王飛，董凌月，安威

（首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系；肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

技術(shù)方法

小鼠成體肝臟前體細(xì)胞最佳培養(yǎng)條件探索

王飛，董凌月，安威*

（首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系；肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

目的 建立一種專門用于小鼠肝臟前體細(xì)胞的培養(yǎng)條件，并鑒定該條件在連續(xù)傳代培養(yǎng)的過程中是否能夠維持前體細(xì)胞良好的生長狀態(tài)，并減少分化的發(fā)生。方法 配制4種不同配方的培養(yǎng)基，在連續(xù)傳代過程中通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化而選擇適用的配方，并經(jīng)Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)肝細(xì)胞標(biāo)志物白蛋白（albumin，ALB）、肝臟前體細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）和膽管細(xì)胞標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白-19（cytokeratin-19，CK-19）表達(dá)量的變化，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，以及免疫熒光染色鑒定前體細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)以進(jìn)一步驗(yàn)證選擇配方的有效性。結(jié)果 使用第4種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞形狀規(guī)則，邊界清晰，生長活力較好，連續(xù)傳代培養(yǎng)后細(xì)胞的形態(tài)未發(fā)生明顯改變。Western blot檢測顯示，ALB、AFP和CK-19在P0代、P3代和P8代中的表達(dá)量沒有顯著改變。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)連續(xù)多次傳代的細(xì)胞約76%的細(xì)胞處于G0／G1期，近24%的細(xì)胞處于S＋G2／M期，而且約89%的細(xì)胞表達(dá)肝臟前體細(xì)胞標(biāo)志物上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)EpCAM。結(jié)論 建立了合適的培養(yǎng)基配方可用于小鼠成體肝臟前體細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)，為更加深入地研究肝臟前體細(xì)胞的機(jī)制與再生醫(yī)學(xué)方面創(chuàng)造了前提條件。

小鼠成體肝臟前體細(xì)胞；連續(xù)傳代；可塑性；培養(yǎng)條件

成體干細(xì)胞是存在于已經(jīng)分化的組織器官中的未分化細(xì)胞，具有自我更新的能力，并在一定條件下可以分化為各種特異的細(xì)胞類型［1］。成體干細(xì)胞的研究起始于20世紀(jì)60年代對造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSC）的研究［2］。近些年來肝臟成體干細(xì)胞的研究取得了很大的進(jìn)步，早在1958年，Wilson和Leduc就在小鼠肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有多向或雙向分化潛能的肝臟前體細(xì)胞［3］，后來又有人發(fā)現(xiàn)肝外來源，如從骨髓來源的肝臟干細(xì)胞；并根據(jù)來源不同，將其分為肝源性肝臟前體細(xì)胞和非肝源性肝臟前體細(xì)胞，前者主要指卵圓細(xì)胞［4］，后者主要指來自于骨髓造血干細(xì)胞等的前體細(xì)胞。成體肝臟的卵圓細(xì)胞所占的比例不到肝臟細(xì)胞總數(shù)的1%，并且大都處于休眠狀態(tài)，但當(dāng)肝臟受到毒物損傷，如CCl4、乙硫氨酸，或部分切除后，卵圓細(xì)胞可增殖并且分化［5-8］。胡以平等采用倒千里光堿（retrosine，Rs）阻斷本體的肝細(xì)胞增殖后，經(jīng)肝臟部分切除作為促有絲分裂的信號，術(shù)后14d從小鼠肝臟分離得到的一類具有卵圓細(xì)胞性質(zhì)的肝臟前體細(xì)胞［9］，并將之命名為肝上皮前體細(xì)胞（liver epithelial progenitor cells，LEPCs）。LEPCs屬于雙潛能干細(xì)胞［10］，而干細(xì)胞的培養(yǎng)相對于其它細(xì)胞而言需要的條件較為嚴(yán)格，一是需要保證其生長狀態(tài)良好，二是要防止在傳代的過程中出現(xiàn)分化，以維持其可塑性。

本研究對小鼠成體肝臟前體細(xì)胞LEPCs的培養(yǎng)條件進(jìn)行了探索，先后使用了4種不同配方的培養(yǎng)基，首先從形態(tài)學(xué)的觀察確定培養(yǎng)基的組成，并通過Western blot檢測、流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光染色，驗(yàn)證了所選擇的培養(yǎng)條件在連續(xù)傳代培養(yǎng)的過程中，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，能較好地保持前體細(xì)胞的可塑性，為后續(xù)的深入研究提供了保障。

材料與方法

1 細(xì)胞

LEPCs由第二軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室胡以平教授贈(zèng)予。

2 主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco／BRL公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司，德國ScienCell公司）；mHGF（美國R＆D systems公司）；mEGF（美國 Cell Signaling Technology公司）；胰島素（美國Gibco／BRL公司）；尼克酰胺（美國SUPELCO公司）；BD CycletestTMPlus DNA Kit（美國BD公司）；流式細(xì)胞術(shù)用PE標(biāo)記EpCAM單克隆抗體（美國eBioscience公司）；免疫熒光用EpCAM單克隆抗體（英國abcom公司）；流式細(xì)胞術(shù)用FITC標(biāo)記DLK1單克隆抗體（英國abcom公司）；ALB多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；AFP多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；CK-19多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗GAPDH抗體（上?？党缮锟萍加邢薰荆?。

3 培養(yǎng)基

條件1培養(yǎng)基：高糖DMEM、10%FBS、1%青霉素和鏈霉素（雙抗）。

條件2培養(yǎng)基：高糖DMEM、10%FBS、1%雙抗、10μg／ml胰島素、1mmol／L GlutaMAX。

條件3培養(yǎng)基：高糖DMEM、10%FBS、1%雙抗、0.1mmol／L β-巰基乙醇、10ng／ml肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、10ng／ml上皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、10μg／ml胰島素、0.1μmol／L地塞米松、10ng／ml尼克酰胺、50mg／ml慶大霉素。

條件4培養(yǎng)基：高糖DMEM、10%FBS、1%雙抗、0.1mmol／L β-巰基乙醇、10ng／ml HGF、10ng／ml EGF、10μg／ml胰島素、0.6mg／ml尼克酰胺、50mg／ml慶大霉素。

4 LEPCs的傳代培養(yǎng)

將LEPCs分別置于上述不同配方的培養(yǎng)基中，于37℃無菌條件下，在含95%的相對濕度、5%CO2恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每72～96h傳代1次，并于傳代過程中對細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行觀察。

5 Western blot檢測

裂解培養(yǎng)的LEPCs提取細(xì)胞總蛋白，測定所提取樣品蛋白質(zhì)的含量。取50μg蛋白質(zhì)95℃氣浴變性5min后立即置于冰上。將樣品置于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳2h，隨后利用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。在含5%脫脂奶粉的加入Tween-20 Tris鹽緩沖液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）中將膜封閉1h，用抗體稀釋液將肝細(xì)胞標(biāo)志物白蛋白（albumin，ALB）、肝臟前體細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）和細(xì)胞角蛋白-19（cytokeratin-19，CK-19）［11］的第一抗體按照合適的稀釋比例進(jìn)行稀釋（ALB和AFP按1∶800稀釋，CK-19的稀釋比例為1∶500），將膜放入其中后放置于搖床上4°C過夜。TBST漂洗3次，按1∶5000的比例將第二抗體稀釋后與膜室溫?fù)u床孵育1h，TBST再次漂洗3次，化學(xué)發(fā)光顯色后于X線片上曝光，常規(guī)進(jìn)行顯影定影。目的抗體雜交后用洗膜液洗膜后，再次將膜與GAPDH單克隆抗體（按1∶8000稀釋）孵育，作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。將顯影后X線片結(jié)果掃描，利用Image J軟件計(jì)算每個(gè)條帶的灰度值。將每個(gè)樣本的目的蛋白灰度值除以內(nèi)參照（GAPDH）的灰度值，得到每個(gè)樣本的目的蛋白相對含量，并以此比較不同樣本間的表達(dá)差異。

6 細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)分析

按照Cycle TESTTMPLUS DNA Reagent Kit說明書進(jìn)行操作，具體步驟如下：將培養(yǎng)的LEPCs消化后用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）收集制備單細(xì)胞懸液，加入75%乙醇固定，室溫以400g轉(zhuǎn)速離心5 min，棄掉上清，加入A溶液250μl，輕輕混合均勻后室溫放置10min；加入200μl溶液B混合均勻，室溫孵育10min，最后加入200μl碘化丙啶（PI）放置于冰上避光孵育10min后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

7 肝前體細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析

將培養(yǎng)的LEPCs消化后用PBS收集制備單細(xì)胞懸液，加入肝臟前體細(xì)胞標(biāo)志物上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）［12］和胚胎肝臟前體細(xì)胞標(biāo)記物（δ-like 1 homologue，DLK1）［13］的流式抗體染色液，室溫避光孵育1h，同時(shí)設(shè)立同型陰性對照組，用PBS洗3次后，加入500μl PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測EpCAM和DLK1的表達(dá)。

8 免疫熒光檢測染色

選擇生長良好的細(xì)胞，用PBS洗去培養(yǎng)基后，4%多聚甲醛固定30min，0.5%Triton X-100輕搖通透細(xì)胞30min。加入正常山羊血清封閉液，輕搖封閉50 min。滴加兔抗小鼠EpCAM單克隆抗體（1∶150），4°C過夜。按1∶200稀釋比例加入Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37°C孵育1h。吸棄第二抗體后，用PBS輕搖清洗3次，每次10min。加入 DAPI染液室溫避光孵育30min，吸去染液，加入PBS，置于熒光顯微鏡下觀察。陰性對照組將第一抗體替換為PBS。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0（Statistic Package for Social Science，SPSS）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用t檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 條件4為LEPCs最佳傳代培養(yǎng)條件

圖1　應(yīng)用4種不同培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察。箭示細(xì)胞表面突起及模糊的邊界；比例尺，50μmFig.1　Morphology of LEPCs in 4 different media during P0，P3 and P8.Arrows indicate cell surface protuberances and unclear boundaries；scale bar，50μm

為保證LEPCs在連續(xù)傳代的過程中可以保持良好的生長狀態(tài)及分化潛能，我們使用4種含不同物質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將第1代稱為P0，傳代后依次稱為P1、P2及P3等。在連續(xù)傳代培養(yǎng)的過程中，觀察各培養(yǎng)條件對細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果顯示，條件1的培養(yǎng)效果最差，隨著傳代的進(jìn)行，細(xì)胞邊界變得模糊，細(xì)胞形態(tài)更為扁平，細(xì)胞表面突起增加，傳代時(shí)間延長，意味著傳代后細(xì)胞與P0相比出現(xiàn)明顯變化，條件1無法作為LEPCs連續(xù)傳代培養(yǎng)的條件（圖1）。條件2培養(yǎng)基的配方來自于文獻(xiàn)中肝臟前體細(xì)胞的培養(yǎng)條件［9］。使用條件2后，細(xì)胞在P8代時(shí)形狀相對條件1更為規(guī)則，但與P0代細(xì)胞相比邊界出現(xiàn)模糊，傳代時(shí)間明顯增加，因此條件2仍不是最佳的選擇（圖1）。條件3培養(yǎng)基是根據(jù)已有的報(bào)道［14，15］加以改良而成。使用條件3培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細(xì)胞的生長狀態(tài)明顯好于條件2，但P8代時(shí)，細(xì)胞的形狀邊界與P0相比仍有一些變化，而且傳代時(shí)間也由72h延長至96h（圖1）。條件4培養(yǎng)基是在條件3的基礎(chǔ)上，將10-7mol／L地塞米松去除，并將尼克酰胺的含量由10ng／ml改為0.6mg／ml。使用條件4連續(xù)傳代培養(yǎng)后，P8代的細(xì)胞形狀仍如P0一樣規(guī)則，邊界清晰，且細(xì)胞的生長活力較好，傳代時(shí)間也沒有明顯改變（圖1）。因此后續(xù)的培養(yǎng)過程中均使用條件4的培養(yǎng)基配方。

2 條件4培養(yǎng)LEPCs細(xì)胞不改變細(xì)胞分子標(biāo)志物的表達(dá)

為進(jìn)一步明確條件4對LEPCs細(xì)胞狀態(tài)的影響，我們首先使用Western blot方法分別檢測P0、P3和P8LEPCs中肝細(xì)胞標(biāo)志物ALB、肝前體細(xì)胞標(biāo)志物AFP和CK-19蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化情況。結(jié)果顯示，與P0代相比，P3代細(xì)胞中 ALB、AFP和 CK-19的蛋白質(zhì)表達(dá)量沒有發(fā)生明顯的改變，P8代顯示了相似的結(jié)果（圖2）。這些結(jié)果說明在條件4的培養(yǎng)條件下，LEPCs細(xì)胞沒有向肝臟細(xì)胞或膽管細(xì)胞進(jìn)行分化，維持了細(xì)胞的分化潛能。

圖2　LEPCs連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中肝細(xì)胞標(biāo)志物和肝前體細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的Western blot檢測。A，P0、P3和P8 LEPCs中AFP、ALB和CK-19表達(dá)的代表性Western blot；B至D，P0、P3和P8 LEPCs中AFP（B）、ALB（C）和CK-19（D）表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fig.2　Western blot detection of the expression of ALB，AFP and CK-19 in LEPCs during serial passage.A，a representative Western blot result of ALB，AFP and CK-19 expression in P0，P3 and P8 LEPCs；B to D，statistical analysis of the expression levels of AFP（B），ALB（C）and CK-19（D） in P0，P3 and P8 LEPCs

為觀察條件4對連續(xù)傳代培養(yǎng)的LEPCs細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響，我們進(jìn)而應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別分析了P0、P3和P8代細(xì)胞在細(xì)胞周期各時(shí)期的比例。結(jié)果顯示（圖3），P0代LEPCs細(xì)胞處于G0／G1期約77.7%，S＋G2／M期的細(xì)胞大約占22.3%，P3代及P8代各期細(xì)胞所占比例沒有明顯變化，說明連續(xù)傳代后LEPCs細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的分裂增殖能力。

圖3　LEPCs連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)分析。A，P0、P3和P8 LEPCs代表性細(xì)胞周期；B，P0、P3和P8 LEPCs細(xì)胞周期的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fig.3　Flow cytometry analysis of the cell cycle of LEPCs during serial passage.A，representative cell cycles of P0，P3 and P8 LEPCs；B，statistical analysis of the cell cycles of P0，P3 and P8 LEPCs

EpCAM（epithelial cell adhesion molecule）是一種上皮細(xì)胞黏附分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附，介導(dǎo)細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、并參與細(xì)胞的遷移、增殖與分化等過程，可作為肝臟前體細(xì)胞的標(biāo)志分子［12］。將LEPCs連續(xù)傳代培養(yǎng)6個(gè)月后，利用流式細(xì)胞儀對LEPCs細(xì)胞的肝臟前體細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行了檢測。連續(xù)多次傳代后，EpCAM陽性細(xì)胞可占到總細(xì)胞數(shù)的89%（圖4）。在檢測EpCAM的同時(shí)，我們又對胚胎肝臟前體細(xì)胞的標(biāo)志物DLK1的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)DLK1的表達(dá)很低，陽性細(xì)胞僅占總細(xì)胞數(shù)的12%（圖4）。為驗(yàn)證流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果，我們又應(yīng)用免疫熒光的方法檢測了EpCAM在多次傳代的LEPCs細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下可觀察到絕大多數(shù)細(xì)胞表面顯示綠色熒光，而陰性對照則沒有綠色熒光（圖5）。這些結(jié)果均說明，連續(xù)多次傳代培養(yǎng)的LEPCs仍保持良好的增殖能力和未分化狀態(tài)，也進(jìn)一步表明條件4是一種比較理想的培養(yǎng)LEPCs的培養(yǎng)基。

圖4　肝前體細(xì)胞標(biāo)志物在連續(xù)傳代6個(gè)月的　P8 LEPCs中表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測Fig.4　Flow cytometry detection of hepatic progenitor cell markers in P8 LEPCs after serial passage for 6 months

圖5　EpCAM在連續(xù)傳代6個(gè)月的　P8 LEPCs中表達(dá)的免疫熒光檢測。比例尺，50μmFig.5　Immunofluorescent detection of EpCAM in P8 LEPCs after serial passage for 6 months.Scale bar，50μm

討 論

在長期的慢性肝臟疾病或急性的肝損傷情況下，位于門靜脈周圍的成體肝臟前體細(xì)胞即卵圓細(xì)胞可被激活［16］。激活后的卵圓細(xì)胞可進(jìn)入肝小葉，并分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，因此卵圓細(xì)胞是一種具有雙向分化潛能的干細(xì)胞［17，18］。研究成體肝臟前體細(xì)胞的重要意義除可以進(jìn)行分化機(jī)制的研究，臨床治療的應(yīng)用外，還寄希望于通過構(gòu)建組織支架，接種前體細(xì)胞生成新的器官并應(yīng)用于移植中，但目前該領(lǐng)域的研究仍然在探索中［18］。應(yīng)用成體肝臟前體細(xì)胞的基礎(chǔ)是分離得到前體細(xì)胞，并且在傳代培養(yǎng)過程中可以保持良好的狀態(tài)及分化潛能。雖然目前對成體肝臟前體細(xì)胞的培養(yǎng)條件已經(jīng)積累了一定的資料［19］，但由于長期傳代培養(yǎng)所需要的培養(yǎng)條件相對比較苛刻，仍面臨著沒有相對統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的問題，在培養(yǎng)條件上仍然處于摸索的階段。

本實(shí)驗(yàn)中所使用LEPCs是經(jīng)單細(xì)胞克隆培養(yǎng)所得到的一種類似于肝臟卵圓細(xì)胞的成體肝臟前體細(xì)胞［9］，具有雙向分化的潛能。我們在對LEPCs的連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基配方的不同會直接影響到LEPCs的生長狀態(tài)及分化潛能，因此探索其合適的培養(yǎng)條件對后續(xù)依賴于LEPCs的肝臟前體細(xì)胞分化機(jī)制及治療的研究具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)配制了4種具有不同配方的培養(yǎng)基對LEPCs細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng)。條件4在去除了條件3中的地塞米松，并增加了尼克酰胺的濃度后，使LEPCs細(xì)胞的狀態(tài)在連續(xù)傳代的過程中沒有發(fā)生明顯改變，而且肝臟前體細(xì)胞的標(biāo)志物AFP始終維持著和P0代細(xì)胞相似的水平，同時(shí)成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志物ALB和膽管細(xì)胞的標(biāo)記物CK-19的表達(dá)均未發(fā)生明顯的增加。尼克先酰胺與葡萄糖代謝相關(guān)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入可顯著增加NAD＋的含量，促進(jìn)ATP合成和能量代謝，更好的維護(hù)細(xì)胞的生長與繁殖。為進(jìn)一步確認(rèn)上述結(jié)果，我們延長了連續(xù)傳代的時(shí)間，在6個(gè)月后又分析了EpCAM的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)表達(dá)Ep-CAM的細(xì)胞仍占了絕大多數(shù)。這些結(jié)果意味著LEPCs在條件4培養(yǎng)下，可以一直維持增殖狀態(tài)，而且保持了良好的分化潛能。

DLK1又稱為脂肪前體細(xì)胞因子1（preadipocyte factor 1，Pref-1），具有抑制脂肪前體細(xì)胞分化的作用。內(nèi)胚層起源的肝臟前體細(xì)胞中有DLK1的表達(dá)，因此可以將其看作為胚胎肝臟前體細(xì)胞的標(biāo)記物［13］。我們也通過流式細(xì)胞分析檢測了連續(xù)傳代后LEPCs中DLK1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)DLK1的表達(dá)水平很低，僅有約11%的細(xì)胞表達(dá)DLK1，這也說明了成體來源的前體細(xì)胞與胚胎來源的前體細(xì)胞在蛋白表達(dá)水平上的差別，也意味著其分化機(jī)制及可塑性具有一定的區(qū)別。

本實(shí)驗(yàn)確定了LEPCs細(xì)胞合適的培養(yǎng)條件，為LEPCs細(xì)胞相關(guān)的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Exploration of the optimal culture conditions for adult mouse hepatic progenitor cells

Wang Fei,Dong Lingyue,An Wei*
（Department of Cell Biology；Municipal Key laboratory for Liver Protection and Regulation of Regeneration，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Objective To establish a specific formula of culture condition for mouse hepatic progenitor cells and identify whether the cells can be maintained in good condition and kept from differentiation during serial passage under this condition.Methods Four different types of media were prepared.The optimal medium was determined based on the morphological changes during serial passage. Expression levels of hepatic marker albumin(ALB),hepatic progenitor cell marker alpha-fetoprotein(AFP),and bile duct epithelium marker cytokeratin-19(CK-19)were detected by Western blot.The cell cycle was analyzed by flow cytometry,and the expression of progenitor cell markers was verified by immunofluorescent staining to further assess the effectiveness of the selected culture medium. Results Cells in the 4th culture medium grew energetically with regular shapes and clear boundaries,and no obvious change in morphology was observed after serial passage.Western blot revealed that ALB,AFP,and CK-19 were expressed stably in P0,P3 and P8 cells.Flow cytometry results showed that after serial passage,about 76%of the cells were in G0／G1 stage and approximately 24%of the cells were in S＋G2／M stage,while 89%of the cells expressed epithelial cell adhesion molecule(EpCAM),a typical hepatic progenitor cell marker.The expression of EpCAM was further confirmed by immunofluorescent staining.Conclusion A specific formula of medium for serial passage of adult mouse hepatic progenitor cells has been established,which provides preconditions for further study of the mechanism of hepatic progenitor cells growth and regenerative medicine.

Adult mouse hepatic progenitor cells；serial passage；plasticity；culture condition

Q253

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.013

2016-06-10

2016-09-20

國家自然科學(xué)基金（31371169）

王飛，男（1984年），漢，碩士研究生

（To whom correspondence should be addressed）：anwei＠ccmu.edu.cn