張 波 王志萍 米惠廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001南寧市明秀東路179號(hào)

馮 橋 廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院530001

王 勤 王孝勛 廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001

·中藥方劑·

HPLC法測(cè)定蝦康健中虎杖苷的含量

張 波 王志萍*米惠廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001南寧市明秀東路179號(hào)

馮 橋 廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院530001

王 勤 王孝勛 廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001

目的：建立蝦康健中虎杖苷的含量測(cè)定方法。方法：采用HPLC法，以島津InertsilODS－3柱為色譜柱（5μm，4.6mm×250mm），流動(dòng)相為乙腈∶水（22∶78），體積流量為1ml／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm，柱溫為30℃。結(jié)果：虎杖苷進(jìn)樣量在0.015～1.600 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，Y＝3×106X－69 226，r2＝0.99952；平均加樣回收率為98.95%，RSD＝1.23%（n＝6）；三批蝦康健的虎杖苷含量分別為0.7991mg／g、0.7943mg／g、0.7911mg／g。結(jié)論：本研究建立的HPLC法可用于蝦康健中虎杖苷的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。

HPLC；蝦康??；虎杖苷；含量測(cè)定

蝦康健是本課題組研究開(kāi)發(fā)的中藥新制劑，由板藍(lán)根、虎杖、茵陳、羅漢果等組成，試用于南美白對(duì)蝦的人工養(yǎng)殖，結(jié)果能顯著提高南美白對(duì)蝦的存活率，同時(shí)能促進(jìn)對(duì)蝦生長(zhǎng)。由于湯劑使用不便，本課題組對(duì)方中的中藥進(jìn)行提純并制成粉劑。虎杖為方中的主要藥材之一，其主要成分虎杖苷具有活血定痛、清利濕熱、抗菌、抗炎、促進(jìn)微循環(huán)作用［1－4］。因此，本研究選擇虎杖苷作為含量測(cè)定指標(biāo)，參考相關(guān)文獻(xiàn)［5－6］，采用HPLC法測(cè)定蝦康健中虎杖苷的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters e2695高效液相色譜儀（沃特世公司）；EL104電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥蝦康健由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)分別為20150722、20150723、20150724；虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)為111575－200502，純度≥98%；乙腈色譜純?yōu)槟斯煞輧珊瞎井a(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱為島津Inertsil ODS－3色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250mm），流動(dòng)相為乙腈∶水（22∶78），體積流量為1 ml／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl；理論板數(shù)按虎杖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的虎杖苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 ml棕色量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，制備對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，然后稀釋成0.0150 mg／ml虎杖苷對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備取蝦康健約1 g，精密稱定，置于25 ml具塞錐形瓶中，加甲醇溶解，稱重，超聲處理（300 W，40 kHz）使充分溶解，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失重量，過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備按蝦康健處方比例稱取缺虎杖的其他藥材，根據(jù)蝦康健生產(chǎn)工藝制備成缺虎杖藥材的陰性對(duì)照制劑。再按2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。在上述色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μl進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。虎杖苷與相鄰峰完全分離，分離度均大于1.5，保留時(shí)間為9.1 min左右，陰性無(wú)干擾，理論塔板數(shù)不低于3 000。

2.5 線性關(guān)系考察取對(duì)照品溶液及對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，分別制備0.0015 mg／ml、0.0030 mg／ml、0.0060 mg／ml、0.0120 mg／ml、0.0225 mg／ml、0.0300 mg／ml、0.0800 mg／ml、0.1600 mg／ml的對(duì)照品溶液。按照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，各個(gè)濃度對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μl進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y＝3×106X－69 226，r2＝0.99952。結(jié)果表明，虎杖苷進(jìn)樣量在0.015～1.600 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)分別按照2.3項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)方法進(jìn)樣10 μl測(cè)定含量，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品溶液中虎杖苷的含量為0.0381 mg／ml，RSD＝0.92%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)同一供試品溶液分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h分別進(jìn)樣，按2.1項(xiàng)方法進(jìn)樣10 μl，結(jié)果虎杖苷平均峰面積為885 446，RSD＝1.43%（n＝8），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)取已知虎杖苷含量的蝦康健樣品（批號(hào)：20150722）6份，每份約4 g，精密稱定，再分別精密量取虎杖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出平均回收率為98.95%，RSD＝1.23%（n＝6），結(jié)果見(jiàn)表1。表明本方法的準(zhǔn)確度符合要求。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定按2.3項(xiàng)方法制備3批蝦康健供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件各進(jìn)樣10 μl測(cè)定，每批平行測(cè)定2次，計(jì)算3批蝦康健制劑中虎杖苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 虎杖苷含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）

3 討論

本研究參照文獻(xiàn)［7－12］的方法建立蝦康健制劑中虎杖苷的含量測(cè)定方法，曾擬定流動(dòng)相為乙腈∶水（23∶77），結(jié)果所出峰形有拖尾現(xiàn)象。通過(guò)反復(fù)對(duì)比與調(diào)整，當(dāng)乙腈∶水比例為22∶78時(shí)，峰形對(duì)稱，分離效果好，出峰時(shí)間適宜，陰性無(wú)干擾。因此，確定流動(dòng)相比例為乙腈∶水（22∶78）。

本研究建立的HPLC法可用于測(cè)定蝦康健中虎杖苷的含量，方法穩(wěn)定、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可為蝦康健的定量分析提供一種科學(xué)方法。

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（2016－05－06收稿/編輯陳明偉）

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