叢碩，曾小菁，洪科鋒，邱愛佳

（1.貴州省腫瘤醫(yī)院輸血科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科，貴州 貴陽 550001）

子宮頸癌與纖維蛋白原基因多態(tài)性的相關(guān)性研究

叢碩1，曾小菁2，洪科鋒1，邱愛佳1

（1.貴州省腫瘤醫(yī)院輸血科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科，貴州 貴陽 550001）

目的探究在子宮頸癌發(fā)病過程中與纖維蛋白原（Fg）β448G/A基因多態(tài)性的相關(guān)性。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性分析的方法對2013年5月-2014年12月初次就診的漢族子宮頸癌患者141例標(biāo)本與同期收集的健康漢族女性體檢者141例標(biāo)本的Fgβ448G/A基因多態(tài)性進(jìn)行基因型分型檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果①病例組Fgβ448G/A基因型頻率及等位基因頻率與對照組比較，病例組高于對照組（P＜0.05）；②A等位基因與子宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，③子宮頸癌GG、GA及AA基因型的血漿Fg水平分別是（3.09±0.22）、（3.11±0.26）和（3.31±0.51）g/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論Fgβ448G/A基因多態(tài)性變化與宮頸癌的發(fā)生可能具有相關(guān)性。

子宮頸癌；基因多態(tài)性；纖維蛋白原

子宮頸癌作為婦科疾病中最為常見的三大惡性病變之一，在其癌變的過程中，除人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的感染及持續(xù)存在外，還有其他因素參與子宮頸上皮的病理組織學(xué)改變并導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[1]。纖維蛋白原（Fibrinogen，F(xiàn)g）能夠在凝血酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，從而參與到機(jī)體的凝血機(jī)制中。當(dāng)血漿的Fg濃度明顯升高時，會對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有損傷作用。Fg作為凝血因子和非特異的炎癥因子，已成為許多疾病已知的重要危險因素之一[2-5]。大量研究表明，當(dāng)血漿Fg濃度增高時，血管疾病的發(fā)病率也會相對增高，F(xiàn)g更是動脈硬化和血栓形成的獨(dú)立危險因素[5-7]，嚴(yán)芝強(qiáng)等[8]的最新研究結(jié)果表明，F(xiàn)g基因多態(tài)性與胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其分期具有一定的相關(guān)性，但Fgβ448G/A的基因多態(tài)性與子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究尚未見報道，因此本實(shí)驗(yàn)希望通過研究病例組與對照組的基因和基因型分布情況，探究Fg基因多態(tài)性與子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1病例資料

選取2013年5月-2014年12月于貴州省腫瘤醫(yī)院病理檢查確診為子宮頸癌，且無轉(zhuǎn)移、無系統(tǒng)治療的141名漢族患者作為病例組，平均年齡（44.0±3.0）歲；同期在貴州省腫瘤醫(yī)院體檢的漢族女性健康體檢者為對照組，平均年齡（41.8±4.5）歲。1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.2.1主要試劑聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Mix（北京天根生化科技有限公司），引物合成為正向引物：AACATCAGATCCCCAGAAAAC AG，反向引物：GGTGAGCAAGAGAAATGAAGAA（上海生工生物工程股份有限公司），MarkerⅠ（北京天根生化科技有限公司），限制性內(nèi)切酶MnIⅠ（立陶宛MBI Fermentas公司），瓊脂糖（西班牙Biowest公司）。

1.2.2主要儀器PE9700擴(kuò)增儀（美國ABI公司），DNA成像分析器Gel Doc EQ（美國Bio-Rad公司），DYY–Ⅲ–5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠），Millipore超純水儀（美國Millipore公司）。

1.3DNA標(biāo)本收集

收集乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血，離心吸取白細(xì)胞層，置入-60℃冰箱冷凍保存。

1.4血漿Fg濃度測定

統(tǒng)計子宮頸癌患者于檢驗(yàn)科初次檢測的血漿Fg濃度。

1.5DNA提取

利用酚-氯仿法提取282份樣本DNA，置入-60℃冰箱分裝冷凍保存。

1.6PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為25μl，含模板DNA和引物各1μl，Taq酶13μl，雙蒸水9μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性50 s，54℃退火60 s，72℃延伸70 s，共35個循環(huán)后，72℃再次延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物降溫至4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

取5μl PCR產(chǎn)物，于2%瓊脂糖凝膠、5×Tris-硼酸緩沖液中，以141 V電壓，電泳約60 min，以分子量為100～700 bp的Marker為相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在紫外成像儀下觀看并分析。

1.8PCR產(chǎn)物酶切分型

反應(yīng)體系中加入5μl PCR產(chǎn)物，2μl 10× buffer，0.5μl限制性核酸內(nèi)切酶（Fg448G/A的內(nèi)切酶為MnlⅠ），加雙蒸水至25μl，37℃恒溫孵育16 h，酶切產(chǎn)物按1.6進(jìn)行電泳并在紫外成像儀下觀看和分析結(jié)果。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)?；蛐图暗任换蝾l率利用直接計數(shù)法進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用非條件Logistic回歸法計算比值比（odds ratio，OR）及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1子宮頸癌患者各基因型Fg水平分析

子宮頸癌患者GG、GA及AA基因型分別為76、60和5例，血漿Fg水平濃度分別為（3.09±0.22）、（3.11±0.26）和（3.312±0.505）g/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2PCR產(chǎn)物結(jié)果

2.2.1Fgβ448G/A基因分型PCR產(chǎn)物鑒定Fgβ448G/A多態(tài)性片段PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后經(jīng)紫外燈觀察，可見PCR產(chǎn)物中有427 bp大小的條帶。見圖1。

圖1　Fgβ448G/A位點(diǎn)PCR產(chǎn)物

2.2.2Fgβ448G/A基因酶切產(chǎn)物分型鑒定Fgβ448G/APCR擴(kuò)增片段為427bp，有2個MnlⅠ酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物片段，GG基因型酶切產(chǎn)生183、132和112 bp 3個片段，AA基因型缺乏其中1個MnlⅠ酶切位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生315和112 bp 2個片段，GA基因型酶切后產(chǎn)生315、183、132和112 bp 4個片段。見圖2。

圖2　Fgβ448G/APCR產(chǎn)物酶切分型鑒定

2.2.3PCR產(chǎn)物堿基序列測定隨機(jī)在病例組GG、GA和AA3個基因型的標(biāo)本中，各抽取1個標(biāo)本進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，得到的3份擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程股份有限公司進(jìn)行堿基序列檢測。見圖3。

圖3　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基序列檢測

2.3Fgβ448G/A基因多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

Fgβ448G/A基因多態(tài)性進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，病例組及對照組人群基因型及等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。見表1。

表1　兩組Fgβ448G/A基因多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（n=141）

2.4兩組Fgβ448G/A基因型及其等位基因頻率分布

對病例組與對照組Fgβ448G/A基因型及其等位基因頻率分布進(jìn)行比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩組中各基因型及等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　兩組Fgβ448G/A基因頻率及基因型頻率分析例（%）

2.5Fgβ448G/A基因型對子宮頸癌的相對危險性

對樣本的統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行非條件單變量Logistic回歸分析，探討Fgβ448G/A基因多態(tài)性與子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，結(jié)果表明，GA+AA型相對于純合子GG型，能使子宮頸癌發(fā)病率顯著升高。見表3。

表3　不同F(xiàn)gβ448G/A基因型對子宮頸癌的相對危險性例（%）

3 討論

Fg是由肝細(xì)胞合成、分泌的一種急性時相反應(yīng)糖基化蛋白[9]，半衰期為3～4d，占血漿成分的2%～3%，約為2～4g/L[10]，是血漿中含量最高的凝血因子，其由分子量為67.6kD的α鏈、分子量為52.3 kD的β鏈及分子量為48.9 kD的γ鏈的3條肽鏈通過二硫鍵連接后形成二聚體[10]，使其成為腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞間的分子橋梁，與高表達(dá)Fg受體α5β1、αvβ3整合素或CD54分子等內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，促使腫瘤細(xì)胞和靶器官內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用，加上Ⅱb和Ⅲa的復(fù)合物是血漿Fg的受體，所以機(jī)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞能夠借助血漿Fg和血小板的Ⅱb和Ⅲa復(fù)合物相互作用，形成大的復(fù)合物聚集體，從而逃脫人體免疫系統(tǒng)的殺滅作用。Fg作為不同黏附分子的配體，能增加血液中有型成分及腫瘤細(xì)胞間的黏附結(jié)合[7]，在腫瘤轉(zhuǎn)移中起至關(guān)重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，基因型以Fgβ448的純合子GG和雜合子GA為主（＞90%），而純合子AA基因型較少（＜10%），與龔五星等[11]的研究結(jié)果相似。病例組Fgβ448G/A基因GG、GA、AA分為0.539、0.426和0.035；對照組Fgβ448G/A基因GG、GA、AA分為0.667、0.326和0.007，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.422，P=0.040），推論出Fgβ448G/A的基因多態(tài)性和子宮頸癌的發(fā)生有一定的相關(guān)性。通過對樣本的統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行非條件單變量Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，雜合型GA與純合子AA雖未直接顯示與子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展有差異性，但其P值接近于0.05，雜合型GA的O＾R=1.61（95%CI：0.99，2.63），純合子AA的O＾R= 6.18（95%CI：0.07，54.07），推測只要擴(kuò)大研究的樣本量，基因型GA和AA會與子宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，且研究中表明GA+AA能使子宮頸癌發(fā)生的可能性升高（χ2=4.799，P=0.028），O＾R=1.71（95%CI：1.06，2.77），而A等位基因與G等位基因的分布則有明顯的差異（χ2=5.187，P=0.023），O＾R=1.61（95%CI：1.07，2.43），可以推測Fgβ448G/A位點(diǎn)單個堿基的改變在子宮頸癌的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

而在針對患者血清Fg水平的研究中發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌患者GG、GA及AA基因型分別為76、60和5例，血漿Fg水平濃度分別為（3.09±0.22）、（3.11± 0.26）和（3.312±0.505）g/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但整體水平上，A等位基因的水平高于G等位基因，推測是因?yàn)?41例子宮頸癌患者均是初次確診且無轉(zhuǎn)移，而其血漿Fg水平尚未發(fā)生明顯改變?？傊?，F(xiàn)gβ448G/A基因多態(tài)性用于易感人群的檢測，對子宮頸癌的早期防治具有重要的臨床意義。Fgβ448G/A基因多態(tài)性與子宮頸癌的發(fā)生可能具有相關(guān)性。

[1]FERREIRA D S,KOIFMAN,INTO-AANTOS,et al.Polymorphisms and viornmental risk factors associated with ceruical carcinogensis in a cohort of Brazilian wonen with cervical lesions[J]. Jounary of oxicology and Environment Health,2010,73(13/14): 888-900.

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（童穎丹 編輯）

Correlation betweenoccurrence of cervical cancer and genetic polymorphisms ofFgβ-448G/A

Shuo Cong1,Xiao-jing Zeng2,Ke-feng Hong1,Ai-jia Qiu1
(1.Department of Blood Transfusion,Guizhou Cancer Hospital,Guiyang,Guizhou 550004, China;2.Department of Blood Transfusion,the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550001,China)

Objective To detect the relationship between cervical cancer and gene polymorphisms ofβfibrinogen gene(Fgβ)-448G/A.Methods Polymorphisms ofFgβ-448G/Agene were detected and analyzed in the specimens from 141 cervical cancer patients and 141 healthy controls using polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism method.Results The genotype frequency and allele frequency of Fgβ-448G/Ain the cervical cancer group were significantly higher than those in the control group(P＜0.05). The allele A was closely associated with the incidence of cervical cancer.The plasma Fg levels in the cervical cancer patients with the genotypes GG,GA and AA were(3.09±0.22)g/L,(3.11±0.26)g/L and(3.31± 0.51)g/L respectively without obvious differences(P＞0.05).Conclusions The gene polymorphism ofFgβ-448G/Ais possibly associated with the incidence of cervical cancer.

cervical cancer;gene polymorphism;fibrinogen

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.006

1005-8982（2016）21-0030-05

2016-02-17

曾小菁，E-mail：zengxiaoqing@medmail.com.cn；Tel：13308506266