邱勝華，劉健，陳運(yùn)平，郭洪娜

（山東省臨沂市沂水中心醫(yī)院1.小兒外科，2.檢驗(yàn)科，山東 臨沂 276400）

循環(huán)型microRNA-92a在先天性巨結(jié)腸中的表達(dá)及上調(diào)CDX2基因的研究

邱勝華1，劉健2，陳運(yùn)平2，郭洪娜2

（山東省臨沂市沂水中心醫(yī)院1.小兒外科，2.檢驗(yàn)科，山東 臨沂 276400）

目的探討循環(huán)型microRNA-92a（miR-92a）在先天性巨結(jié)腸（HD）中的表達(dá)，以及通過上調(diào)尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子-2（CDX2）基因抑制腸神經(jīng)干細(xì)胞（ENSCs）增殖的可能機(jī)制。方法選取2013年1月-2015年12月在山東省臨沂市沂水中心醫(yī)院行先天性巨結(jié)腸根治術(shù)16例HD患兒的術(shù)前血清標(biāo)本。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測血清miR-92a mRNA的表達(dá)。提取孕15 d胎鼠腸管ENSCs，通過免疫學(xué)方法鑒定ENSCs；免疫磁珠法分選Nestin+ENSCs，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染使Nestin+ENSCs內(nèi)過表達(dá)miR-92a，噻唑藍(lán)法檢測細(xì)胞的增殖活性，qRT-PCR、Western blot檢測CDX2基因的表達(dá)。結(jié)果HD患兒血清中miR-92a mRNA的相對表達(dá)量為（23.5±4.66），高于對照組（t=12.661，P=0.000）；ENSCs細(xì)胞培養(yǎng)早期Nestin染色陽性，具有向Tuj-1陽性、膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性細(xì)胞分化的潛能；ENSCs過表達(dá)miR-92a后，CDX2 mRNA的相對表達(dá)為（13.024±3.882），高于對照組（F=47.212，P=0.000），CDX2蛋白表達(dá)為（0.436±0.0828），高于對照組（F=48.793，P=0.000），細(xì)胞的增殖活性在轉(zhuǎn)染后24、48和72 h明顯受抑制。結(jié)論miR-92a通過上調(diào)CDX2基因的表達(dá)，抑制ENSCs的增殖，可能促進(jìn)HD發(fā)生、發(fā)展。

先天性巨結(jié)腸；循環(huán)型miR-92a；CDX2基因；腸神經(jīng)干細(xì)胞

先天性巨結(jié)腸（hirschsprung's disease，HD）是小兒外科常見的先天性消化道畸形[1]。有研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育過程中，腸神經(jīng)干細(xì)胞（enteric neural stem cells，ENSCs）通過不斷的遷移、增殖和分化，形成腸道的神經(jīng)系統(tǒng)，當(dāng)各種原因引起腸道神經(jīng)系統(tǒng)的正常形成時(shí)，將導(dǎo)致腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的變性或缺失，形成HD[2-3]。microRNA（miRNA）通過與靶基因mRNA的3’-UTR端特異性的堿基配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，在消化道的形成過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[4]，本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測miR-92a mRNA在HD患兒血清中的表達(dá)，體外分離和培養(yǎng)SD大鼠ENSCs，通過脂質(zhì)體在大鼠ENSCs內(nèi)過表達(dá)miR-92a，檢測miR-92a靶基因尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子-2（caudal-related homeobox transcription factor-2，CDX2）的變化，初步探討循環(huán)型miR-92a及其靶基因CDX2在HD發(fā)生、發(fā)展中的作用，從而為HD的診療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1主要材料

1.1.1臨床樣本選取2013年1月-2015年12月在臨沂市沂水中心醫(yī)院行先天性巨結(jié)腸根治術(shù)16例HD患兒的術(shù)前血清標(biāo)本作為觀察組。其中，男性9例，女性7例；平均年齡（1.30±0.29）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合HD的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；②術(shù)前未行藥物或手術(shù)治療；③術(shù)后病理檢查確診為HD。同期選擇10例健康體檢嬰兒作為對照組，其中男、女各5例，平均年齡（1.20±0.24）歲，兩組嬰兒的年齡和性別等人口基線特征具有可比性。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物孕15 d清潔級SD大鼠，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3主要試劑改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）/F12培養(yǎng)液（美國Hyclone公司），胎牛血清（江蘇杭州四季青公司），表皮生長因子（上海碧云天生物技術(shù)公司），堿性成纖維細(xì)胞生長因子、N2和B27購自美國Gibco公司，TRIzol RNA（美國Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒（福建福州邁新生物公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），鏈霉-青霉素（美國Gibco公司），聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），兔抗鼠Nestin抗體、兔抗鼠Tuj-1抗體、兔抗鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrg aciciic protein，GFAP）抗體、兔抗CDX2均購自美國Abcam公司，miR-92a（Gene ID：407 048，185 bp）、β-actin（Gene ID：11 461，148 bp）、CDX2（Gene ID：1 045，204 bp）引物均由上海生工生物工程股份服務(wù)有限公司合成。見附表。

附表miR-92a、β-actin、CDX2的引物序列

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1qRT-PCR檢測血清miR-92a mRNA的表達(dá)收集兩組外周靜脈血2 ml，室溫靜置10 min，800 r/min離心5 min，吸取上清液，按照mir VanaTMPARISTM kit試劑盒說明書純化血漿總RNA，取總RNA 500 ng，應(yīng)用日本TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：42℃預(yù)變性15 min，95℃變性2 min。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)。通過qRT-PCR儀特定軟件程序記錄并分析檢測數(shù)據(jù)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)公式Folds= 2-△△Ct計(jì)算各檢測目的基因的相對表達(dá)量，△△Ct=（Ct檢測基因-Ctβ-actin）實(shí)驗(yàn)組-（Ct檢測基因-Ctβ-actin）對照組。1.2.2ENSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定配置ENSCs培養(yǎng)液，每100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液中含90ml DMEM/F12培養(yǎng)液、1 ml N2添加劑、2 ml B27添加劑，皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子各2 ml（濃度均為20μg/L）、青霉素、鏈霉素各2 ml（100 IU/ml）、1 ml L-谷氨酰胺（2 mmol/L），完全培養(yǎng)液的配置則需加入10 ml胎牛血清。參照朱利斌[5]和LINDLEY等[6]建立的大鼠ENSCs分離方法，提取ENSCs，具體要點(diǎn)如下：孕15 d SD大鼠頸椎脫臼處死，腹部消毒后進(jìn)入腹腔，游離胎鼠腸管，剝離并剪碎腸管外縱肌，0.5mg/ml膠原酶4℃過夜消化，200目篩網(wǎng)過濾后，800 r/min離心5 min，棄去上清液，移液器吸取1～3 ml ENSCs培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，800 r/min離心5 min后棄去上清液，加入ENSCs完全培養(yǎng)液1～3 ml，并小心吹打細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1～5×106個(gè)/ml，接種到干細(xì)胞專用培養(yǎng)瓶，37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)，1～3 d半量換液1次，根據(jù)細(xì)胞生長情況及時(shí)傳代。選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，800 r/m離心5 min，取1 ml ENSCs培養(yǎng)液小心吹打細(xì)胞沉淀，制備成單細(xì)胞懸液，取0.1～0.5 ml單細(xì)胞懸液滴加到多聚賴氨酸處理過的蓋玻片，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片后，4%多聚甲醛室溫固定5～10 min，1%胎牛血清封閉10 min，分別加入Nestin（1∶100）、Tuj-1（1∶300）、GFAP抗體（1∶100），室溫孵育1 h，4℃過夜，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育2 h，免疫熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

1.2.3ENSCs分選和轉(zhuǎn)染選取處于對數(shù)生長期的ENSCs細(xì)胞，加入Nestin抗體5μg，4℃孵育30 min，與包被羊抗兔免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）免疫磁珠4℃孵育30 min，放入磁性細(xì)胞分離系統(tǒng)細(xì)胞分離柱內(nèi)，磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次，撤去磁場，再次沖洗，所得細(xì)胞即為Nestin+ENSCs，將分選后的ENSCs按1×105個(gè)/ml接種于6孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，將miR-92a mimics（轉(zhuǎn)染組）或Mimics control（陰性對照組）100 pmol與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 5μl充分混勻，室溫孵育30 min，將轉(zhuǎn)染混合物加入到含有ENSCs的6孔板中，室溫孵育6 h，加入ENSCs完全培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，未轉(zhuǎn)染的ENSCs作為空白對照組，Trizol試劑法提取3組細(xì)胞總RNA，qRT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-92a mRNA的表達(dá)。取3組細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染24、48和72h后，胰蛋白酶消化后接種于96孔板，每孔加入20μl無血清的噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]液（5mg/ml），放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)上清液，每孔加入150μl二甲基亞砜，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長處測定每孔光密度（optical delnsity，OD）值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值）× 100%。

1.2.4qRT-PCR、Western blot檢測miR-92a靶基因CDX2的表達(dá)實(shí)驗(yàn)開始前利用miRBase、Target Scan檢索miR-92a的堿基序列并預(yù)測其靶基因，結(jié)果顯示，CDX2是其可能的靶基因，取轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、空白對照組3組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)CDX2 mRNA的表達(dá)。收集3組細(xì)胞，利用無線電免疫沉淀（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗CDX2抗體（1∶300）4℃過夜，加辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶4 000），室溫條件下?lián)u動(dòng)2 h，顯色劑顯色，應(yīng)用英國Syngene公司的Gene Tools軟件分析CDX2蛋白的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較用t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析（One-way，ANOVA），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后，用SNK檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HD血清中miR-92a mRNA的表達(dá)

HD患兒血清中miR-92a mRNA的相對表達(dá)量為（23.50±4.66），對照組為（4.41±1.07），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.661，P=0.000），HD組患兒血清miR-92a mRNA的相對表達(dá)高于對照組。見圖1。

圖1　兩組血清miR-92a mRNA的相對表達(dá)（±s）

2.2ENSCs的培養(yǎng)和鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)第1天，培養(yǎng)瓶內(nèi)可見大量的細(xì)胞碎片，2～4d細(xì)胞數(shù)量開始增多，可見球形細(xì)胞團(tuán)塊，5～7d出現(xiàn)神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)（neurosphere-like bodies，NLBs），8～10 d可見懸浮生長的腸神經(jīng)球。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞表面逐漸形成細(xì)長突起，并與周圍細(xì)胞之間形成蛛網(wǎng)狀連接。免疫學(xué)鑒定結(jié)果顯示，NLBs樣球形結(jié)構(gòu)形成早期Nestin染色陽性，細(xì)胞表面逐漸形成細(xì)長突起，細(xì)胞間形成蛛網(wǎng)狀連接后，Tuj-1、GFAP染色陽性，表明NLBs樣球形結(jié)構(gòu)具有神經(jīng)干細(xì)胞的特性，能夠分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在形成NLBs樣球形結(jié)構(gòu)過程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，Nestin+細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例越多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.364，P=0.000）。見圖2。

圖2　ENSCs的培養(yǎng)和鑒定

2.3轉(zhuǎn)染后ENSCs內(nèi)miR-92a mRNA的表達(dá)及對細(xì)胞增殖影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后ENSCs內(nèi)miR-92a mRNA的相對表達(dá)為（2.447±0.529），陰性對照組為（0.119±0.0317），空白對照組為（0.122±0.0276），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96.103，P=0.000），轉(zhuǎn)染組高于陰性對照組（0.119±0.0317）和空白對照組（0.122±0.0276）。兩兩比較，經(jīng)SNK檢驗(yàn)，轉(zhuǎn)染組高于陰性對照組（q=9.709，P=0.000）和空白對照組（q=9.968，P=0.000）；陰性對照組與空白對照組的miR-92a mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q= 0.664，P=0.877）。MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，miR-92a過表達(dá)對ENSCs細(xì)胞抑制率分別為（43.6±9.42）%、（38.4±6.71）%和（18.5±4.11）%，陰性對照組分別為（5.3±0.85）%、（3.7±0.66）%和（3.5±0.62）%，經(jīng)SNK檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q= 15.331、10.472和19.028，P=0.000），轉(zhuǎn)染組24、48和72 h的ENSCs細(xì)胞抑制率高于陰性對照組。見圖3。

圖3　轉(zhuǎn)染后ENSCs內(nèi)miR-92a mRNA的表達(dá)及對細(xì)胞增殖影響（±s）

2.4轉(zhuǎn)染后ENSCs內(nèi)CDX2的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后ENSCs內(nèi)CDX2 mRNA的相對表達(dá)為（13.024±3.882），高于陰性對照組（1.103±0.0439）和空白對照組（1.085± 0.0396），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.212，P=0.000）。Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后ENSCs內(nèi)CDX2蛋白表達(dá)增加，蛋白表達(dá)水平為（0.436±0.0828），高于陰性對照組（0.139±0.0308）和空白對照組（0.145±0.0325），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.793，P=0.000），轉(zhuǎn)染組CDX2蛋白的表達(dá)高于陰性對照組（q=8.532，P= 0.000）和空白對照組（q=7.308，P=0.000），陰性對照組和空白對照組間CDX2蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.216，P=0.736）。見圖4。

圖4　Western blot檢測轉(zhuǎn)染后ENSCs內(nèi)CDX2蛋白的表達(dá)

3 討論

肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢共同構(gòu)成腸神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)腸道生理功能，研究發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元數(shù)量＞1×1010，腸道運(yùn)動(dòng)、感覺等生理功能的實(shí)現(xiàn)依賴于腸神經(jīng)元的相互作用[7]。結(jié)腸末端腸管神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的變性或缺失是HD發(fā)病的病理基礎(chǔ)[8]，大量研究證實(shí)，ENSCs是能夠特異性分化的單能干細(xì)胞，多種因素參與ENSCs向神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化的過程[9]。張飛[10]利用濃度為0.5%苯扎氯銨去除腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，制備無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的HD模型，與人HD在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、功能等特征無明顯差異，移植ENSCs后，結(jié)腸的神經(jīng)功能恢復(fù)，表明ENSCs異常的增殖、分化過程是導(dǎo)致HD的發(fā)病重要病因。

miRNA在胚胎發(fā)育及分化過程中發(fā)揮重要作用，既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-9、miR-128、miR-126通過靶向抑制元素1-沉默轉(zhuǎn)錄因子、抑制元素1-輔助沉默因子等調(diào)節(jié)基因調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化和增殖[11]。miR-92a是miR-17-92簇成員，參與調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞等干細(xì)胞的分化和增殖過程[12]，但對ENSCs的作用卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過檢測HD血清中miR-92a mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，HD患兒血清miR-92a mRNA表達(dá)是正常嬰兒的5倍，與TANG等[13]的結(jié)果相似，表明循環(huán)型miR-92a可能促進(jìn)HD的發(fā)生、發(fā)展。筆者從孕15 d清潔級SD大鼠的胎鼠腸管內(nèi)提取ENSCs，通過免疫熒光證實(shí)在ENSCs培養(yǎng)早期Nestin蛋白陽性，Nestin+細(xì)胞數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長也越多。當(dāng)NLBs開始形成棘狀突起后，Tuj-1、GFAP蛋白表達(dá)陽性。Nestin蛋白是鑒定神經(jīng)干細(xì)胞常用的標(biāo)志物，Tuj-1、GFAP蛋白分別是神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，表明NLBs具有神經(jīng)干細(xì)胞特性，能夠分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

CDX2基因位于染色體13q12-13，在胚胎發(fā)育、分化過程中促進(jìn)內(nèi)胚層向后腸的發(fā)育[14]，在胎兒期廣泛表達(dá)，在新生兒期表現(xiàn)出組織特異性，僅在腸道表達(dá)，過表達(dá)的CDX2具有抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖和限制分化的作用[15]。隨著生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，利用Target Scan等分析軟件是尋找miRNA靶基因常用方法，筆者通過利用miRBase、TargetScan檢索miR-92a的堿基序列并預(yù)測其靶基因，結(jié)果顯示CDX2是其可能的靶基因，通過脂質(zhì)體在ENSCs內(nèi)過表達(dá)miR-92a，CDX2表達(dá)上調(diào)，ENSCs的增殖活性亦明顯受抑制，表明miR-92a可能通過上調(diào)CDX2基因，抑制ENSCs的增殖，結(jié)合HD患兒miR-92a的表達(dá)情況，可以初步推測miR-92a上調(diào)CDX2基因的表達(dá)，可能促進(jìn)HD發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)的不足之處：①實(shí)驗(yàn)過程中未檢測HD患兒腸組織中miR-92a的表達(dá)及ENSCs的分布；②筆者僅通過Target Scan等軟件預(yù)測miR-92a的靶基因，通過在ENSCs內(nèi)過表達(dá)miR-92a亦證實(shí)miR-92a上調(diào)CDX2基因的表達(dá)，與李紅等[16]研究結(jié)果相同，但是未用熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)等靶基因分析手段加以證實(shí)；③CDX2基因的上調(diào)抑制ENSCs細(xì)胞的增殖活性，對ENSCs向神經(jīng)元的分化是否具有作用筆者未加探討，雖然已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA在神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中具有促進(jìn)或限制干細(xì)胞分化的特性，但是miR-92a對ENSCs分化過程是否存在限制或促進(jìn)作用，仍未可知，下一步的研究工作將對上述不足之處進(jìn)行探討研究。

綜上所述，HD患兒血清中miR-92a呈過表達(dá)。通過胎鼠腸管提取的ENSCs在細(xì)胞培養(yǎng)早期具有神經(jīng)干細(xì)胞特性，能夠分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，使ENSCs過表達(dá)miR-92a，CDX2基因表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞的增殖活性受到抑制，表明miR-92a通過上調(diào)CDX2基因的表達(dá)可能促進(jìn)HD的發(fā)生、發(fā)展過程，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Expression of serum microRNA-92a in Hirschsprung's disease and its role in up-regulation ofCDX2

Sheng-hua Qiu1,Jian Liu2,Yun-ping Chen2,Hong-na Guo2
(1.Department of Pediatric Surgery;2.Clinical Laboratory,Yishui Central Hospital of Linyi,Linyi,Shandong 276400,China)

Objective To investigate the expression of serum miR-92a in Hirschsprung's disease(HD)and its role in regulation ofCDX2and inhibition of enteric neural stem cells(ENSCs).Methods Serum miR-92a was detected by real-time PCR in 16 patients with Hirschsprung's disease from January 2013 to December 2015 in Yishui Central Hospital of Linyi.ENSCs were collected from SD rats of gestational day 15,and identified by immunological method.ENSCs were over-expressed with miR-92a using lipofectin transfection after being separated by magnetic activated cell sorting,and then the expression ofCDX2was valued by real-time PCR and Western blot.The cell proliferation activity was determined by MTT method.Results The level of serum miR-92a mRNA in the patients with Hirschsprung's disease was higher than that in the control group(t=12.661,P=0.000).Nestin was positively stained in the ENSCs of early culture stage,which also had the potential to differentiate into double positive cells with Tuj-1 and glial fibrillary acidic protein (GFAP).The over-expression of miR-92a in the ENSCs increased the level ofCDX2mRNA(F=47.212,P= 0.000)and protein(F=48.793,P=0.000)compared to the control group.Cell proliferation activity was inhibited at 24,48 and 72 h after transfection.Conclusions miR-92a may promote the occurrence and development of HD through up-regulation ofCDX2and consequent inhibition of ENSC proliferation.

Hirschsprung's disease;serum miR-92a;CDX2gene;enteric neural stem cell

R726

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.004

1005-8982（2016）21-0019-06

2016-05-06