周 康，李宗明，李江華，董 俊，郭利偉，田永祥，陳煥春，劉國平,

（1.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，荊州434025；2.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430070；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢430070）

·研究論文·

豬鏈球菌II型五種感染途徑感染豬模型的比較

周 康1，李宗明1，李江華2，董 俊1，郭利偉1，田永祥3，陳煥春2，劉國平1,2

（1.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，荊州434025；2.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430070；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢430070）

為研究豬鏈球菌2型感染豬的發(fā)病進(jìn)程，選擇24 頭28日齡杜長大敗血波氏桿菌陽性豬，分別采用皮下、肌肉、靜脈、鼻腔、胸腔5種途徑感染實(shí)驗(yàn)豬，豬鏈球菌2型山東株劑量為60億CFU，同時設(shè)立生理鹽水對照組，試驗(yàn)期為30 d。觀察感染豬的臨床癥狀和病理變化，并對各臟器進(jìn)行細(xì)菌記數(shù)。結(jié)果表明，除鼻腔外的4種感染模式均復(fù)制出了豬鏈球菌2型的感染癥狀，細(xì)菌計數(shù)結(jié)果印證了感染模型。細(xì)菌計數(shù)結(jié)果提示血液、肺臟組織及腦是豬鏈球菌2型易增殖部位，肺臟可能是呼吸道傳播模式致全身性感染的中轉(zhuǎn)站（上呼吸道-肺臟-全身性感染），所有致死豬均出現(xiàn)菌血癥。

豬鏈球菌2型；感染模式；比較

豬鏈球菌2型（Swine Streptococcus suis typeⅡ，Ss2）可引起豬和人的腦膜炎、敗血癥、肺炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性漿膜炎和突發(fā)性死亡[1]，是一種重要的人畜共患病病原菌[2]。Ss2可以產(chǎn)生多種毒力因子，也是鏈球菌中毒力最強(qiáng)、危害最深、流行最廣泛的一種血清型。Ss2感染在世界各地均有發(fā)生，已成為嚴(yán)重影響各國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要疫病[3]。2005年7月中國四川省爆發(fā)了Ss2感染，造成了200余人感染、38人死亡，此次疫病的爆發(fā)不僅給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也給人類健康帶來了巨大的威脅，引起了國內(nèi)外的高度重視。Ss2通常從口腔或鼻腔侵入機(jī)體，而后在扁桃體定居[4]，突破扁桃體及上呼吸道黏膜屏障后進(jìn)入血液循環(huán)[5]。通過游離狀態(tài)、黏附于吞噬細(xì)胞表面和吞噬于胞內(nèi)等方式和作用進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而引起腦膜炎及一系列炎癥反應(yīng)[6-8]。

動物模型的建立對于研究病原微生物的致病機(jī)制等有著非常重要的意義。豬鏈球菌2型動物致病性研究是個難題，現(xiàn)有的模型很多，但結(jié)果卻并不一致[7-9]。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)感染Ss2后，豬肺臟組織表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎，肺炎是Ss2感染后的一個非常重要的臨床癥狀。雖然呼吸道是豬Ss2傳播的主要傳播方式之一，但是Ss2感染導(dǎo)致肺炎的致病機(jī)理并不清晰。因此以本課題組采用成熟的豬鏈球菌2型山東株為致病菌株，對5種不同感染途徑的模型進(jìn)行了對比。豬敗血波氏桿菌是一種鼻腔常在菌，定居于鼻粘膜、呼吸道，與鏈球菌有協(xié)同作用。單一使用鏈球菌不易突破鼻粘膜上皮細(xì)胞，因此選擇豬敗血波氏桿菌陽性豬作為研究對象。同時，本研究對感染豬的主要靶器官的感染菌數(shù)量進(jìn)行量化，為豬鏈球菌2型致病機(jī)制的進(jìn)一步探索提供線索與工具。

1 材料與方法

1.1 菌株 豬鏈球菌2型山東株（SD）[10]及對照菌株：大腸桿菌、肺炎鏈球菌、支氣管敗血波氏桿菌[11]由本實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

1.2 酶及主要試劑 Taq DNA聚合酶購于大連TaKaRa公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購于杭州天和微生物試劑有限公司；TSA、TSB、NAD 購自上海生物工程公司；Ss2標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清、致敏紅細(xì)胞、DNA裂解液均由本實(shí)驗(yàn)室自行制備。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 分別采用間接血凝抑制試驗(yàn)和鼻拭子對山東省濟(jì)南市某種豬場的28日齡杜長大豬進(jìn)行Ss2的抗體和病原學(xué)檢測，挑選此2項(xiàng)指標(biāo)均為陰性的豬進(jìn)行試驗(yàn)。28日齡杜長大敗血波氏桿菌陽性豬，購自山東省濟(jì)南市某種豬場，由鼻拭子分離鑒定確定陽性。

1.4 菌株的增菌 TSA及TSB培養(yǎng)基按操作說明進(jìn)行制備。在無菌條件下，向含100 mL已滅菌的TSB的細(xì)菌瓶中按體積比加入5%的小牛血清。無菌挑取少許經(jīng)純化的鏈球菌在瓶內(nèi)壁靠近底部輕輕左右劃動數(shù)下，使細(xì)菌附著在瓶壁上，再把接種環(huán)浸在液體內(nèi)輕微振蕩幾次，洗掉環(huán)上的細(xì)菌，灼燒瓶口并封住。將細(xì)菌瓶放在磁力攪拌器上低速攪動2 min，使菌體均勻分布在液體中。然后將細(xì)菌瓶豎直固定于搖床中，200 r/min、37℃恒溫培養(yǎng)8 h。取上述重制備菌液采用活菌計數(shù)將原菌液稀釋至108CFU/mL。

1.5 DNA提取 將采集的豬鼻拭子樣品于含5%牛犢血清的TSB培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 h，取100 μL菌液500×g離心5 min，收集菌體，加100 μL裂解液A（主要含pH 8.0的10 mmol/L Tris-Hcl、5 mmol/L MgCl2；1% TritionX-100、0.32 mmol/L 蔗糖），振蕩均勻后，靜置10 min；10 800×g離心5 min，棄上清，向沉淀中加入50 μL DNA提取液B（主要含50 mmol/ L KCl、pH 8.0的10 mmol/L Tris-Hcl、100 μg/mL 蛋白酶 K），振蕩均勻，56℃ 溫育30 min使DNA盡量釋放；沸水浴10 min，立即置冰水混合物中冷卻，10 800×g離心2 min，取上清用無水乙醇抽提1次后，10 800×g離心10 min，上清作模板。

1.6 PCR檢測 檢測Ss2引物及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行；檢測支氣管敗血波氏桿菌引物及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.7 豬感染性試驗(yàn) 感染前觀察實(shí)驗(yàn)豬5 d，然后分別按皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、鼻腔接種和胸腔穿刺肺部注射5種模式進(jìn)行感染試驗(yàn)，接種劑量均為6 mL。作好標(biāo)記，記錄接種時間。感染后每日觀察1次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作出詳細(xì)記錄：注意豬的食欲、精神狀態(tài)以及接種部位的變化，同時注意體溫、呼吸、血壓等生理體征的變化。若發(fā)現(xiàn)瀕死的豬可前腔靜脈采血分離細(xì)菌。

1.8 感染豬的病理學(xué) 對感染豬進(jìn)行剖殺，觀察其病理變化。分離出腦、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟后依次稱重，分別各取1 g組織加滅菌生理鹽水10 mL進(jìn)行充分研磨，分別按倍比稀釋法依次稀釋至10-9、10-10、10-11、10-12、10-13濃度梯度，每個濃度梯度接種3個TSA平板，每個平板的接種量為100 μL，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后活菌計數(shù)。同時選取菌落生長均勻平板，隨機(jī)挑選20個菌落進(jìn)行PCR鑒定，對陽性菌落挑選2個進(jìn)行生化鑒定驗(yàn)證。計算感染菌占總菌量的百分比，從而得出感染菌的絕對數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察和生命體征的測定 實(shí)驗(yàn)豬接種菌液后，每天仔細(xì)記錄豬的臨床表現(xiàn)（表1）和體溫變化（表2）。在觀察期間死亡者，立即進(jìn)行解剖。在觀察時間到達(dá)后未死亡者，放血迫殺致死。

表1 感染豬的臨床癥狀Table1 The clinical symptoms of infected pigs

表2 感染期間各豬的體溫變化（℃）Table2 The temperature of each pigs during the infecting periods（℃）

從表中可以看出，Ss2很容易通過皮下、肌肉、靜脈注射3種模式引起實(shí)驗(yàn)豬發(fā)病。鼻腔接種則無明顯的變化，胸腔接種到后期時，實(shí)驗(yàn)豬才表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。這說明Ss2的感染與接種途徑之間有密切的關(guān)系。在d5各組豬的感染情況如下：皮下注射、肌肉注射、靜脈注射感染組全身呈現(xiàn)敗血癥癥狀，關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)癥狀和共濟(jì)失調(diào)等；靜脈注射組的豬開始出現(xiàn)死亡；鼻腔注射組的豬無明顯變化。

2.2 病理變化 預(yù)定觀察時間結(jié)束，對現(xiàn)有的感染豬進(jìn)行剖殺，未感染組各臟器未見明顯異常。各感染組豬的病理變化如表3、圖1所示。通過靜脈注射感染組的實(shí)驗(yàn)豬最先表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，如敗血癥、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)癥狀等，然后所有感染豬很快死亡。皮下注射、肌肉注射、靜脈注射感染組病理組織學(xué)表現(xiàn)大致相同，鼻腔感染組雖然未見全身性病變，但出現(xiàn)明顯的間質(zhì)性肺炎。具體的病理表現(xiàn)以靜脈注射組加以展示，詳見圖1。從圖中可以看出，靜脈注射組感染豬皮下出血，肌肉組織出血，各內(nèi)臟器官的主要病變是出血性變化，間質(zhì)性肺炎，彌漫性出血；心外膜條狀出血，內(nèi)膜有散在出血點(diǎn)；肝表面出血壞死、膽囊內(nèi)壁出血器官表面有大小不等的出血點(diǎn)，出血斑以及白色壞死灶；腎表面出血，脾邊緣梗死等。其他組別病理學(xué)表現(xiàn)見表3。

圖1 以靜脈注射來描述各臟器感染的病理變化Fig.1 The typical pathological changes of pigs infected with Ss2 by intravenous injection

2.3 各臟器中細(xì)菌數(shù)量的測定 各臟器的細(xì)菌數(shù)量測定結(jié)果詳見表4。在這5種感染模式中，除鼻腔接種外，其余4種感染模式均可對實(shí)驗(yàn)豬產(chǎn)生較強(qiáng)的致病力，原因在于Ss2可直接由感染部位進(jìn)入血液系統(tǒng)到達(dá)全身各處進(jìn)行增殖?？赡苡捎谑芨闻K、脾臟、腎臟的生理功能和其所處的生理環(huán)境的影響，在這些器官中，Ss2數(shù)量明顯很低，同時從細(xì)菌繁殖的數(shù)量看血液及腦更容易被Ss2攻擊。

3 討論

通過感染后豬的臨床癥狀、病理剖檢和細(xì)菌回收結(jié)果來看，本研究成功地從皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、胸腔穿刺等4個模式建立了Ss2對豬的感染模型。

表3 各組感染豬的病變情況Table3 The pathological changes of infected pigs

表4 各臟器中細(xì)菌數(shù)量（×109CFU/g）Table4 The numbers of bacteria in each organs

肺炎是Ss2感染中的一個非常重要的臨床癥狀，病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)感染Ss2后豬肺臟組織表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎[13]，本研究證實(shí)了這一點(diǎn)。通過胸腔注射肺部造模取得了成功，結(jié)合細(xì)菌計數(shù)和病理學(xué)表現(xiàn)。肺臟、血液及腦感染菌數(shù)量明顯高于其他臟器，這可能是因?yàn)椴≡诜闻K組織中大量增殖，分泌毒力因子，當(dāng)具備足夠的侵襲力后進(jìn)入血液循環(huán)，從而導(dǎo)致腦膜炎癥狀及全身性感染。有研究提示Ss2的莢膜多糖和溶血素能幫助細(xì)菌體逃避巨噬細(xì)胞的吞噬作用和天然免疫反應(yīng)[14,15]。肺臟中巨噬細(xì)胞與上皮細(xì)胞組成的屏障是Ss2的定植的場所，也是Ss2侵入血液的關(guān)鍵。

雖然鼻腔感染未造成全身性感染，但仍可導(dǎo)致典型的間質(zhì)性肺炎，病原分離證實(shí)肺炎由Ss2引起，結(jié)合肺部感染試驗(yàn)的結(jié)果，我們分析，鼻腔的局部感染可能并不導(dǎo)致全身性的感染，即便是和支氣管敗血波氏桿菌共同作用。當(dāng)鼻腔感染足夠量的Ss2時，病原菌通過上呼吸道感染至肺部，在肺部定居，增殖，進(jìn)入血液循環(huán)而導(dǎo)致全身性的感染。因此，在針對Ss2的防御體系中，包括鼻腔的上呼吸道的固有免疫力非常關(guān)鍵，這為我們進(jìn)一步研究Ss2的感染機(jī)制奠定基礎(chǔ)?？梢酝茰y當(dāng)鼻腔感染劑量足夠大時，可以建立全身性的感染模型。

通過細(xì)菌回收來描述各個臟器的感染程度，比較精確、客觀。有研究證明Ss2能大量定植在健康豬的扁桃體而不引起感染[16]，為本次研究提供了理論基礎(chǔ)，也為研究Ss2對豬的感染提供了一個優(yōu)良的量化模型。

本研究之所以采用波氏桿菌陽性豬為試驗(yàn)對象，是因?yàn)镾s2在沒有穿過黏膜上皮細(xì)胞毛細(xì)血管之前，一般不會引起感染。由于波氏桿菌首先在鼻腔粘膜上皮感染繁殖，波氏桿菌產(chǎn)生的毒素對上皮細(xì)胞具有損傷作用，可破壞鼻腔粘膜，導(dǎo)致黏膜屏障易被各種病原性因子突破等[17]、從而增加感染機(jī)會，與Ss2對豬的感染構(gòu)成了協(xié)同作用。

靜脈注射感染組的豬死亡最快，肌肉注射感染組的豬從d7開始出現(xiàn)死亡，皮下感染組從d11開始出現(xiàn)死亡。靜脈注射接種，Ss2直接進(jìn)入血液循環(huán)進(jìn)行繁殖，迅速到達(dá)全身各處引起菌血癥[18]；肌肉注射接種，Ss2首先進(jìn)入接種部位的毛細(xì)血管，這顯然比靜脈注射接種的死亡速度慢，但又由于肌肉的毛細(xì)血管比皮下組織中的毛細(xì)血管豐富，所以死亡進(jìn)度又比皮下接種快。在臨床中我們也觀察到，這3個感染模式中，每頭豬到后期均出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)癥狀如打轉(zhuǎn)、死亡前四肢劃水樣運(yùn)動，而且這些豬，大多數(shù)都有關(guān)節(jié)疼痛（觸之尖叫），結(jié)果在剖檢時都采集到大量的腦積液和關(guān)節(jié)液。而其他兩組的感染豬中這些現(xiàn)象不明顯。由此可作推斷，Ss2更容易通過血液傳播對豬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害。

通過皮下、肌肉、靜脈注射感染的豬很快表現(xiàn)出典型的臨床癥狀和病變特征并很快出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。通過胸腔接種的豬在d17時才出現(xiàn)典型的臨床癥狀和死亡情況。根據(jù)各臟器的細(xì)菌回收結(jié)果可以推斷，無論哪種感染模式，實(shí)驗(yàn)豬到后期都表現(xiàn)出嚴(yán)重的菌血癥變化。同時，根據(jù)從血液中回收細(xì)菌結(jié)果來看，除鼻腔感染外的4種感染模式組的豬到瀕死期都產(chǎn)生了嚴(yán)重的菌血癥。由此可以推斷，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)豬死亡的直接原因是菌血癥，即感染豬的死亡與菌血癥相關(guān)，而與Ss2的毒力因子沒有相關(guān)性，這也與Rougier等[19]、Tsai等[20]、Segura等[21]闡述的相互一致。然而，造成不同組織中病原菌的數(shù)量差異的精細(xì)化機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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COMPARISON OF FIVE INFECTION ROUTES OF STREPTOCOCUS SUIS TYPE 2 IN PIGS

ZHOU Kang1, LI Zong-ming1, LI Jiang-hua2, DONG Jun1, GUO Li-wei1, TIAN Yong-xiang3, CHEN Huan-chun2, LIU Guo-ping1,2
(1.College of Animal Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; 2.The Collaborative Innovation Center for Sustainable Pig Production, Wuhan 430070, China; 3.Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Hubei Academy of Agricultural Science, Wuhan 430070, China)

In order to investigate into the pathogenesis of Streptococcus suis typeⅡ(SS2), 24 pigs were inoculated with the bacteriaat 6×109CFU or physiological saline (control) via subcutaneous, intramuscular, intravenous, intranasal and pleural routes.The pigs were terminated in 30 days.The typical clinical signs were observed in four infection routes except intranasal route.More bacteria were found in blood, lungs and brains than other organs.Bacteremia was detected in all dead pigs.

Swine Streptococcus suis type2; infection routes; comparison

S852.61

A

1674-6422（2016）02-0035-07

2015-12-03

湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目資助（D20121205）

周康，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)；李宗明，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

劉國平，E-mail：hhaaiieerr@163.com