張靜嫻,陳蕾蕾,謝俊霞

(青島大學腦科學與疾病研究院,山東省神經(jīng)相關疾病的機制與防治重點實驗室,山東省沿海地區(qū)神經(jīng)退變疾病協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 青島 266071)

作為全球第二位的神經(jīng)退行性疾病，帕金森病(PD)病理特點是黑質區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失，且殘存的細胞內(nèi)存在以α-突觸核蛋白(α-syn)聚集體為主的路易小體并伴有鐵沉積[1-3]。研究表明，寬尖峰動作電位、自主起搏電活動、胞漿鈣振蕩和較低的鈣緩沖能力是黑質區(qū)多巴胺能神經(jīng)元區(qū)別于其他神經(jīng)元的重要生理特征，而這種差異可能是PD黑質區(qū)多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失的重要原因[4-5]。PD中鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可以通過增加超氧化物和活性氧的產(chǎn)生使氧化應激水平升高，而氧化應激增加是PD中多巴胺能神經(jīng)元死亡的機制之一[6-8]。引起PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡可能與α-syn聚集和鐵沉積有關，但具體機制尚未完全闡明[9-11]。有研究顯示，聚集形式的α-syn和枸櫞酸鐵銨(FAC)均可以使原代神經(jīng)元細胞質中鈣離子增加[9-12]。最近研究表明，經(jīng)錯誤折疊后寡聚體形式的α-syn可使細胞膜完整性破壞，細胞內(nèi)鈣離子增多并誘發(fā)鐵死亡[11]。然而，鐵過載能否加劇α-syn誘發(fā)細胞內(nèi)鈣離子增多這一過程，目前尚不清楚。本研究擬應用多西環(huán)素(DOX)誘導iPC12細胞高表達α-syn，并在該細胞模型上探討FAC對過表達α-syn誘發(fā)iPC12細胞內(nèi)鈣離子增多的影響。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗所用的iPC12細胞系為穩(wěn)轉外源(人)SNCA(A53T)PC12細胞系，PC12細胞系是大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤分化細胞株；DMEM高糖培養(yǎng)液和胰蛋白酶購于Hyclone公司；胎牛血清購于依科賽公司；馬血清和GENETIXIN購于Gibco公司；FAC、去鐵銨(DFO)、鈣比色測定試劑盒和DOX均購于Sigma公司；潮霉素B購于賽默飛公司；磷酸酶抑制劑(04906837001)購于羅氏公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)實驗非無菌器具均高壓滅菌烘干后使用。待所用培養(yǎng)液在37 ℃水浴鍋中預熱后，將液氮凍存的細胞取出，迅速放置在37 ℃水浴鍋中，快速搖晃至完全融開，將全部細胞懸液轉移至10 mL已預熱的完全培養(yǎng)液中，吹打均勻后以1 000 r/min離心5 min。離心后棄上清液，用5 mL完全培養(yǎng)液重懸細胞，然后轉移至25 cm3的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放在細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)(37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2)。每4～5 d傳代1次，傳代3次后以1×108/L接種于六孔板中，每孔加2 mL完全培養(yǎng)液。細胞匯合度達70%～80%時進行后續(xù)處理。

1.3 實驗分組及處理

為觀察鐵過載對iPC12細胞內(nèi)鈣離子的影響，將細胞隨機分為對照組、DOX組、DOX+FAC組和DOX+DFO組。對照組用細胞培養(yǎng)液處理48 h，DOX組用2 mg/L的DOX處理48 h，DOX+FAC組細胞先給予2 mg/L的DOX處理24 h后再用100 μmol/L的FAC處理24 h，DOX+DFO組給予2 mg/L的DOX處理24 h后再用100 μmol/L的DFO處理24 h。

1.4 細胞內(nèi)鈣離子測定

六孔板藥物處理完畢，負壓吸取上清后，使用0.01 mol/L的PBS潤洗1次，吸凈液體，每孔加入100 μL細胞裂解液，置冰上裂解半小時后，用刮板盡可能將細胞刮下，并轉移至1.5 mL的EP管中，4 ℃下以12 000 r/min離心30 min后，吸取85 μL上清。鈣比色測定試劑盒平衡至室溫后，將標準品用雙蒸水稀釋至每孔0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 μg。每孔加入待測樣本40 μL，然后用雙蒸水補足至體積50 μL。在標準品孔和待測樣本孔中分別加入90 μL顯色試劑，然后每孔加入60 μL鈣緩沖試劑，輕輕混勻后在37 ℃環(huán)境中避光孵育15 min。用酶標儀(SpectraMax M5，Molecular Devices)在波長575 nm處測量標準品和待測樣本的吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 鐵過載對過表達α-syn誘發(fā)細胞內(nèi)鈣離子增多的影響

對照組、DOX組和DOX+FAC組的細胞內(nèi)鈣離子濃度分別為(0.192±0.007)、(0.237±0.005)和(0.292±0.017)mmol/L(n=3)，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=43.84，P<0.05)。與對照組相比較，DOX組細胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(q=3.187，P<0.05)；與DOX組相比，DOX+FAC組細胞內(nèi)鈣離子濃度進一步升高，差異有統(tǒng)計學意義(q=4.074，P<0.05)。提示FAC可加劇過表達α-syn誘發(fā)的細胞內(nèi)鈣離子水平升高。

2.2 DFO對過表達α-syn誘發(fā)細胞內(nèi)鈣離子增多的影響

對照組、DOX組和DOX+DFO組的細胞內(nèi)鈣離子濃度分別為(0.192±0.007)、(0.237±0.005)和(0.216±0.020)mmol/L(n=3)，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=5.97，P<0.05)。與DOX組相比較，DOX+DFO組細胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯變化(q=1.430，P>0.05)。提示DFO對過表達α-syn誘發(fā)的細胞內(nèi)鈣離子水平升高無明顯影響。

3 討 論

鈣是細胞內(nèi)調(diào)控重要生命活動的第二信使，細胞質內(nèi)的低鈣濃度(100 nmol/L)是細胞信號中靈敏激活鈣級聯(lián)反應的關鍵[13]。已有研究結果表明，PD中鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可以通過增加α-syn聚集和線粒體氧化應激對細胞產(chǎn)生損傷[6,14]。一方面，鈣除了調(diào)控α-syn分泌外，還可以與其C端結合，引起非淀粉樣成分結構域變化，促進β-折疊結構形成，從而促進α-syn聚集體的形成[14-15]；另一方面，鈣信號可以通過增加超氧化物和活性氧的水平來破壞線粒體復合體Ⅰ和Ⅲ[16]。

鈣促進α-syn聚集后，聚集的α-syn可以作用于細胞膜，導致鈣離子內(nèi)流，也可以引起細胞氧化損傷[11]。鐵沉積作為PD的顯著病理特征，不僅可以促進α-syn聚集，還可以增加氧化應激水平[17-18]。鐵過載在神經(jīng)元細胞上可以通過激活內(nèi)質網(wǎng)上的Ryanodine受體，增加細胞內(nèi)鈣離子的水平[12]。雖然α-syn聚集和鐵沉積分別會引起細胞內(nèi)鈣離子水平升高，但卻鮮有研究報道二者共同作用對細胞內(nèi)鈣離子的影響。本研究結果表明，鐵過載可以加劇α-syn誘導的細胞內(nèi)鈣離子濃度增高，但是鐵和α-syn共同作用引起鈣離子變化的機制仍需要進一步研究。本研究結果還表明，DFO對過表達α-syn誘導的細胞內(nèi)鈣離子增多無明顯影響。推測這可能是由于DFO不能進入細胞，無法有效阻斷鐵激活內(nèi)質網(wǎng)上Ryanodine受體引起細胞內(nèi)鈣離子增多的過程。黑質致密帶多巴胺能神經(jīng)元自主起搏電活動主要依賴于L型鈣通道的Cav1.3亞型[19]。而且有文獻報道，早期PD病人大腦中Cav1.3/Cav1.2的表達比值增加[20]。由上述研究可知，L型電壓門控通道在PD的鈣穩(wěn)態(tài)失衡中至關重要。因此，接下來的研究可進一步探索鐵和α-syn引起細胞內(nèi)鈣離子增多時L型電壓門控通道的變化，這為后續(xù)研究PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡機制提供了新的思路。但PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡的具體機制以及PD中異常鈣離子如何流動還有待進一步研究探討。