距，計(jì)算DNA損傷程度。根據(jù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1ERCC2/XPD在各轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的表達(dá)（圖1）

圖1　3種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的FITC熒光圖像 ×200Fig.1　FITC fluorescence images of three transfected cells×200

ERCC2/XPD rs13181 AA（Lys751）、rs13181 CC（Gln751）質(zhì)粒以及綠色熒光蛋白空質(zhì)粒分別同時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞突變型（UV5）。轉(zhuǎn)染細(xì)胞可在含0.5～1 mg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。5 d后，如圖1所示，熒光顯微鏡下可見(jiàn)3種表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5ERCC2（AA）、UV5ERCC2（CC）以及UV5GFP，確定轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到80%以上。

2.2Western blotting驗(yàn)證ERCC2/XPD在各細(xì)胞中的表達(dá)

Western blotting結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）均出現(xiàn)分子量為87 000的蛋白條帶，從而確定這2種轉(zhuǎn)染細(xì)胞均表達(dá)XPD蛋白，而UV5和UV5GFP未見(jiàn)特異性的蛋白條帶。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞ERCC2/XPDrs13181基因型的確定

圖2　Western blotting檢測(cè)ERCC2/XPD蛋白表達(dá)Fig.2　The expression of ERCC2/XPD protein detected by West?ern blotting

根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR曲線判斷基因型，如圖3所示，UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）細(xì)胞DNA鑒定證實(shí)ERCC2/XPD751位點(diǎn)基因多態(tài)性不同，分別為AA和CC。

2.4UVC對(duì)UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）細(xì)胞存活率的影響

圖3ERCC2/XPD 751位點(diǎn)多態(tài)不同基因型結(jié)果Fig.3　Detection of ERCC2/XPD coden 751 polymorphism

不同劑量的短波紫外線UVC照射UV5ERCC2（AA）、UV5ERCC2（CC）、UV5GFP細(xì)胞后，各轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活率的變化見(jiàn)表1和圖4。隨著UV強(qiáng)度的增加，各轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活率逐漸呈下降趨勢(shì)，具有劑量—反應(yīng)關(guān)系，且與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明不同劑量UV的照射對(duì)細(xì)胞存活率均具有抑制作用。不同照射劑量下，UV5ERCC2（AA）的細(xì)胞存活率均大于UV5ERCC2（CC），UV5GFP由于不表達(dá)XPD蛋白，細(xì)胞存活率最低。且在5、7.5、10、15、20、25 J/m2處理下，不同基因型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。野生型UV5ERCC2（AA）修復(fù)UVC損傷能力高于突變型UV5ERCC2（CC），提示ERCC2/ XPD751位點(diǎn)基因多態(tài)性與UVC照射引起的細(xì)胞毒性存在關(guān)聯(lián)。

2.5UVC所致UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）細(xì)胞的DNA損傷與修復(fù)

不同劑量UVC照射UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所致DNA損傷與修復(fù)情況見(jiàn)圖5和表2。10 J/m2UVC照射UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）細(xì)胞后，隨著繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞DNA損傷均不斷增加，于照射后6 h最為明顯，然而在照射后24 h DNA損傷均有所修復(fù)，但與野生型UV5ERCC2（AA）相比，突變型UV5ERCC2（CC）的修復(fù)幅度偏小，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。20 J/m2UV照射細(xì)胞后所引起的細(xì)胞DNA損傷更為明顯，在照射后3、6 h，兩細(xì)胞間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明ERCC2/ XPDLys751Gln位點(diǎn)在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中存在差異，但差異僅在UVC較大劑量作用下的個(gè)別時(shí)點(diǎn)存在。

表1　不同劑量UVC照射誘導(dǎo)的UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）細(xì)胞存活率（n=6）Tab.1　The cells viability induced by different doses of UVC irradiation in UV5ERCC2（AA）and UV5ERCC2（CC）（n=6）

圖4　不同劑量UVC照射下UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）、UV5GFP細(xì)胞存活率情況Fig.4　cells viability induced by UVC irradiation in UV5ERCC2（AA），UV5ERCC2（CC）and UV5GFP

3　討論

作為一種進(jìn)化保守的DNA解旋酶，ERCC2/XPD是NER途徑中的重要因子，在NER和堿基轉(zhuǎn)錄中具有一定作用，它通過(guò)在損傷部位打開(kāi)DNA雙鏈參與到NER中。ERCC2/XPD蛋白缺失可影響NER能力。人類(lèi)XPD基因突變可導(dǎo)致DNA修復(fù)缺陷性疾病，包括著色性干皮病、毛發(fā)營(yíng)養(yǎng)不良癥、Cockayne綜合征等。本研究組在前期工作中研究了ERCC2/ XPD基因缺失對(duì)UV誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERCC2/XPD蛋白缺失細(xì)胞對(duì)UV誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)能力有顯著下降［8］。ERCC2/XPD rs13181（Lys751Gln）是一種常見(jiàn)的基因多態(tài)，第751密碼子G/A多態(tài)導(dǎo)致氨基酸從Lys到Gln的替代，有研究［9］提示rs13181突變型與DNA損傷修復(fù)能力密切相關(guān)，攜帶XPD第751密碼子Gln/Gln表型的個(gè)體修復(fù)紫外線嘧啶二聚體的能力比Lys/Lys表型低50%。

本研究通過(guò)人類(lèi)PCR產(chǎn)物了構(gòu)建ERCC2/XPD rs13181AA（Lys751） 和 ERCC2/XPDrs13181CC（Gln751）2種基因型的質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染ERCC2/ XPD缺失的CHO突變型細(xì)胞UV5，獲得穩(wěn)定表達(dá)人類(lèi)ERCC2/XPD不同基因型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用MTT法比較了經(jīng)不同劑量UVC照射后UV5ERCC2（AA）、UV5ERCC2（CC）轉(zhuǎn)染細(xì)胞抑制率，發(fā)現(xiàn)UV5ERCC2（CC）細(xì)胞比UV5ERCC2（AA）對(duì)UVC所致?lián)p傷更為嚴(yán)重。說(shuō)明ER?CC2/XPDrs13181位點(diǎn)C等位基因會(huì)對(duì)UVC所致?lián)p傷更為敏感。而彗星試驗(yàn)是DNA損傷評(píng)價(jià)的較為經(jīng)典的試驗(yàn)，本研究選用了10 J/m2和20 J/m22個(gè)照射劑量，通過(guò)彗星試驗(yàn)連續(xù)觀察UVC照射后1、3、6、24 h各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)UVC照射后繼續(xù)培養(yǎng)3 h和6 h時(shí)UV5ERCC2（CC）細(xì)胞的損傷較UV5ERCC2（AA）細(xì)胞嚴(yán)重，而在繼續(xù)培養(yǎng)24 h后2種細(xì)胞雖均有修復(fù)，但UV5ERCC2（AA）細(xì)胞對(duì)損傷的修復(fù)程度比UV5ERCC2（CC）細(xì)胞更為明顯。提示ERCC2/ XPDrs13181基因多態(tài)在UVC所致DNA損傷修復(fù)中可能具有一定的意義，但研究結(jié)論尚待進(jìn)一步證實(shí)。

表2　不同強(qiáng)度UVC照射所致UV5ERCC2（AA）、UV5ERCC2（CC）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DNA損傷情況（n=100，x±s）Tab.2　UV5ERCC2（AA）and UV5ERCC2（CC）cells DNA damage and repair induced by UVC irradiation（n=100，x±s）

圖5　UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA損傷的單細(xì)胞凝膠電泳圖 ×200Fig.5　Single?cell gel electrophoresis of DNA damage in UV5ERCC2（AA）and UV5ERCC2（CC）×200

綜上所述，目前對(duì)于基因多態(tài)性的研究多集中于人群研究的相關(guān)分析上，但是對(duì)于多態(tài)功能的研究卻相對(duì)局限，本研究嘗試應(yīng)用體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型對(duì)ERCC2/XPDrs13181基因多態(tài)在UVC所致DNA損傷修復(fù)中的差異進(jìn)行分析，豐富了此類(lèi)研究的思路與方法。當(dāng)然，體外試驗(yàn)尚需與人群研究相互結(jié)合，才能為DNA修復(fù)基因多態(tài)能否作為腫瘤生物標(biāo)志提供更為有力的證據(jù)。

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（編輯王又冬）

Association between ERCC2/XPD Polymorphisms and UVC?induced DNA Damage Using Transfected Cells Model

GUAN Yangyang1，2，XIAO Mingyang1，PAN Liang1，3，XUE Ping1，ZHANG Guopei1，LU Xiaobo1
（1.Department of Toxicology，School of Public Health，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Dispensary of Occupational Disease，Benxi Steel Group Co.Ltd，Benxi 117021，China；3.Department of Occupational Diseases，The 9th People’s Hospital of Shenyang，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo explore the function ofERCC2/XPDpolymorphisms in the repair of DNA damage induced by UVC.MethodsPlas?mids stably expressingERCC2/XPDrs13181 AA（Lys751）andERCC2/XPDrs13181 CC（Gln751）were transfected into Chinese hamster ovary cells，and the stable ERCC2 transfected cell lines were obtained.MTT assay was used to compare the inhibitory rates of the transfected cells treated with UVC at different irradiation intensity.The DNA damage repair ability of the transfected cells treated with UVC for 1，3，6 and 24 h was detected by modified comet assay.ResultsCompared with UV5ERCC2（CC），UV5ERCC2（CC）was more sensitive to UVC with decreased cell viability. DNA damage level of UV5ERCC2（CC）cells was more serious than UV5ERCC2（CC）.ConclusionDNA repair capacity ofERCC2/XPDrs13181A allelic is lower than its wild?type，suggesting thatERCC2/XPDpolymorphisms play a critical role in UVC?induced DNA damage repair.

ERCC2/XPD；single nucleotide polymorphisms；transfected cell model；UVC；nucleotide excision repair

R114

A

0258-4646（2016）12-1066-07

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.12.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（81273118）

關(guān)陽(yáng)陽(yáng)（1987-），女，碩士研究生.

逯曉波，E-mail：xblu@cmu.edu.cn

2016-09-26

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