朱紅娜　喬瑛　蘇安樂　張婷　柏凌　梁厚成

1.西安市第一醫(yī)院眼科,陜西西安710002；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科,陜西西安710004

藍光照射人視網(wǎng)膜色素上皮細胞后通過增加細胞內(nèi)鈣離子濃度促進凋亡的機制

朱紅娜1喬瑛1蘇安樂1張婷1柏凌2梁厚成1

1.西安市第一醫(yī)院眼科,陜西西安710002；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科,陜西西安710004

目的觀察藍光對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡的影響并探討其可能機制。方法細胞株分為藍光照射組和對照組。藍光照射組,利用35 W白色冷光燈加用藍色濾光片建立藍光損傷體外培養(yǎng)的RPE細胞模型,藍光控制波長范圍470～520 nm,光照強度在2000 lx左右,光照時間24～96 h,實驗過程中保證光照在細胞培養(yǎng)孵箱內(nèi)密進行。對照組為常規(guī)避光孵箱培養(yǎng)細胞,除無光線照射外,各培養(yǎng)條件相同。利用流式細胞儀檢測RPE細胞的凋亡變化,利用流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測RPE細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。結(jié)果與對照組比較,藍光照射組的RPE細胞凋亡增加（P＜0.05)；照射組的RPE細胞內(nèi)游離鈣離子濃度增加（P＜0.05)；通過特異性抑制L型電壓依賴性鈣離子通道功能降低RPE細胞內(nèi)游離鈣離子濃度,在一定程度上降低了藍光引起的RPE細胞凋亡。結(jié)論藍光可以通過增加RPE細胞內(nèi)游離鈣離子濃度促進RPE細胞的凋亡,L型電壓依賴性鈣離子通道有望成為治療年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜變性疾病的新靶點。

藍光;人視網(wǎng)膜色素上皮細胞;凋亡;細胞內(nèi)鈣離子濃度

年齡相關(guān)性黃斑變性的病發(fā)病機制復(fù)雜,目前尚未完全闡明且療效欠佳,是引起中老年人發(fā)生視力缺損甚至致盲的主要疾病之一[1-2]。因此,研究年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病機制有重要意義。年齡相關(guān)性黃斑變性與視網(wǎng)膜光損傷有相似的病理過程,視網(wǎng)膜光損傷是研究年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜變性疾病的良好模型[3]。已有研究證實,光損傷過程中,視網(wǎng)膜色素上皮細胞的凋亡增加,且損傷程度和光暴露的劑量成正比,但其具體機制還未闡明[4-5]。近年來大量文獻報道,作為重要的第二信使,細胞內(nèi)鈣離子濃度對參與調(diào)控細胞的增殖、分化、礦化、自噬和凋亡等過程,而鈣離子通過L型電壓依賴性鈣離子通道進入細胞是鈣離子進入RPE細胞的主要方式[6-7]。本研究通過藍光照射體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞,檢測其凋亡水平的變化及細胞內(nèi)鈣離子水平,以探究光暴露對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡的影響和可能的機制,旨在為年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜變性疾病發(fā)病機制的研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人視網(wǎng)膜色素上皮細胞株（ARPE-19細胞株)購自美國模式菌種收集中心（ATCC)；DMEM細胞培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶和雙抗等細胞培養(yǎng)試劑（美國hyclone公司)；胎牛血清（中國四季青公司)；流式細胞儀（美國B&D公司)；激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5)；熒光標記鈣離子探針Fluo-3AM（中國碧云天公司)；L型鈣離子通道阻斷劑nifedipine（以色列Alomone Lab公司)；Annexin-V/PI凋亡試劑盒（美國Roche公司)；其他耗材及試劑均購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)常規(guī)方法復(fù)蘇、培養(yǎng)細胞,所用試劑如上所述,取5～10代ARPE-19細胞株用于實驗。參照蔡善君等[5]建模方法,去上述5～10代的ARPE-19細胞株常規(guī)培養(yǎng),待細胞匯合度達80%左右時進行藍光照射。光照條件為35 W白色冷光燈加用藍色濾光片,控制波長范圍470～520 nm,光照強度在2000 lx左右,光照時間從24～96 h。

1.2.2人視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡檢測將分組處理過的細胞用預(yù)冷的PBS清洗3遍,胰蛋白酶消化收集細胞,再用預(yù)冷的PBS清洗2遍；隨后利用Binding Buffer緩沖液制備1×106個細胞的細胞懸液；在上述細胞懸液中加入5 μg Annexin V試劑,吹打均勻后,室溫反應(yīng)10 min；加入5 μL Annexin V-FITC和/或PI,輕輕混勻,室溫避光放置15 min[8-9]。實驗重復(fù)至少3次。

1.2.3鈣離子成像檢測RPE細胞內(nèi)鈣離子濃度利用Fluo-3AM對RPE細胞內(nèi)游離鈣離子濃度進行檢測。將處理后培養(yǎng)在6孔板中的細胞取出后,配制細胞沖洗液進行細胞洗滌,常規(guī)孵箱中孵育35 min。隨后用細胞沖洗液洗滌2次,再次孵箱孵育10 min。用激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)射波長為525 nm,激發(fā)波長為488 nm。在隨即視野中選取50個細胞掃描其Ca2+的熒光強度并用FV10-ASW1.7 Viewer軟件進行分析[10]。實驗重復(fù)至少3次。

1.2.4流式細胞儀檢測RPE細胞內(nèi)鈣離子濃度將培養(yǎng)的RPE細胞用0.25%的胰蛋白酶消化并制備成單細胞懸液,Fluo-3AM對RPE細胞內(nèi)鈣離子標記方法同上,最后制成1×106個/mL的細胞懸液,上流式細胞儀檢測。激發(fā)條件同上。利用BD公司的BD FACSDiva和BECKMAN公司EXPO32軟件對測得的熒光強度及細胞的陽性率進行分析[7]。每組檢測的細胞量在10000個以上,實驗重復(fù)至少3次。

1.2.5nifedipine孵育RPE細胞利用二甲基亞砜將購得的L型鈣離子通道阻斷劑nifedipine粉末配成10 mmol/L的濃縮溶劑,在培養(yǎng)細胞時再利用正常細胞培養(yǎng)基將此濃縮液稀釋為工作濃度10 μmol/L。藍光照射組細胞保證在藍光照射下在培養(yǎng)孵箱內(nèi)培養(yǎng)；藍光照射+nifedipine組為藍光照射的同時利用上述配制的工作液培養(yǎng)細胞；對照組為常規(guī)避光孵箱培養(yǎng)細胞,除無光線照射外,各培養(yǎng)條件同藍光照射組。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行分析,正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s)表示,兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

圖1　流式細胞儀檢測藍光照射對RPE細胞凋亡的影響

2.1藍光照射促進RPE細胞凋亡

研究組先利用Annexin V/PI凋亡試劑盒將細胞進行染色處理,隨后利用流式細胞儀檢測藍光照射后RPE細胞的凋亡變化,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,藍光照射后RPE細胞凋亡明顯增加（P＜0.05)。見圖1。

2.2藍光照射增加RPE細胞內(nèi)鈣離子濃度

為了驗證藍光照射后RPE細胞凋亡和RPE細胞內(nèi)鈣離子濃度的關(guān)系,采用Fluo-3AM標記RPE細胞內(nèi)鈣離子,在共聚焦顯微鏡下檢測藍光照射對RPE細胞內(nèi)游離鈣離子的影響。與對照組比較,藍光照射組熒光強度增高。定量比較結(jié)果表明,藍光照射后RPE細胞內(nèi)鈣離子濃度是對照組RPE細胞內(nèi)鈣離子濃度的2.5倍（P＜0.05)（圖2a)。流式細胞儀來檢測藍光對RPE細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響,結(jié)果表明:與對照組比較,藍光照射組熒光強度增高（P＜0.05)（圖2b)。

2.3nifedipine可以減少藍光照射引起的RPE細胞凋亡

在藍光照射時在培養(yǎng)基中加入10 μmol/L的nifedipine,在處理后利用流式細胞儀檢測各組RPE細胞凋亡情況。與對照組比較,藍光照射組RPE細胞凋亡明顯增加（P＜0.05)；與藍光照射組比較,藍光照射+nifedipine組RPE細胞凋亡減少（P＜0.05),但與對照組比較,其凋亡增加（P＜0.05)。見圖3。

圖2　藍光照射對RPE細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

圖3　藍光條件下檢測降低RPE細胞內(nèi)鈣離子濃度對RPE細胞凋亡的影響

3　討論

年齡相關(guān)性黃斑變性是引起中老年人發(fā)生視力缺損的主要疾病之一,該病的發(fā)生發(fā)展與長期累積的光暴露損傷相關(guān)[11]。人視網(wǎng)膜色素上皮細胞具有視色素轉(zhuǎn)運,轉(zhuǎn)運營養(yǎng)成分和清除自由基等功能,RPE細胞功能的正常對維持視網(wǎng)膜的功能和結(jié)構(gòu)有重要意義[4,12]。已有研究證實,光損傷過程中,視網(wǎng)膜色素上皮細胞的有不同程度的損傷,蔡莉等[4]發(fā)現(xiàn)藍光對RPE細胞的損傷呈光照強度及光照時間依賴性。本實驗觀察到藍光照射后RPE的凋亡明顯增加,這與之前研究相符。

近年來大量文獻報道,作為重要的第二信使,細胞內(nèi)鈣離子濃度對參與調(diào)控細胞的增殖、分化、礦化、自噬和凋亡等過程。細胞內(nèi)正常濃度的鈣離子對于細胞各項活動的維持至關(guān)重要。在高糖、缺氧和某些藥物等刺激因素存在時,細胞內(nèi)鈣離子濃度增加,引起鈣超載,從而促進細胞的凋亡[13-16]。在本實驗中,本研究組經(jīng)過鈣離子敏感的熒光染料Fluo-3AM的預(yù)染,經(jīng)過激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀的檢測發(fā)現(xiàn),藍光照射后,RPE細胞內(nèi)游離鈣離子濃度明顯增加,且在藍光照射的整個過程和檢測過程中,RPE細胞內(nèi)的鈣離子濃度持續(xù)保持高水平。細胞內(nèi)的游離鈣離子的來源有兩個,細胞外鈣離子通過離子通道進入細胞內(nèi),細胞內(nèi)的鈣庫釋放,但內(nèi)鈣的釋放主要是以脈沖的形式,短時間內(nèi)使得細胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生大幅度的增加[17-18]；而細胞外的鈣離子主要是通過細胞表面的L型電壓依賴型鈣離子通道進入細胞[19-21]。為了進一步驗證藍光照射引起RPE細胞凋亡增加和RPE細胞內(nèi)鈣離子濃度高水平的關(guān)系,研究組在藍光照射的同時加用特異性L型電壓依賴型鈣離子通道阻滯劑nifedipine,發(fā)現(xiàn)雖然沒有恢復(fù)正常對照水平,但藍光照射引起RPE細胞凋亡減少。這說明阻斷RPE細胞上L型電壓依賴型鈣離子通道,降低其細胞內(nèi)游離鈣離子濃度,能夠減少藍光對RPE細胞凋亡的促進作用,發(fā)揮一定的保護作用。

盡管如此,本研究也存在一些不足之處:實驗只是離體驗證了藍光對RPE細胞凋亡的影響及初步探討了可能的機制,并未在動物模型中驗證結(jié)論,在接下來的實驗中,研究組將致力于克服在體觀察RPE細胞凋亡及細胞內(nèi)鈣離子濃度等技術(shù)難題,在動物模型中驗證本研究的結(jié)論；藍光照射引起RPE細胞凋亡增加的其他原因和光暴露對RPE細胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高的原因仍有待進一步研究與探索。

綜上所述,藍光可以通過增加RPE細胞內(nèi)游離鈣離子濃度促進RPE細胞的凋亡,本實驗從光化學(xué)損傷促進RPE細胞凋亡的角度,探討了光暴露對RPE細胞凋亡的影響,一定程度上對治療藍光損害視網(wǎng)膜眼病提供了指導(dǎo)意義。

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Blue light promotes apoptosis of human retinal pigment epithelial cells by up-regulation of intracellular calcium concentration

ZHU Hongna1QIAO Ying1SU Anle1ZHANG Ting1BO Ling2LIANG Houcheng1
1.Department of Ophthalmology,Xi'an First Hospital,Shaanxi Province,Xi'an710002,China;2.Department of Ophthalmology,the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province,Xi'an710004,China

Objective To investigate the influence and mechanism of blue light on the apoptosis of human retinal pigment epithelial cells.Methods Cells were divided into blue light group and control group.35 W white light lamp with blue filter was used to establish damaged RPE cell model in vitro,blue ray wave length ranged 470-520 nm,and the light intensity was about 2000 lx,light exposure time was set to 24-96 h,in the experimental process,the light was carried out in the cell culture incubation box.The control group cells were cultured in the conventional light avoidance incubator,and the culture conditions were as the same as the blue light group except without light.After exposure to blue light,the apoptosis of human retinal pigment epithelial cells was tested by flow cytometry.And then the intracellular calcium concentration of human retinal pigment epithelial cells was measured by flow cytometry and laser scanning confocal microscope.Results Compared with control group,the apoptosis of human retinal pigment epithelial cells increased in blue light group(P＜0.05),and the intracellular calcium concentration of human retinal pigment epithelial cells increased(P＜0.05).The intracellular calcium concentration of human RPE cells decreased by specific inhibition of L-type voltage-dependent calcium channel,RPE cell apoptosis caused by blue light decreased.Conclusion Blue light promotes apoptosis of human retinal pigment epithelial cells by the up-regulation of intracellular calcium concentration. [Key words]Blue light;Human retinal pigment epithelial cells;Apoptosis;Intracellular calcium concentration

R774.1

A

1673-7210(2016)06(b)-0004-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（30901644)。

信息]朱紅娜（1983.10-),碩士；研究方向:眼底病學(xué)。

梁厚成（1963.1-),博士,主任醫(yī)師；研究方向:眼底病學(xué)。

（2016-03-16本文編輯:蘇暢)