毛亞男，王雯，王東，張波

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；2.空軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100142）

免疫抑制劑對(duì)酵母聚糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Dectin-1、Toll樣受體2及腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響

毛亞男1，王雯2，王東2，張波1

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；2.空軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100142）

目的研究霉酚酸酯和環(huán)孢素A對(duì)酵母聚糖（Zymosan A）誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞模式識(shí)別受體Dectin-1、Toll樣受體2（TLR2）表達(dá)及細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）釋放的影響。方法體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，分別給予不同濃度的霉酚酸酯、環(huán)孢素A預(yù)處理細(xì)胞24 h，再利用100μg/ml Zymosan A單獨(dú)刺激細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平的變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)上清液中TNF-α濃度的變化。結(jié)果Zymosan A單獨(dú)作用巨噬細(xì)胞Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平明顯上調(diào)，TNF-α濃度升高（P＜0.05）。Zymosan A作用于霉酚酸酯或環(huán)孢素A預(yù)處理24 h的巨噬細(xì)胞Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平較Zymosan A單獨(dú)作用組明顯下調(diào)，TNF-α分泌量減少（P＜0.05）。結(jié)論霉酚酸酯和環(huán)孢素A抑制巨噬細(xì)胞Dectin-1和TLR2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并下調(diào)TNF-α的釋放，降低機(jī)體對(duì)真菌病原體的清除能力，這可能是應(yīng)用霉酚酸酯和環(huán)孢素A引起難控性真菌感染的機(jī)制之一。

霉酚酸酯；環(huán)孢素A；酵母聚糖；模式識(shí)別受體；細(xì)胞因子

免疫抑制劑被廣泛應(yīng)用于自身免疫病及移植抗宿主病的預(yù)防和治療，目的在于控制免疫反應(yīng)的加劇[1]。然而長(zhǎng)期接受大劑量免疫抑制劑治療，機(jī)體免疫功能遭到嚴(yán)重破壞，對(duì)外界病原菌的抵抗力減弱，極易發(fā)生難以控制的感染性疾病，尤其是侵襲性真菌感染，嚴(yán)重威脅免疫抑制患者的生存。巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）區(qū)分自我和非我，識(shí)別并結(jié)合微生物表面病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）啟動(dòng)快速的天然免疫防御反應(yīng)，進(jìn)而觸發(fā)持久的特異性的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[2]，介導(dǎo)機(jī)體對(duì)致病真菌的殺滅和清除。環(huán)孢素A和霉酚酸酯是臨床最常用的兩種免疫抑制劑，與真菌感染的發(fā)病率和死亡率有著密切的聯(lián)系。本研究通過(guò)體外模擬真菌感染試驗(yàn)，觀察環(huán)孢素A和霉酚酸酯對(duì)酵母聚糖（Zymosan A）誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞Dectin-1、Toll樣受體2（Toll-like receptors 2，TLR2）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）表達(dá)的影響，從模式識(shí)別水平探討環(huán)孢素A、霉酚酸酯與真菌感染之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物公司細(xì)胞庫(kù)。復(fù)蘇細(xì)胞，用含10%新生牛血清的洛斯維·帕克紀(jì)念研究所（roswell park memorial institute，RPMI）1640培養(yǎng)基在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng)，0.25%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）胰蛋白酶消化傳代2～3次后，以1×105個(gè)/ml密度接種于35 mm培養(yǎng)皿。

1.2主要試劑

Zymosan A購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR Mixture購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，抗小鼠PE-Dectin-1抗體、抗小鼠PE-TLR2抗體購(gòu)自德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司，TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，霉酚酸酯、環(huán)孢素A購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分霉酚酸酯+Zy組、環(huán)孢素A+Zy組、陽(yáng)性對(duì)照組（Zy組）和空白對(duì)照組，其中霉酚酸酯+Zy組、環(huán)孢素A+Zy組又分為低濃度、中濃度和高濃度3個(gè)組別。具體步驟如下：①向各實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)皿中分別加入霉酚酸酯（0.10、0.25和0.50μg/ml）或環(huán)孢素A（2.5、5.0和10.0μg/ml）預(yù)處理；陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基，24 h后棄凈原培養(yǎng)基。②空白對(duì)照組給予等量完全培養(yǎng)基，其余各組分別加入100μg/ml Zymosan A刺激細(xì)胞[3]。

1.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Dectin-1、TLR2 mRNA表達(dá)

Zymosan A干預(yù)后4 h后，按照超純RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度。按照世紀(jì)康為HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。引物合成由上海生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)完成，序列如下：①Dectin-1正向引物：5'-AGACTTCAGCACTCAAGACATCCA-3'，反向引物：5'-CAGGATTCCTAAACCCACTGCAA-3'；②TLR2正向引物：5'-CCCACTTCAGGCTCTTTGAC-3'，反向引物：5'-GCCACTCCAGGTAGGTCTTG-3'；③脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）；④髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）；⑤β-actin正向引物：5'-TGAAGATCAAGATCATTGCT CCTCC-3'，反向引物：5'-CTAGAAGCATTTGCGGTG GACGATG-3'。待反應(yīng)結(jié)束后，采用2-△△CT進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Dectin-1、TLR2蛋白的表達(dá)

Zymosan A作用細(xì)胞3和6h后，用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至流式管中，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后重懸細(xì)胞，分別加5μl抗小鼠PE-Dectin-1抗體和抗小鼠PE-TLR2抗體，室溫避光20min進(jìn)行熒光標(biāo)記染色，PBS漂洗離心，棄掉殘余抗體，上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）。

1.6ELISA檢測(cè)TNF-α的表達(dá)

Zymosan A作用細(xì)胞12 h后收集上清液，按照TNF-α試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)各組上清液中TNF-α的濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，多組間的兩兩比較用Bonferroni法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1霉酚酸酯、環(huán)孢素A對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞Dectin-1和TLR2 mRNA表達(dá)的影響

Zymosan A單獨(dú)RAW264.7巨噬細(xì)胞4 h后Dectin-1（1.757±0.020）和TLR2（2.970±0.649）表達(dá)水平與空白對(duì)照組（1.000±0.000）比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=99.546和74.816，P=0.000），Zymosan A上調(diào)巨噬細(xì)胞Dectin-1和TLR2的轉(zhuǎn)錄。就Dectin-1和TLR2 mRNA表達(dá)水平而言，霉酚酸酯0.10μg/ml+Zy組、霉酚酸酯0.25μg/ml+Zy組、霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy組、Zy組4組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.652和54.953，P=0.000）。環(huán)孢素A 2.5μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 5.0μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 10.0μg/ml+Zy組、Zy組Dectin-1和TLR2 mRNA表達(dá)水比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=138.202和34.434，P=0.000）。應(yīng)用中、高濃度的霉酚酸酯和環(huán)孢素A預(yù)先處理RAW264.7巨噬細(xì)胞再受到Zymosan A刺激后，與單獨(dú)應(yīng)用Zymosan A刺激組比較，經(jīng)Bonferroni法檢驗(yàn)，Dectin-1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）；3種濃度的霉酚酸酯和環(huán)孢素A預(yù)處理細(xì)胞后均能下調(diào)Zymosan A誘導(dǎo)的TLR2 mRNA的表達(dá)水平（P＜0.05）。見(jiàn)圖1和表1、2。

圖1　霉酚酸酯、環(huán)孢素A對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞Dectin-1、TLR2 mRNA表達(dá)的影響（n=6±s）

2.2霉酚酸酯、環(huán)孢素A對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞Dectin-1和TLR2蛋白表達(dá)的影響

空白對(duì)照組Dectin-1蛋白免疫熒光強(qiáng)度為（32.483±2.597），ZymosanA單獨(dú)刺激小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞3 h后Dectin-1蛋白免疫熒光強(qiáng)度為（47.060±3.310），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 6.746，P=0.003），Zymosan A促進(jìn)細(xì)胞表面Dectin-1蛋白表達(dá)。霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 10.0μg/ml+Zy組、Zy組的Dectin-1蛋白MFI比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.109，P=0.000）。預(yù)先給予0.50μg/ml霉酚酸酯或10.0μg/ml環(huán)孢素A處理后，再受到Zymosan A刺激的RAW264.7細(xì)胞表面Dectin-1蛋白熒光強(qiáng)度分別為（22.967±2.098）和（23.193±2.852），低于Zymosan A單獨(dú)刺激組（P＜0.01）。給予Zymosan A單獨(dú)作用6 h后，巨噬細(xì)胞表面TLR2免疫熒光強(qiáng)度（776.453±29.847）高于空白對(duì)照組（549.153±35.424），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 15.018，P=0.003）；霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 10.0μg/ml+Zy組、Zy組的TLR2蛋白MFI比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.434，P= 0.000）。MMF 0.50μg/ml+Zy組和CsA10.0μg/ml+ Zy組的TLR2免疫熒光強(qiáng)度分別為（578.697±25.382）和（597.763±25.113），與Zymosan A單獨(dú)作用組比較，經(jīng)Bonferroni法檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2和表3、4。

表1　霉酚酸酯對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2 mRNA表達(dá)的影響（n=6±s）

表1　霉酚酸酯對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2 mRNA表達(dá)的影響（n=6±s）

注：P1：與Zy組的Dectin-1 mRNA比較；P2：與Zy組的TLR2 mRNA比較

組別Dectin-1 mRNAP1值TLR2 mRNAP2值Zy組1.757±0.020-2.970±0.649-MMF 0.10μg/ml+ Zy組1.578±0.2611.0001.846±0.1690.000 MMF 0.25μg/ml+ Zy組1.013±0.2760.0001.368±0.2130.000 MMF 0.50μg/ml+ Zy組1.063±0.3430.0011.530±0.3250.000

表2　環(huán)孢素A對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2 mRNA表達(dá)的影響（n=6±s）

表2　環(huán)孢素A對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2 mRNA表達(dá)的影響（n=6±s）

注：P1：與Zy組的Dectin-1 mRNA比較；P2：與Zy組的TLR2 mRNA比較

組別Dectin-1 mRNAP1值TLR2 mRNAP2值Zy組2.009±0.209-1.980±0.162-CsA 2.5μg/ml+ Zy組1.751±0.2740.1381.678±0.2220.018 CsA 5.0μg/ml+ Zy組0.907±0.1100.0001.303±0.0780.000 CsA 10.0μg/ml+ Zy組0.118±0.0380.0011.151±0.1280.000

圖2　霉酚酸酯、環(huán)孢素A對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞Dectin-1和TLR2蛋白的影響

2.3霉酚酸酯、環(huán)孢素A對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響

空白對(duì)照組可檢測(cè)到低水平TNF-α[（720.450± 61.642）pg/ml]，Zymosan A共培養(yǎng)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌TNF-α水平為（1 908.752±32.070）pg/ml，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=34.203，P=0.003），Zymosan A能夠促進(jìn)TNF-α的表達(dá)。霉酚酸酯0.10μg/ml+Zy組、霉酚酸酯0.25μg/ml+Zy組、霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A2.5μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 5.0μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 10.0μg/ml+Zy組與、Zy組的TNF-α分泌水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=675.899，P=0.000）。不同濃度的環(huán)孢素A和霉酚酸酯均能抑制Zymosan A誘導(dǎo)的TNF-α的釋放水平，其中大劑量的環(huán)孢素A（10.0μg/ml）抑制作用最為明顯。見(jiàn)圖3和表5。

表3　Zymosan（100μg/ml）對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)Dectin-1、TLR2蛋白MFI的影響（n=3±s）

表3　Zymosan（100μg/ml）對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)Dectin-1、TLR2蛋白MFI的影響（n=3±s）

注：t1、P1：與空白對(duì)照組的Dectin-1蛋白比較；t2、P2：與空白對(duì)照組的TLR2蛋白比較

組別Dectin-1蛋白t1值P1值TLR2蛋白t2值P2值空白對(duì)照組32.483±2.5976.7460.003549.153±35.42415.0180.003 Zy組47.060±3.310776.453±29.847

表4　霉酚酸酯、環(huán)孢素A（μg/ml）對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2蛋白MFI的影響（n=3±s）

表4　霉酚酸酯、環(huán)孢素A（μg/ml）對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2蛋白MFI的影響（n=3±s）

注：P1：與Zy組的Dectin-1蛋白比較；P2：與Zy組的TLR2蛋白比較

組別Dectin-1蛋白P1值TLR2蛋白P2值Zy組47.060±3.310-776.453±29.847-MMF 0.50μg/ml+Zy組22.967±2.0980.000578.697±25.3820.000 CsA10.0μg/ml+Zy組23.193±2.8520.000597.763±25.1130.000

圖3　霉酚酸酯對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-α分泌的影響（n=4±s）

表5　霉酚酸酯、環(huán)孢素A對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)TNF-α（pg/ml）分泌的影響（n=4，pg/ml±s）

表5　霉酚酸酯、環(huán)孢素A對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)TNF-α（pg/ml）分泌的影響（n=4，pg/ml±s）

注：P1：與Zy組比較；P2：與CsA 10.0μg/ml+Zy組比較

組別TNF-αP1值P2值Zy組MMF 0.10μg/ml+Zy組1 908.752±32.070 1 714.344±26.852 --0.0000.000 MMF 0.25μg/ml+Zy組MMF 0.50μg/ml+Zy組1 701.978±41.446 1 706.031±26.786 0.000 0.000 0.000 0.000 CsA 2.5μg/ml+Zy組1 665.385±17.1970.0000.000 CsA 5.0μg/ml+Zy組1 744.354±25.4090.0000.000 CsA 10.0μg/ml+Zy組449.482±70.6390.0000.000

3 討論

免疫抑制劑的應(yīng)用為器官移植后的抗宿主排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、非自身免疫性疾病，如腫瘤和過(guò)敏性疾病等的預(yù)防及治療提供了有效的方法和手段[4]。然而，因免疫功能過(guò)度受損引發(fā)的感染性疾病，尤其是侵襲性真菌感染，一直是免疫抑制人群面臨的重要問(wèn)題。盡管新的抗真菌藥物已被研發(fā)出來(lái)，但是因?yàn)樵缙谠\斷困難，病情進(jìn)展速度快，且發(fā)病率和病死率呈逐年攀升趨勢(shì)，因此侵襲性真菌病仍嚴(yán)重威脅著免疫低下患者的生存。

外來(lái)病原體入侵機(jī)體時(shí)，啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)形成穩(wěn)固復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)清除致病真菌。巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)中的“前哨兵”。通過(guò)細(xì)胞表面或內(nèi)部的PRRs識(shí)別暴露于病原微生物表面的PAMPs，啟動(dòng)快速有機(jī)的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分泌大量炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，驅(qū)動(dòng)并局限中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到達(dá)感染部位，觸發(fā)細(xì)胞的吞噬作用、呼吸爆發(fā)等功能，進(jìn)而啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體對(duì)真菌病原體的清除[5-6]。大量研究發(fā)現(xiàn)，與真菌感染密切相關(guān)的PPRs，主要涉及C型凝集素受體家族（C-type lectin family，CLRs）和Toll樣受體家族[7]，其中尤以Dectin-1和TLR2的研究最為廣泛，是近年來(lái)真菌相關(guān)免疫識(shí)別機(jī)制的研究熱點(diǎn)。

Zymosan A來(lái)源于釀酒酵母細(xì)胞壁，富含β-葡聚糖和甘露聚糖，常被用來(lái)模擬體外真菌感染的免疫學(xué)研究。Dectin-1和TLR2協(xié)同參與Zymosan A的免疫識(shí)別過(guò)程，通過(guò)激活下游的Syk和MyD88信號(hào)通路，最終導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子活性增強(qiáng)并釋放大量的細(xì)胞因子TNF-α，協(xié)同放大炎癥反應(yīng)[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Zymosan A刺激小鼠巨噬細(xì)胞的早期，可顯著上調(diào)受體Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α的釋放，最終誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

環(huán)孢素A和霉酚酸酯目前是腎移植患者術(shù)后最常用的兩種免疫抑制劑，在減少移植物抗宿主反應(yīng)促進(jìn)移植術(shù)后移植物存活的同時(shí)，也往往能夠引起患者感染癥狀加重，甚至發(fā)生難控性真菌感染，引起病死率顯著升高。目前，有關(guān)環(huán)孢素A和霉酚酸酯對(duì)病原體識(shí)別過(guò)程的影響，具體機(jī)制尚不清楚。特異性T淋巴細(xì)胞功能調(diào)節(jié)藥環(huán)孢素A，能夠選擇性抑制T淋巴細(xì)胞相關(guān)因子如IL-2、TNF-α的分泌，同時(shí)削弱宿主的體液/細(xì)胞免疫。此外，環(huán)孢素A發(fā)揮免疫抑制功能的具體機(jī)制可能也涉及到模式識(shí)別水平。GREENBLATT等[9]認(rèn)為，環(huán)孢素A通過(guò)抑制Dectin-1通路下調(diào)細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，來(lái)調(diào)控對(duì)中性粒細(xì)胞的抗真菌免疫功能，而與TLR2/Myd88通路無(wú)關(guān)，并由此得出Dectin-1是環(huán)孢素A作用機(jī)制的上游元件。洪英禮等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到，與空白對(duì)照組大鼠比較，皮下注射環(huán)孢素A的大鼠TLR2和TLR4 mRNA和蛋白水平明顯升高。而本研究結(jié)果則顯示，中濃度和高濃度的環(huán)孢素A能夠抑制Zymosan A激活Dectin-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，低、中、高3種濃度的環(huán)孢素A均能下調(diào)Zymosan A誘導(dǎo)的TLR2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，且具有一定的劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，環(huán)孢素A能夠抑制Zymosan A誘導(dǎo)的TNF-α的釋放，大劑量的環(huán)孢素作用尤為明顯。由此筆者推測(cè)環(huán)孢素A能同時(shí)抑制Dectin-1/Syk和TLR2/Myd88信號(hào)通路，抑制炎癥細(xì)胞因子TNF-α的分泌。霉酚酸酯是一種具有抗代謝功能及強(qiáng)效免疫抑制功能的霉酚酸半合成物，其有效活性成分為霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）。前期研究發(fā)現(xiàn)，霉酚酸酯主要通過(guò)抑制T/B淋巴細(xì)胞增殖，并減少B淋巴細(xì)胞分泌相關(guān)抗體發(fā)揮強(qiáng)效、選擇性的免疫抑制功能[11]，而關(guān)于霉酚酸酯是否影響機(jī)體模式識(shí)別功能的文獻(xiàn)報(bào)道十分罕見(jiàn)。本研究結(jié)果表明，與同環(huán)孢素作用相似，霉酚酸酯也能夠下調(diào)正常狀態(tài)細(xì)胞Dectin-1、TLR2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，對(duì)Zymosan A誘導(dǎo)的Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白的表達(dá)也表現(xiàn)出一定的抑制作用，降低TNF-α的釋放水平，從而抑制機(jī)體免疫防御機(jī)制被激活。

筆者推測(cè)霉酚酸酯和環(huán)孢素A通過(guò)下調(diào)激活狀態(tài)下的模式識(shí)別受體Dectin-1和TLR2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，抑制巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子TNF-α的釋放，導(dǎo)致機(jī)體處于免疫耐受狀態(tài)，降低機(jī)體對(duì)真菌病原體的敏感性，無(wú)法有效地清除入侵的真菌病原體，這可能是免疫抑制劑霉酚酸酯和環(huán)孢素A誘導(dǎo)感染加重，甚至難控性侵襲性真菌感染的發(fā)病機(jī)制之一。除環(huán)孢素A和霉酚酸酯外，其他種類免疫抑制劑誘發(fā)真菌感染的發(fā)病機(jī)制是否與調(diào)節(jié)Dectin-1和TLR2信號(hào)通路的激活相關(guān)，尚需要體內(nèi)外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。通過(guò)探討免疫抑制劑在受體識(shí)別過(guò)程中的重要靶點(diǎn)，揭示免疫抑制劑加重真菌感染的具體發(fā)病機(jī)制，為將來(lái)研究預(yù)防和控制免疫抑制患者并發(fā)真菌感染的靶向藥物，改善臨床預(yù)后提供一定的理論和實(shí)踐意義。

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（童穎丹 編輯）

Effect of immunosuppressants on Zymosan A-induced expressions of Dectin-1,TLR2 and TNF-alpha in macrophages

Ya-nan Mao1,Wen Wang2,Dong Wang2,Bo Zhang1
(1.Anhui Medical University,Hefei,Anhui 230032,China;2.Department of Respiratory Medicine,General Hospital of Chinese Air Force,Beijing 100142,China)

Objective To study the effects of Mycophenolate mofetil and Cyclosporin A on Zymosan A-induced expressions of Dectin-1,Toll-like receptor 2(TLR2)and tumor necrosis factor alpha(TNF-α)in RAW264.7 macrophages.Methods Duringin vitroculture,RAW264.7 macrophages were pre-treated with different dosages of Mycophenolate mofetil and Cyclosporine A for 24 h,and then stimulated with 100 μg/ml of Zymosan A alone.RT-PCR was used to detect the expressions of Dectin-1 and TLR2 mRNAs in RAW264.7 macrophages and flow cytometry was used to detect the average fluorescence intensity of Dectin-1 and TLR2proteins.TNF-α level was measured by enzyme-linkedimmunosorbentassay.ResultsThe expressions of Dectin-1 and TLR2 mRNAs and proteins,as well as the concentration of TNF-α increased significantly in the Zymosan A+macrophage group(P＜0.05).Mycophenolate mofetil and Cyclosporin A inhibited the expressions of Zymosan A-induced Dectin-1 and TLR2 mRNAs and proteins in various degrees and reduced the secretion of cytokine TNF-α(P＜0.05).Conclusions Mycophenolate mofetil and Cyclosporin A reduce the transcription and translation of Dectin-1 and TLR2 and the secretion of the inflammatory cytokine TNF-α induced by Zymosan A,aggravating infection by inhibiting the body's ability to recognize and remove the fungal pathogens.It is probably one of the key mechanisms that Mycophenolate mofetil andCyclosporin A cause refractory fungal infection.

Mycophenolate mofetil;Cyclosporin a;Zymosan a;pattern-recognition receptors;cytokine

R96

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.003

1005-8982（2016）21-0013-06

2016-04-06

張波，E-mail：zhangbohuxi@sina.com