馬騰，劉麗波，藺揚，馬珺，薛一雪

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110122）

miR?200c調(diào)控RhoA基因表達介導(dǎo)RMP7增加血腫瘤屏障通透性機制的研究

馬騰，劉麗波，藺揚，馬珺，薛一雪

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110122）

目的研究miR?200c調(diào)控Ras基因家族成員A（RhoA）表達介導(dǎo)RMP7增加血腫瘤屏障（BTB）通透性的機制。方法應(yīng)用real?time PCR檢測RMP7作用BTB后人腦微血管內(nèi)皮細（ECs）miR?200c的表達；應(yīng)用miR?200c模擬物和miR?200c抑制物分別轉(zhuǎn)染GECs（ECs和U87腦膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)的細胞），測量跨內(nèi)皮阻抗值（TEER）、辣根過氧化物酶（HRP）滲漏量，分析BTB通透性；應(yīng)用Western blotting檢測RhoA的表達；應(yīng)用免疫熒光方法觀察GECs中RhoA表達和分布；應(yīng)用雙熒光素酶報告基因檢測miR?200c轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RhoA機制。結(jié)果RMP7作用GECs后，使GECs內(nèi)源性miR?200c表達顯著降低；miR?200c模擬物和miR?200c抑制物成功轉(zhuǎn)染到GECs中；miR?200c模擬物顯著抑制RMP7誘導(dǎo)TEER值的降低、HRP的升高；miR?200c模擬物顯著減少RhoA的表達，促使RhoA在GECs細胞質(zhì)和細胞核分布減少；miR?200c模擬物轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控RhoA基因表達。miR?200c抑制物與miR?200c模擬物實驗結(jié)果相反。結(jié)論miR?200c轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控RhoA表達，介導(dǎo)RMP7增加血腫瘤屏障通透性機制。

miR?200c；Ras基因家族成員A；RMP7；血腫瘤屏障；基因表達調(diào)控

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RMP7為一種人工合成的緩激肽類似物，是特異、強效的緩激肽B2受體激動劑［1］。RMP7與緩激肽和B2受體結(jié)合后能夠快速短暫開放血腦屏障（blood brain barrier，BBB）和血腫瘤屏障（blood?tu?mor barrier，BTB）［2?3］，同樣本研究組前期研究［4?5］證明了緩激肽能夠開放BTB，并且證明Ras基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）參與RMP7與緩激肽介導(dǎo)BTB通透性的增加，但其具體機制不清楚。

miRNA是其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri?miRNA和前體pre?miRNA經(jīng)過一系列核酸酶剪切加工產(chǎn)生的，具有調(diào)控功能的非編碼小RNA，長約22個核苷酸，人類大約30%的基因受到miRNA的調(diào)控［6］。miRNA主要通過種子區(qū)與靶基因mRNA 3’非翻譯區(qū)（3’un?translation region，3’?UTR）的完全或不完全配對，降解靶基因的mRNA或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控個體發(fā)育、細胞增殖、凋亡及分化等生理病理過程［6］。研究［7］證實miR?200b和miR?200c調(diào)控RhoA和Rho相關(guān)激酶Ⅱ（Rho associated kinaseⅡ，ROCKⅡ）表達，參與內(nèi)皮細胞通透性的調(diào)節(jié)，本研究組前期工作［4?5］同樣證實了RhoA介導(dǎo)緩激肽開放BTB，進一步應(yīng)用miRNA靶基因預(yù)測軟件TargetScan預(yù)測，發(fā)現(xiàn)RhoA是miR?200c的靶基因，因此推測miR?200c可能參與RMP?7介導(dǎo)的BTB通透性增加過程。

1　材料與方法

1.1材料

NU（Nuserum）血清（BD Biosciences公司），EBM?2（Lonza公司），DMEM細胞培養(yǎng)液（Gibco公司），Li?pofectamine 3000（Invitrogen公司），RhoA抗體（Ab?cam公司）；抗β?actin抗體（Santa Cruz公司），羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（北京中山生物技術(shù)公司），RMP7、辣根過氧化物酶（horseradish perox?idase，HRP；Sigma公司）。miR?200c抑制物、模擬物（吉碼公司）。

1.2方法

1.2.1腦微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和體外BTB模型的制作：人腦微血管內(nèi)皮細胞hCMEC/D3（human cerebral microvascular endothelial cells line hCMEC/ D3，ECs）由Couraud教授惠贈，培養(yǎng)的方法參照文獻［6］。人腦膠質(zhì)細胞U87和HEK 293 T購于中科院上海細胞庫。按照MA等［4，6］的方法建立體外BTB模型。首先，1×106個U87膠質(zhì)瘤細胞細胞種植在膠原包被的Transwell小室的下層，當(dāng)細胞融合至80%時，將ECs接種至Transwell小室的上室（大約1×105個細胞）。細胞在共培養(yǎng)7～10 d后融合，此時的細胞叫做GECs（ECs with U87 glioma cells co?culturing，GECs）。共培養(yǎng)7～10 d后，加入藥物進行后續(xù)實驗。

1.2.2RMP7的作用和分組：RMP7（5 nmol/L）加到Transwell小室的上室，實驗分為6組（每組5例）：RMP7 0 min組、RMP7 5 min組、RMP7 10 min組、RMP7 15 min組、RMP7 30 min組和RMP7 60 min組。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前24 h，在6孔板中每孔接種5×105個GECs細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。取試劑盒中的P3000試劑5 μL加入含有125 μL EBM?2培養(yǎng)基中EP管，將2.5 μg待轉(zhuǎn)染的microRNA與其混合，將Li?pofectamine 3000試劑3.75 μL加入另一個裝有125 μL EBM?2培養(yǎng)基中EP管，兩個EP管混合，室溫放置5 min，按照說明書轉(zhuǎn)染。

1.2.4跨內(nèi)皮阻抗值（transendothelial electric resis?tance，TEER）的測量：TEER是應(yīng)用微孔電阻系統(tǒng)在37℃恒溫下檢測的，最終的TEER值與Transwell小室的表面積相乘計算，單位用Ω·cm2表示。

1.2.5HRP流量測定：將Transwell中與U87細胞共培養(yǎng)的GECs和單獨培養(yǎng)的ECs分別轉(zhuǎn)移至1個新的24孔板中。將含有0.5 μmol/L HRP的無血清DMEM培養(yǎng)基加入Transwell小室的上室中。RMP7作用后的特定時間點上收集下室的培養(yǎng)基，并通過色度法測量樣品中HRP的含量。HRP流量用通過每平方厘米表面積的皮摩爾（pmol/cm2）數(shù)表示。

1.2.6Western blotting檢測RhoA蛋白的表達：當(dāng)Transwell小室的上室的細胞生長到融合時，用含有0.1 mmol/L EDTA的PBS沖洗，細胞鏟刮取細胞，倒入1 mL裂解液，4℃勻漿，離心，上清液為蛋白樣品液。抗RhoA抗體（1∶300）、抗β?actin抗體（1∶800）4℃孵育過夜，在羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗中室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光、顯像，用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描，通過Fluor Chen 2.0軟件進行定量分析，測得光密度值（integrated density val?ue，IDV）。

1.2.7免疫熒光法觀察RhoA蛋白的表達和分布：將生長在蓋玻片上GECs單層用4%多聚甲醛固定，0.5%TritonX?100透化，5%BSA封閉，RhoA（抗體稀釋濃度1∶150），陰性對照用0.01 mol/L PBS代替一抗，應(yīng)用FITC標(biāo)記的熒光二抗（1∶150），避光條件下染色，甘油封片，熒光顯微鏡觀察，采集圖像。

1.2.8免疫熒光素酶報告基因?qū)嶒灒悍謩e將miR?200c模擬物陰性對照與RhoA野生型重組載體和突變型重組載體共轉(zhuǎn)染至HEK 293 T中。分別設(shè)立對照組、陰性對照+RhoA野生型組、miR?200c模擬物+ RhoA野生型和miR?200c野生型+RhoA突變型組。轉(zhuǎn)染后的HEK293 T細胞應(yīng)用雙熒光素酶試劑盒，按照說明書操作檢測熒光素酶相對活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1RMP7降低GECs中內(nèi)源性miR?200c表達

Real?time PCR結(jié)果顯示，RMP7以時間依賴性方式顯著降低miR?200c表達，RMP7 10 min組miR? 200c表達量最低，顯著低于RMP7其他時間組（P＜0.05），此后，miR?200c表達量逐漸恢復(fù)到原始的表達水平。見圖1。

2.2miR?200c模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染效率測定

Real?time PCR結(jié)果顯示，在miR?200c模擬物組，miR?200c表達量以時間依賴性方式顯著升高，轉(zhuǎn)染后72 h miR?200c表達量最高，與對照組和陰性對照組相比其表達量分別上調(diào)（7.002±1.105）和（7.019±1.118）倍。在miR?200c抑制物組，miR?200c表達量以時間依賴性方式顯著降低，轉(zhuǎn)染后72 h miR?200c表達量最低，與對照組和陰性對照組相比其表達量分別下調(diào)（0.220±0.107）和（0.227±0.100）倍。轉(zhuǎn)染后72 h為最大轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染后96 h被認為是收集和使用轉(zhuǎn)染后細胞最佳時間，并用于后續(xù)實驗。見圖2。

圖1RMP7對GECs的miR?200c表達影響Fig.1　Effect of relative expression of miR?200c as detected by RMP7 in GECs

圖2　miR?200c模擬物和miR?200c抑制物轉(zhuǎn)染效率的測定Fig.2　Transfection efficiency for miR?200c mimics and inhibitors as detected by quantitative RT?PCR

2.3miR?200c過表達和表達沉默顯著改變BTB的完整性和通透性

與對照組和陰性對照組比較，miR?200c模擬物組HRP流量顯著降低，TEER值顯著升高；miR?200c抑制物組HRP流量顯著升高，TEER值顯著降低。與miR?200c模擬物組比較，miR?200c抑制物組HRP流量顯著升高，TEER值顯著降低。見圖3。

2.4miR?200c過表達和表達沉默顯著改變RhoA的表達

圖3　MiR?200c過表達和表達沉默對BTB的完整性和通透性影響Fig.3　Changes in BTB integrity and permeability after overexpression or silencing of miR?200c

與對照組和陰性對照組比較，miR?200c模擬物組RhoA表達量顯著降低；miR?200c抑制物組RhoA表達量顯著升高。與miR?200c模擬物組比較，miR?200b抑制物組表達量顯著升高。見圖4。

2.5miR?200c過表達和表達沉默顯著改變RhoA的分布

圖4　MiR?200c過表達和表達沉默對RhoA表達影響Fig.4　Effect of overexpression or silencing of miR?200c on RhoA expression

在GECs中，RhoA在內(nèi)皮細胞質(zhì)和細胞核中有表達。MiR?200c模擬物組RhoA在細胞質(zhì)和細胞核中表達減少，miR?200c抑制物組RhoA在細胞質(zhì)和細胞核中表達增多。見圖5。

2.6miR?200c轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控RhoA基因表達根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測（http：//www.tar? getscan.org/），miR?200c種子區(qū)和RhoA 3’?UTR的133?139具有結(jié)合位點（圖6A）。如圖6B所示，雙熒光素酶報告基因檢測顯示，與對照組和陰性對照組相比miR?200c模擬物組野生型熒光素酶活性顯著下降，模擬物組突變型熒光素酶活性沒有顯著變化。

圖5　熒光顯微鏡觀察miR?200c過表達和表達沉默對RhoA表達和分布影響Fig.5　Effect of overexpression or silencing of miR?200c on the expression and distribution of RhoA in GECs by immunofluorescence analysis

圖6　MiR?200c轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控RhoA基因表達Fig.6　MiR?200c inhibits the expression of RhoA by targeting their 3’?UTR

3　討論

近年來，miRNA的研究越來越收到重視，成為生命科學(xué)中的研究熱點。MiR?200家族根據(jù)其在染色體上的定位被分為2個基因組：分布在1號染色體上的miR?200ab/miR?429基因組，和分布在12號染色體上的miR?200c/miR?141基因組。也可以根據(jù)它們的功能和種子區(qū)分為2個亞家族：miR?200b、miR?200c和miR?429具有相同種子區(qū)，叫做miR?200b/200c/429基因簇；miR?200a和miR?141具有相同種子區(qū)組成miR?200a/141基因簇［8］。本研究發(fā)現(xiàn)miR?200c參與RMP7介導(dǎo)的BTB通透性的改變，同樣，有報道m(xù)iR?34c轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控MAZ表達，MAZ調(diào)控緊密連接相關(guān)蛋白ZO?1、occludin和clau?din?5表達，進而調(diào)控BTB通透性的改變。以上研究結(jié)果說明某些miRNA和BTB通透性緊密相關(guān)［9］。

本研究和我們過去的研究［4?5］均證實RhoA參與RMP7與緩激肽介導(dǎo)BTB通透性的增加，RhoA引起F?actin細胞骨架重排，緊密連接關(guān)蛋白ZO?1、occlu?din和claudin?5重分布，進而引起B(yǎng)TB通透性升高。在本研究中發(fā)現(xiàn)miR?200c轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控RhoA表達，且miR?200c通過種子區(qū)與RhoA 3’?UTR保守區(qū)133?139位點結(jié)合。有學(xué)者［7］發(fā)現(xiàn)miR?200c轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控RhoA表達介導(dǎo)高級聚糖化終產(chǎn)物（advanced glycation end，AGE）誘導(dǎo)人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞通透性升高，而且miR?200c種子區(qū)同樣與RhoA 3’?UTR保守區(qū)133?139位點結(jié)合，這與我們的研究結(jié)果一致。近年來有研究［8］發(fā)現(xiàn)miR?200b/200c/429基因簇中miR?200b也能直接調(diào)控PKCα導(dǎo)致細胞骨架F?actin重排，這個研究結(jié)果部分與我們實驗結(jié)果不同，可能是由細胞的組織特異性等引起的。

綜上所述，miR?200c可以轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RhoA等分子的表達，進而介導(dǎo)細胞骨架重排，引起B(yǎng)TB通透性改變。

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（編輯武玉欣）

miR?200c Regulates RMP7?mediated Increases of Blood?tumor Barrier Permeability by Targeting RhoA

MA Teng，LIU Libo，LIN Yang，MA Jun，XUE Yixue
（Department of Neurobiology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo study the mechanism of miR?200c in regulating RMP7?induced increases of blood?tumor barrier（BTB）permeability by targetingRashomolog gene family member A（RhoA）.MethodsEndogenous expression of miR?200c was detected by real?time PCR in hu?man cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3（ECs）after RMP7 treatment.miR?200c mimic and miR?200c inhibitor were transfect?ed into GECs（ECs with U87 glioma cells co?culturing），respectively.Transfection efficiency of miR?200c mimic and miR?200c inhibitor were de?termined by real?time PCR.HRP flux and TEER assays revealed BTB permeability.The protein expression level of RhoA was assessed by West?ernblotting.ThedistributionofRhoAwasassessedbyimmunofluorescencemicroscopy.RhoAluciferaseassayswereperformedusingtheDual?Lucif?erase reporter assay system.ResultsRMP7 significantly induced a decrease in miR?200c expression in GECs of BTB.miR?200c mimic and miR?200c inhibitor were successfully transfected into GECs.Overexpression of miR?200c inhibited endothelial leakage and restored normal transendo?thelial electric resistance values.Simultaneously，overexpression of miR?200c significantly reduced the protein expression level of RhoA.In addi?tion，immunofluorescence analysis revealed that the distribution of RhoA in the cytoplasm and nuclei of GECs were decreased in miR?200c mimic group.RhoA was one of the direct targets of miR?200c with the specific binding site being located at the seed sequence.The results of miR?200c si?lencing were opposite to that of the miR?200c overexpression group.ConclusionmiRNA?200c regulated RMP7?induced increases in BTB perme?ability by targeting RhoA.

miR?200c；RhoA；RMP7；blood tumor?barrier；gene expression regulation

R338.2

A

0258-4646（2016）12-1057-06

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.12.001

國家自然科學(xué)基金（81101918；81673028）

馬騰（1976-），男，副教授，博士.

薛一雪，E-mail：xueyxiue888@163.com

2016-06-02

網(wǎng)絡(luò)出版時間：