鐘世順　張振書　李淑梅

1.福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院福建省立醫(yī)院消化內鏡中心,福建福州350001；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化內科,廣東廣州510515；3.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院476臨床部內一科,福建福州350002

雙歧桿菌分泌型黏附素對內毒素血癥大鼠腸道自由基和細胞間黏附分子的影響

鐘世順1張振書2李淑梅3

1.福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院福建省立醫(yī)院消化內鏡中心,福建福州350001；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化內科,廣東廣州510515；3.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院476臨床部內一科,福建福州350002

目的探討雙歧桿菌分泌型黏附素對內毒素血癥大鼠腸道自由基和細胞間黏附分子（ICAM-1)的影響。方法將雄性SD大鼠72只隨機分為對照組（24只)、內毒素血癥模型組（24只)和黏附素預處理組（預處理組,24只)。建模成功后6 h及1、4、7 d,各組分別取6只大鼠剖殺,生化方法檢測各時間點腸道組織中超氧化物歧化酶（SOD)、丙二醛（MDA)及髓過氧化物酶（MPO)含量,并應用酶聯免疫吸附試驗測定腸道ICAM-1的變化。結果和對照組相比,模型組大鼠腸黏膜MDA、MPO、ICAM-1含量顯著增高（P＜0.05),SOD含量明顯降低（P＜0.05),與模型組相比,黏附素預處理組大鼠回腸組織中MDA、MPO、ICAM-1含量明顯降低（P＜0.05),SOD含量明顯升高（P＜0.05)。結論氧化損傷在內毒素血癥腸損傷中發(fā)揮一定作用,雙歧桿菌分泌型黏附素可減輕腸道的氧化損傷,對腸黏膜屏障具有一定的保護作用。

雙歧桿菌;黏附素;內毒素血癥;自由基;細胞間黏附分子

全身炎性反應綜合征和多臟器功能障礙綜合征時,腸道既是啟動器官,也是最易受損的靶器官。內毒素是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分之一,其主要化學成分為脂多糖（Liposaccharide,LPS)。當來自于腸道和感染部位的內毒素大量進入體內引起大量氧自由基生成,可導致腸黏膜損害,完整性受到破壞。黏附素是微生物表面的一類生物大分子,通常為蛋白質或糖蛋白,與微生物的黏附可能密切相關。目前對雙歧桿菌黏附素的研究尚較少,本實驗采用腹腔注射LPS法建立內毒素血癥大鼠模型,觀察雙歧桿菌分泌型黏附素對內毒素血癥大鼠腸道自由基和細胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule,ICAM-1)濃度變化的影響,以評價其在內毒素血癥時對腸黏膜屏障損傷的保護作用。

1　對象與方法

1.1主要試劑和材料

青春型雙歧桿菌株1027經API20A及TAB系統（英國)和多次生化鑒定確定。LPS（E.coli.O111:B4 Sigma公司)；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD)、丙二醛（Methane dicarboxylic aldehyde,MDA)及髓過氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；大鼠ICAM-1酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)試劑盒購自上海百蕊生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1雙歧桿菌分泌型黏附素的提取、純化將雙歧桿菌接種于硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基,置入厭氧培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h,離心收集培養(yǎng)上清液,經過飽和硫酸銨沉淀,Superdex 75柱凝膠過濾,Q-Sepharose FF離子交換層析后,收集第1峰的成分,相對分子質量為16 000[1]。凍干保存。

1.2.2實驗動物和分組4～6周齡健康SD大鼠72只,購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司（實驗動物合格證號:0051443),清潔級,雌雄不限,體重220～300 g。采用簡單隨機抽樣法將實驗動物分為3組:模型組（24只):腹腔注射LPS（5 mg/kg),造模前后正常喂養(yǎng)；雙歧桿菌黏附素預處理組（24只):建模前7 d開始給予正常喂養(yǎng)加黏附素5 mg/（kg·d)灌胃,第8天腹腔注射LPS（5 mg/kg)后繼續(xù)黏附素5 mg/（kg·d)灌胃直至處死動物；對照組（24只):腹腔注射生理鹽水（1 mL/kg),造模前后始終給予正常喂養(yǎng)。建模成功判斷標準:腹腔注射LPS后,除人為處死外,SD大鼠7 d內不因其他原因死亡。

1.2.3標本的采集和處理各組分別于腹腔注射LPS后6 h及1、4、7 d麻醉下腹腔切開,迅速取出小腸末端距回盲部5 cm的回腸組織,生理鹽水沖洗后,液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4SOD、MDA、MPO和ICAM-1的測定回腸組織SOD活性采用黃嘌吟氧化酶法,硫代巴比妥酸法檢測MDA的含量,分光光度法測定MPO活性。應用ELISA法測定腸道ICAM-1的變化,具體操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析,計量資料數據用均數±標準差（±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

表1　各組大鼠造模后各時點腸組織SOD、MDA、MPO及ICAM-1含量的變化（s)

表1　各組大鼠造模后各時點腸組織SOD、MDA、MPO及ICAM-1含量的變化（s)

注:與對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05；LPS:脂多糖；SOD:超氧化物歧化酶；MDA:丙二醛；MPO:髓過氧化物酶

組別只數S O D（U / m L ) M D A（m m o l / m L ) M P O（U / g ) I C A M -1（p g / m L )對照組注射L P S后6 h注射L P S后1 d注射L P S后4 d注射L P S后7 d模型組注射L P S后6 h注射L P S后1 d注射L P S后4 d注射L P S后7 d預處理組注射L P S后6 h注射L P S后1 d注射L P S后4 d注射L P S后7 d 2 4 1 2 6 . 3 5 ± 1 3 . 7 4 1 2 5 . 8 6 ± 1 2 . 7 1 1 3 0 . 6 2 ± 1 1 . 3 9 1 2 8 . 3 3 ± 1 2 . 6 6 0 . 3 4 ± 0 . 0 6 0 . 3 1 ± 0 . 1 1 0 . 3 5 ± 0 . 1 5 0 . 3 6 ± 0 . 0 8 0 . 3 0 ± 0 . 0 5 0 . 3 3 ± 0 . 1 4 0 . 3 5 ± 0 . 1 2 0 . 2 9 ± 0 . 0 7 1 5 6 . 2 3 ± 1 7 . 0 6 1 6 2 . 2 8 ± 1 9 . 1 2 1 5 8 . 3 4 ± 1 3 . 3 5 1 5 0 . 5 9 ± 1 6 . 0 9 2 4 9 0 . 3 0 ± 1 0 . 5 1*6 3 . 5 8 ± 8 . 9 6*8 2 . 0 8 ± 9 . 8 7*9 2 . 2 1 ± 1 1 . 5 3*0 . 6 5 ± 0 . 1 2*0 . 7 8 ± 0 . 2 3*0 . 6 6 ± 0 . 1 3*0 . 5 9 ± 0 . 0 9*0 . 6 5 ± 0 . 1 1*0 . 8 0 ± 0 . 2 7*0 . 5 7 ± 0 . 1 5*0 . 4 8 ± 0 . 0 9*3 4 4 . 7 5 ± 2 0 . 3 6*3 9 8 . 7 1 ± 2 5 . 9 1*3 0 1 . 2 2 ± 2 1 . 6 6*2 7 8 . 4 3 ± 2 3 . 1 5*2 4 9 3 . 1 8 ± 9 . 3 6*1 1 5 . 3 3 ± 1 2 . 3 0#1 2 5 . 6 9 ± 8 . 4 1#1 2 6 . 2 2 ± 1 0 . 1 7#0 . 4 9 ± 0 . 2 0*#0 . 5 2 ± 0 . 1 8*#0 . 4 1 ± 0 . 1 6#0 . 3 5 ± 0 . 1 0#0 . 4 0 ± 0 . 0 8#0 . 5 3 ± 0 . 1 6*#0 . 3 8 ± 0 . 1 3#0 . 3 2 ± 0 . 1 1#2 2 8 . 3 1 ± 1 8 . 7 6*#2 5 3 . 4 4 ± 1 5 . 8 5*#1 7 8 . 8 9 ± 1 4 . 3 3#1 6 1 . 6 0 ± 1 7 . 4 1#

模型組各時點回腸組織中SOD含量均明顯低于對照組,差異有統計學意義（P＜0.05),雙歧桿菌黏附素預處理組除注射LPS后6 h時點外,其余各時點回腸組織中SOD含量雖較對照組有所降低,但差異無統計學意義（P＞0.05)；而注射LPS后1、4、7 d后雙歧桿菌黏附素預處理組回腸組織中SOD含量均較模型組明顯升高,差異均有統計學意義（P＜0.05)。模型組各時點回腸組織中MDA、MPO含量均明顯高于對照組,差異有統計學意義（P＜0.05)；雙歧桿菌黏附素預處理組各時點回腸組織中MDA、MPO含量雖較對照組有所升高,但卻明顯低于模型組,差異有統計學意義（P＜0.05)。見表1。

腹腔注射LPS后,模型組各時點回腸組織中ICAM-1表達均明顯高于對照組,差異有統計學意義（P＜0.05),雙歧桿菌黏附素預處理組各時點回腸組織中ICAM-1表達雖較對照組有所升高,但卻明顯低于模型組,差異有統計學意義（P＜0.05)。見表1。

3　討論

腸道在多器官功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2],它不僅是阻止腸腔內細菌、毒素等有害物質侵入體內的重要屏障,也是調節(jié)機體應激反應、生成炎癥介質的重要器官。當發(fā)生內毒素血癥時,腸黏膜屏障受損,其機制可能與缺氧、炎癥介質釋放、氧自由基增多、細胞凋亡等有關[3-5],此時可發(fā)生大量細菌、內毒素移位,從而導致多器官功能衰竭,甚至死亡[6]。

雙歧桿菌是一種人體腸道中最重要的生理菌,目前關于其在減輕內毒素血癥、調節(jié)脂質代謝、抑制氧化損傷、減輕腸道炎性反應、保護腸屏障功能等方面的作用特點已有較多報道[7-10]。但雙歧桿菌活菌制劑也存在一些不足之處,比如制造與保存活菌制劑的難度較大,由于局部氣體和生長底物的不足,活菌難以足量繁殖,且如果該菌穿過腸壁,還可能促進敗血癥的發(fā)生等[11-13]。無細胞制劑則可有效克服以上缺陷,因此,我們嘗試應用從雙歧桿菌培養(yǎng)上清液中純化出的一種分子量為16 kD的蛋白質[14]——雙歧桿菌分泌型黏附素,觀察其對腸黏膜屏障的保護作用,結果發(fā)現:雙歧桿菌分泌型黏附素可抑制內毒素對腸上皮細胞的損害作用,對缺血-再灌注后大鼠腸黏膜屏障也具有防護作用,能減輕腸缺血再灌注損傷[15-16],但雙歧桿菌分泌型黏附素是否可抑制腸道氧自由基生成尚不清楚。本實驗采用腹腔注射LPS法建立內毒素血癥大鼠模型,觀察雙歧桿菌分泌型黏附素對內毒素血癥大鼠腸道自由基和ICAM-1的濃度變化的影響,評價雙歧桿菌分泌型黏附素對內毒素血癥時腸道損傷的保護作用。

當發(fā)生內毒素血癥時,氧自由基大量生成,與生物膜中的脂類物質發(fā)生作用,導致脂質過氧化反應,產生大量包括MDA在內的醛類產物,造成生物膜系統損傷和細胞內氧化磷酸化障礙,導致腸黏膜屏障損傷[17-19]。MDA可降低細胞膜流動性,使細胞通透性增加,可作用于細胞膜上的蛋白質分子,使之變性,促進炎性滲出和水腫,是腸組織的脂質過氧化物的代表性產物。MDA含量的高低可能在一定程度上反映了氧自由基對組織、細胞損傷的程度。MPO是一種主要存在于中性粒細胞中的酶,在單核細胞和巨噬細胞中也少量存在。MPO含量的多少可間接反映組織炎癥浸潤程度,可作為評價腸道炎癥嚴重程度的指標[20]。SOD是一種源于肌體的活性物質,能消除生物體在代謝過程中產生的有害物質,如清除氧自由基,抑制組織中的脂質過氧化反應,穩(wěn)定細胞膜,維持細胞內氧自由基處于一種無害的低水平狀態(tài)。SOD的活力高低可反映機體清除自由基的能力。本研究發(fā)現:LPS模型組各時點腸組織MDA、MPO含量均顯著高于對照組,而SOD含量則均明顯低于對照組,說明內毒素血癥時氧自由基和脂質過氧化引起的氧化損傷可能是造成腸黏膜損傷中的機制之一；使用雙歧桿菌分泌型黏附素預處理后,各時點回腸組織中MDA、MPO含量明顯低于LPS模型組,SOD含量雖較對照組有所降低,但卻明顯高于LPS模型組,使機體清除氧自由基的能力增強,減輕了腸黏膜的病理損傷,從而達到保護機體腸道正常生理功能的目的。

ICAM-1是一類位于細胞膜表面的糖蛋白分子,是位于血管內皮細胞表面的一種重要黏附分子,體內分布廣泛,在炎癥和免疫反應中發(fā)揮重要作用。組織局部黏附分子表達上調是中性粒細胞黏附、激活的基礎,而中性粒細胞過度激活可導致組織損傷[21]。本實驗中,大鼠腹腔注射LPS后,腸道組織ICAM-1表達上調,使中性粒細胞聚集,釋放炎癥介質,加重腸組織損傷。雙歧桿菌分泌型黏附素預處理后,ICAM-1表達下調,說明雙歧桿菌分泌型黏附素可能通過抑制ICAM-1的生成或釋放,降低中性粒細胞聚集,減少炎癥介質的釋放,從而發(fā)揮對腸道的保護作用。

綜上所述,在大鼠內毒素血癥腸損傷模型中,大鼠腸組織MDA和MPO含量增加,SOD活性下降,使腸組織內氧自由基生成過多或清除能力下降,引起脂質過氧化反應,造成氧化損傷,可能是內毒素血癥腸損傷的發(fā)病機制之一。雙歧桿菌分泌型黏附素可通過提高SOD活性進而抑制脂質過氧化損傷,同時通過抑制ICAM-1介導的炎性反應在一定程度上維護了腸黏膜屏障功能的穩(wěn)定。雙歧桿菌分泌型黏附素可能對防治腸源性感染發(fā)展為多器官功能衰竭,減少機體的繼發(fā)損傷起到一定的作用。

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Effect of bifidobacteria adhesin on the intestinal free radical and intercellular adhesion molecule in rat with endotoxaemia

ZHONG Shishun1ZHANG Zhenshu2LI Shumei3
1.Department of Digestive Endoscopy,Provincial Clinic Medical College,Fujian Medical University,Fujian Provincial Hospital,Fujian Province,Fuzhou350001,China;2.Department of Gastroenterology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangdong Province,Guangzhou510515,China;3.First Department of Internal Medicine,the 476th Clinical Department,Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region,Fujian Province,Fuzhou350002, China

Objective To investigate the effect of bifidobacteria adhesin on the intestinal free radical and intercellular adhesion molecule(ICAM-1)in rat with endotoxaemia.Methods Seventy-two male SD rats were randomly divided into control group(n=24),endotoxaemia model group(n=24)and pretreatment group of bifidobacterial adhesin(pretreatment group,n=24).The rats were sacrificed at 6 h,1 d,4 d and 7 d after inducing model respectively by equal number.The superoxide dismutase(SOD),malonyldialdehyde(MDA)activity and the content of myeloperoxidase(MPO)were measured by biochemical methods.The content of ICAM-1 was measured by ELISA.Results The content of MDA,MPO and ICAM-1 markedly increased in the model group than that of the control group,but SOD decreased(P＜0.05).In pretreatment group,SOD activity was significantly higher,but the content of MDA,MPO and ICAM-1 were lower than those of the model group(P＜0.05).Conclusion Oxidative damage plays a role in intestinal injury during endotoxemia. Bifidobacterial adhesin may relieve intestinal oxidative damage,and has a protective effect on gut barrier.

Bifidobacteria;Adhesin;Endotoxaemia;Free radical;Intercellular adhesion molecule

R644

A

1673-7210(2016)06(b)-0012-04

福建省青年人才資助項目（2006F3107)。

（2016-03-07本文編輯:任念)