王貞　程瑋　張雯

西安市兒童醫(yī)院呼吸二科,陜西西安710003

Stomatin樣蛋白2通過PI3K通路對兒童哮喘的影響

王貞程瑋張雯

西安市兒童醫(yī)院呼吸二科,陜西西安710003

目的研究Stomatin樣蛋白2（STOML2)基因表達(dá)在兒童哮喘發(fā)病中的作用。方法選擇2013年9月～2014年3月在西安市兒童醫(yī)院（以下簡稱“我院”)呼吸科住院的14例哮喘患兒為研究對象,選擇同期在我院進(jìn)行健康體檢的9例正常兒童作為對照。采用RT-qPCR和Western blot方法檢測兩組兒童外周血單個核細(xì)胞（PBMC)中STOML2和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K)mRNA和蛋白的表達(dá)水平；構(gòu)建STOML2過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC),MTT法檢測細(xì)胞的生長,觀察STOML2過表達(dá)對PI3K表達(dá)的影響。結(jié)果與正常兒童比較,哮喘患兒PBMC中STOML2 mRNA及蛋白水平顯著降低,而PI3K水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)STOML2會抑制氣道平滑肌細(xì)胞生長,并抑制PI3K的表達(dá)。結(jié)論STOML2在哮喘患兒中低表達(dá),過表達(dá)STOML2抑制ASMC的生長,其可能是通過抑制PI3K活性實(shí)現(xiàn)的。

兒童哮喘;Stomatin樣蛋白2;磷脂酰肌醇3激酶;氣道平滑肌細(xì)胞

支氣管哮喘（簡稱“哮喘”)是兒童最常見的慢性呼吸道疾病之一。據(jù)國際兒童哮喘與變態(tài)反應(yīng)研究（the International Study of Asthma and Allergies in Childhood,ISAAC)統(tǒng)計(jì),全球大約已有3億例哮喘患者,其中以發(fā)展中國家居多[1]。最近的流行學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,我國兒童哮喘兩年現(xiàn)患率為2.32%,累計(jì)患病率為3.02%[2],消耗著巨大的醫(yī)療衛(wèi)生資源。目前,哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,經(jīng)典免疫學(xué)說認(rèn)為哮喘的發(fā)病機(jī)制主要與Th1/Th2功能失衡有關(guān),但其并不能完全解釋哮喘的發(fā)病。Stomatin樣蛋白2（Stomatinlike Protein 2,STOML2)是Stomatin家族的一員,為線粒體內(nèi)膜蛋白。研究表明,Stomatin在多種癌癥中均高表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖和遷移[3-4]。陳繼承[5]研究發(fā)現(xiàn),人工合成的糖皮質(zhì)激素——地塞米松,一種治療兒童哮喘的常用藥,可上調(diào)人肺腺癌A549細(xì)胞和大鼠肺臟中Stomatin的表達(dá),從而增強(qiáng)肺泡上皮細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。另一方面,T細(xì)胞STOML2的缺失會引起線粒體呼吸的改變及CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的缺失[6],而上調(diào)STOML2可促進(jìn)T細(xì)胞分化,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用并抑制凋亡[7-8]。這些研究均提示STOML2表達(dá)異?？赡芘c哮喘的發(fā)病有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以哮喘患兒為研究對象,構(gòu)建STOML2過表達(dá)載體并將其導(dǎo)入人氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cell,ASMC)中,研究STOML2基因表達(dá)在兒童哮喘發(fā)病中的作用及其可能的機(jī)制。

1　對象與方法

1.1對象

選取2013年9月～2014年3月在西安市兒童醫(yī)院（以下簡稱“我院”)呼吸科就診的住院患兒作為哮喘組,其中男9例,女5例,年齡5～12,平均（8.2± 3.5)歲,哮喘診斷符合中華醫(yī)學(xué)會哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。選擇同期在我院兒童保健科門診進(jìn)行健康體檢的兒童作為對照組,其中男5例,女4例,年齡6～13,平均（8.2±3.1)歲,均無哮喘疾病家族史,1個月內(nèi)無呼吸道感染及無過敏性疾病史或其他疾病史。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。ASMC購自美國Cambrex Bioscience公司。pCDNA3.1質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4連接酶購自美國NEB公司。大腸桿菌DH5α為我院實(shí)驗(yàn)室保存。兔抗人STOML2抗體和PI3Kp85抗體購自Santa Cruz公司。SYBR Premix Ex TaqⅡ和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程公司,MTT試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)本采集及細(xì)胞培養(yǎng)清晨取研究對象的靜脈血5mL,肝素抗凝。常規(guī)分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC),培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,待用。ASMC也培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640中。

1.3.2STOML2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及分組根據(jù)人STOML2基因全長mRNA序列（序列號為:NM_012999.1)設(shè)計(jì)STOML2的引物。STOML2上游引物為:5'-GTGACTCTCGACAATGTAAC-3',下游引物為:5'-TGATCTCATAACGGAGGCAG-3'。并在上、下游引物的5'端分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ兩個限制性酶切位點(diǎn)。提取ASMCs的mRNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,而后PCR擴(kuò)增STOML2基因。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5 min；95℃45s,62℃45s,72℃45s,35個循環(huán)；72℃延伸5 min。EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pCDNA3.1質(zhì)粒并用T4連接酶連接片段。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α細(xì)胞后,抽提重組質(zhì)粒并測序鑒定。將Lipofectamine 2000和pCDNA3.1-STOML2重組質(zhì)粒以2.0:0.8（v/v)的比例混合并轉(zhuǎn)染ASMCs。實(shí)驗(yàn)分為3組:Blank組（未做任何處理)、pCDNA3.1組（轉(zhuǎn)染pCDNA3.1空質(zhì)粒)及STOML2組（轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-STOML2重組質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染24 h后,提取細(xì)胞蛋白,檢測STOML2的表達(dá)水平并評測轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3RT-qPCR檢測STOML2及PI3K的mRNA水平表達(dá)Trizol試劑抽提各組細(xì)胞總RNA并用分光光度計(jì)測定RNA吸光度值（OD值),然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系共20 μL: SYBR Premix Ex TaqⅡ混合液10 μL,cDNA模板2 μL,上下游引物各1 μL,去離子水6 μL。反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min；然后94℃,30 s；56℃,30 s；72℃, 40 s,共35個循環(huán)；72℃,延伸5 min。根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算方法計(jì)算基因相對表達(dá)水平。STOML2引物參見實(shí)驗(yàn)方法1.3.2。PI3K上游引物為:5'-CAAAGCCGAGAACCTATTGCGAG-3',下游引物為:5'-GTTTGACTTCGCCATCTACCAC-3'。

1.3.4Western blot檢測STOML2及PI3K的蛋白表達(dá)量RIPA裂解細(xì)胞后測定蛋白濃度,隨后將25 μg蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE分離后,電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。而后,用PBS封閉液（含3%脫脂奶粉,0.1% Tween-20)對膜進(jìn)行封閉（室溫封閉1 h)。封閉后,加入STOML2（1:800)、PI3Kp85（1:500)及β-actin（1:1000)一抗,4℃孵育過夜,隨后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:2000)室溫孵育2 h。用ECL發(fā)光系統(tǒng)檢測目的條帶,Image Pro Plus 6.0軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3.5MTT法檢測細(xì)胞生長將對數(shù)生長期細(xì)胞以5× 103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時,按步驟轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-STOML2重組質(zhì)粒,并于轉(zhuǎn)染后72 h進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL)后加入150 μL二甲基亞砜。然后用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s)表示,多組間數(shù)據(jù)比較采用ANOVA單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1哮喘患兒與正常兒童STOML2表達(dá)水平

為了檢測STOML2在哮喘患兒PBMC中的表達(dá)情況,本實(shí)驗(yàn)分離了兩組兒童的PBMC并通過RT-qPCR和Western blot方法進(jìn)行了測定。RT-qPCR結(jié)果顯示,哮喘患兒PBMC中STOML2-mRNA水平（0.41±0.05)顯著低于對照組（0.77±0.04),Western blot結(jié)果也驗(yàn)證了這一現(xiàn)象（P＜0.05)。見圖1。

2.2STOML2過表達(dá)載體的構(gòu)建

在ASMC中,與Blank組比較,轉(zhuǎn)染STOML2過表達(dá)載體可顯著提高STOML2的mRNA及蛋白表達(dá)水平,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。與pCDNA3.1組比較,STOML2組STOML2的mRNA及蛋白水平也顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。說明STOML2過表達(dá)載體構(gòu)建成功。見表1、圖2。

圖1　哮喘患兒與正常兒童PBMC中STOML2的表達(dá)水平

表1　各組STOML2 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（±s,n=4)

表1　各組STOML2 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（±s,n=4)

注:與Blank組比較,*P＜0.05；與pCDNA3.1組比較,#P＜0.05

組別mRNA表達(dá)蛋白表達(dá)Blank組1.00±0.051.00±0.02 pCDNA3.1組1.00±0.091.03±0.07 STOML2組3.19±0.24*#2.19±0.16*#

2.3過表達(dá)STOML2抑制ASMC細(xì)胞增殖

為了探討STOML2影響哮喘的機(jī)制,在體外測定了過表達(dá)STOML2對ASMC細(xì)胞增殖的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Blank組[（95.00±1.45)%]和pCDNA3.1組[（95.17±2.69)%]比較,STOML2組[（50.13± 3.11)%]細(xì)胞增殖能力顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。見圖3。

2.4PI3K表達(dá)水平

為了進(jìn)一步探討STOML2調(diào)控哮喘的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)外水平檢測了PI3K的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,與對照組[mRNA水平:（0.33±0.02)；蛋白水平:（0.43±0.03)]比較,哮喘患兒PBMC中PI3K水平[mRNA水平:（0.72±0.04)；蛋白水平:（1.03±0.12)]顯著升高（P＜0.05),見圖4A。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,與Blank組[mRNA水平:（1.00±0.05)；蛋白水平:（1.00±0.07)]比較,STOML2組PI3K水平[mRNA水平:（0.54±0.06)；蛋白水平:（0.48±0.09)]顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05),提示過表達(dá)STOML2可顯著降低PI3K的水平與PI3K水平呈負(fù)相關(guān),見圖4B。

圖2　STOML2過表達(dá)載體的效果

3　討論

STOML2屬于Stomatin樣蛋白家族,是細(xì)胞呼吸鏈復(fù)合物正確發(fā)展的必須基因[10],調(diào)控細(xì)胞增殖、黏著等多種功能[11]。STOML2位于染色體9p13.1上,其在多種癌癥中發(fā)揮著生物學(xué)功能。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)喘患兒外周血PBMC中低表達(dá),提示STOML2在哮喘發(fā)病中扮演一定的角色。

氣道炎癥和氣道重構(gòu)（如氣道平滑肌層的增生和肥大及基底的增厚)是支氣管哮喘的重要病理表現(xiàn)[14]。然而現(xiàn)在關(guān)于氣道重構(gòu)的機(jī)制尚不明確,哮喘時ASMC增生是氣道重構(gòu)的主要原因[3]。Johnson等[4]通過體外培養(yǎng)哮喘患者ASMC發(fā)現(xiàn),與非哮喘患者比較,哮喘患者ASMC的增殖能力明顯升高。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步構(gòu)建了STOML2過表達(dá)載體并檢測了其對ASMC增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)STOML2可以抑制ASMC細(xì)胞增殖。這與Revez等[15]人的發(fā)現(xiàn)一致,即STOML2是一個潛在的哮喘風(fēng)險基因。

越來越多的研究表明,PI3K信號通路在哮喘的病理生理過程中起著重要作用[16],且對ASMC增殖起著正向調(diào)節(jié)的作用。Scott等[17]報(bào)道指出,在牛ASMC中,活化PI3K會增強(qiáng)DNA的有絲分裂,而PI3K抑制劑wortmannin可顯著減少DNA合成。另一方面,研究也發(fā)現(xiàn)抑制調(diào)節(jié)性體細(xì)胞（regulatory T cells,Treg)中PI3K信號通路的活化有助于維持Treg細(xì)胞種群的體內(nèi)平衡和免疫功能[18]。而PI3K信號可以通過參與Th1/Th2、Treg/Th17的失衡參與哮喘的發(fā)病過程[19-20]。 STOML2在人食管鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、喉癌及子宮內(nèi)膜癌組織中均高表達(dá),在人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系KYSE450中,沉默STOML2伴隨著細(xì)胞生長、增殖和細(xì)胞黏著的抑制。STOML2在上皮性卵巢癌及胃腺癌細(xì)胞中高表達(dá),且與患者的不良預(yù)后有顯著相關(guān)性[12-13]。之前研究表明,地塞米松作為一種可治療哮喘的糖皮質(zhì)激素,可引起大鼠肺臟Stomatin的上調(diào)[5], STOML2缺失也會引起T細(xì)胞應(yīng)答的缺失[6-7],提示STOML2可能與哮喘有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)STOML2在哮本研究發(fā)現(xiàn),STOML2負(fù)調(diào)節(jié)PI3K信號通路,即在哮喘患兒PBMC中,STOML2的低表達(dá)伴隨著PI3K的升高,而在ASMC中,過表達(dá)STOML2可以顯著降低PI3K的水平,這為哮喘的治療提供了一個潛在的基因靶點(diǎn)。

圖3　過表達(dá)STOML2對細(xì)胞增殖的影響

A:哮喘患兒和正常兒童PI3K mRNA及蛋白表達(dá)水平；B:ASMC中各組PI3K mRNA及蛋白表達(dá)水平；與對照組/Blank組比較,*P＜0.05；與pCDNA3.1組比較,*#P＜0.05

綜上所述,本研究表明STOML2在哮喘患兒外周血PBMC中低表達(dá),并且過表達(dá)STOML2可以抑制ASMC細(xì)胞凋亡,而此過程可能與PI3K信號通路有關(guān)。因此,STOML2有望成為治療哮喘的靶標(biāo)分子。

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Effect of STOML2 on childhood asthma through PI3K pathway

WANG ZhenCHENG WeiZHANG Wen
The Second Department of Respiration,Xi'an Children's Hospital,Shaanxi Province,Xi'an710003,China

Objective To investigate the effect of Stomatin-like Protein 2(STOML2)expression on pathogenesis of childhood asthma.Methods Totally 14 children with asthma who were hospitalized in the Department of Respiration, Xi'an Children's Hospital(“our hospital”for short)were recruited from September 2013 to March 2014,and 9 healthy children who

physical check-ups in our hospital at the same period were taken as controls.The mRNA and protein levels of STOML2 and phosphatidylinositol 3 kinase(PI3K)in peripheral blood mononuclear cell(PBMC)of children in two groups were detected by RT-qPCR and Western blot.In addition,STOML2 over-expressed vector was synthesized and transfected to airway smooth muscle cells(ASMC).The cell viability was detected by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)assay,and the effect of STOML2 over-expression on the level of PI3K was observed.Results The mRNA and protein levels of STOML2 in PBMC of asthmatic children were significantly decreased when compared with those in normal children,while the PI3K level was markedly increased,the differences were statistically significant(P＜0.05).In vitro assay showed that over-expression of STOML2 inhibited the growth of ASMC and the expression of PI3K.Conclusion STOML2 is decreased in asthmatic children and over-expression of STOML2 inhibited the growth of ASMC,which is accompanied by inhibiting PI3K pathway.

Childhood asthma;Stomatin-like Protein 2;PI3K;Airway smooth muscle cell

R562.2

A

1673-7210(2016)06(b)-0020-05

（2016-03-05本文編輯:任念)