姜 盼，孫冰清，崔俊生，陶敏捷，丁云竹，薛亞飛，劉光清，胡青海

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

鴨疫里默氏桿菌假定溶血素相關(guān)蛋白基因Riean_0415的原核表達(dá)及溶血活性檢測

姜 盼，孫冰清，崔俊生，陶敏捷，丁云竹，薛亞飛，劉光清，胡青海

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

為了分析鴨疫里氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）假定的含CBS結(jié)構(gòu)域的溶血素相關(guān)蛋白（hypothetical hemolysinrelated protein，HRP）的功能，本研究根據(jù)血清10型鴨疫里氏桿菌HXb2株Riean_0415基因的核苷酸序列，設(shè)計了1對特異性引物，采用PCR擴增了Riean_0415基因，并進(jìn)行了序列測定與分析。然后將Riean_0415基因克隆到原核表達(dá)載體pET-43.1a，再用親和層析純化獲得誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白rHRP。溶血活性檢測結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白rHRP具有裂解鴨紅細(xì)胞的活性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究rHRP蛋白的功能和鴨疫里默氏桿菌的溶血機制等奠定了基礎(chǔ)。

鴨疫里默氏桿菌；溶血素相關(guān)蛋白；原核表達(dá)；溶血活性檢測

鴨疫里氏桿菌病是鴨疫里氏桿菌感染家鴨、鵝、火雞及其他家禽和野禽引起的一種接觸性傳染病，又稱為鴨傳染性漿膜炎，是當(dāng)前危害全世界養(yǎng)鴨業(yè)的一種主要疾病。病鴨死亡率高、消瘦、胴體品質(zhì)下降、疾病治療等給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1]。

目前對鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）的毒力相關(guān)基因還知之甚少，已經(jīng)確定的毒力基因只有OmpA[2]、TbdR1[3]和SIP[4]等少數(shù)幾個。有研究表明溶血素是細(xì)菌致病的重要毒力因子，在細(xì)菌致病過程中起著不容忽視的作用[5]。本實驗室測定了鴨疫里默氏桿菌HXb2株的全基因組序列（未發(fā)表），解析后發(fā)現(xiàn)其基因組中有假定的溶血素基因hrp。本研究對HXb2株假定的溶血素基因Riean_0415進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)和溶血活性分析，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和血清 鴨疫里默氏桿菌HXb2株（血清10型）由本實驗室分離、鑒定并保存；E.coli DH5a 及BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 載體、酶及主要試劑 本研究中用到的限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；Expand High Fedility PCR system 購自Roche公司；原核表達(dá)載體pET-43.1a （+）購自Novagen公司；pGEM-T easy載體、T4 DNA ligase購自Promega公司。

1.3 推測的溶血素相關(guān)蛋白基因Riean_0415的克隆和鑒定 根據(jù)鴨疫里氏桿菌血清10型HXb2 Riean_0415基因的序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了一對引物。上游引物P1：5'-ATCTGCAGATGGATCCCGA CAGTATAGTCAAAAT-3'；下游引物P2：5'-TACT CGAGTTAGTTAGCATTAGTACCTTCCCCCGA-3'。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

以提取的血清10型鴨疫里氏桿菌HXb2株基因組DNA為模板，用PCR擴增Riean_0415基因的ORF。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸2 min；30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物連接pGEM-T easy載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選、鑒定得到陽性重組質(zhì)粒命名為T-hrp。測序由上海華津生物技術(shù)有限公司完成，用DNAStar7.01軟件進(jìn)行序列分析。

1.4 假定溶血素相關(guān)基因Riean_0415重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用Bam HΙ和XhoΙ雙酶切T-hrp, 回收目的片段，與經(jīng)同樣酶切處理的pET-43.1a（+）原核表達(dá)載體連接，構(gòu)建得到重組的表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET43.1a-hrp。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將pET43.1a-hrp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組菌，37℃、200 r/min培養(yǎng)3 h，至OD600值約為0.6時，以終濃度為1 mmol/L的IPTG于37℃、150 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h，收集誘導(dǎo)后的菌體并超聲破碎，離心后分別收集上清液和沉淀，通過SDS-PAGE分析表達(dá)的重組蛋白的可溶性。重組蛋白的純化按照Novagen His-bind純化試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 重組蛋白HRP的溶血活性檢測 先配制含終濃度為5%鴨血液的胰酶大豆瓊脂固體培養(yǎng)基（TSA），用 PBS溶液將重組的HRP蛋白稀釋至不同濃度（0.60、0.30、0.15 mg/mL）。用打孔器在培養(yǎng)基上打孔后，吸取10 μL蛋白溶液滴至孔內(nèi)，放置到37℃、5% CO2培養(yǎng)24～36 h，觀察是否出現(xiàn)溶血圈。

2 結(jié)果

2.1 溶血素基因的克隆與序列測定 用PCR方法從鴨疫里氏桿菌HXb2株中擴增到了大小約1.3 kb的片段（圖1），克隆至T載體后測序。結(jié)果表明擴增片段大小為1353 bp，與我們已測定的HXb2株Riean_0415基因ORF序列一致，共編碼451個氨基酸。BLAST分析表明其編碼的蛋白含有TlyC (溶血素或相關(guān)蛋白，且含CBS結(jié)構(gòu)域，COG1253)、DUF21（pfam01595）、CBS_pair_CorC_HlyC_ assoc（cd04590）、CorC_HlyC（pfam03471和smart01091）和PRK11573等結(jié)構(gòu)域（圖2），提示此蛋白可能與鴨疫里默氏桿菌的溶血及鎂離子和鈷離子的轉(zhuǎn)運相關(guān)。

圖1 鴨疫里默氏桿菌HXb2株Riean_0415基因的PCR 擴增Fig.1 Amplifi cation of Riean_0415 gene by PCR from R.anatipestifer strain HXb2

圖2 鴨疫里默氏桿菌HRP蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 The conserved domains on the hemolysin-related protein of R.anatipestifer

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定 重組質(zhì)粒pET43.1a-hrp經(jīng)Bam HΙ和SphΙ雙酶切，得到7200 bp左右的載體條帶和1300 bp左右的目的條帶（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒pET43.1a-hrp的酶切鑒定Fig.3 Identifi cation of recombinant plasmid pET43.1a-hrp

2.3 Riean_0415基因的原核表達(dá) 收集重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET43.1a-hrp誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDSPAGE電泳，結(jié)果表明在 50 kDa左右有一條明顯的表達(dá)帶（圖4A）。表達(dá)的蛋白rHRP主要存在于裂解細(xì)菌的上清液中，說明重組的rHRP在大腸桿菌中以可溶性表達(dá)為主。以His抗體為檢測一抗進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示純化得到是HRP-His融合蛋白，且大小與預(yù)期一致。

2.4 表達(dá)的重組蛋白溶血活性檢測 由圖5可見，在鴨血平板上，0.6 mg/mL的重組rHRP蛋白可引起明顯的鴨紅細(xì)胞裂解，0.3 mg/mL的重組rHRP蛋白也可引起鴨紅細(xì)胞裂解，而0.15 mg/mL的重組rHRP蛋白未引起明顯的鴨紅細(xì)胞裂解。另一種重組蛋白Riean_0661、PBS和His對照孔周圍未出現(xiàn)溶血圈。

圖4 原核表達(dá)重組蛋白rHRP的SDS-PAGE (A) 和Western blot檢測Fig.4 Detection of rHRP expression by SDS-PAGE(A) and Western blot(B)

圖5 重組蛋白rHRP溶血活性檢測Fig.5 Hemolytic activity assay of recombinant protein rHRP

3 討論

溶血素在細(xì)菌中普遍存在，幾乎所有大腸桿菌O157菌株中均存在溶血素[6]，多數(shù)致病性葡萄球菌也能產(chǎn)生溶血素。對于很多病原細(xì)菌來說，溶血素是重要的毒力因子，是一種可以使靶細(xì)胞膜形成孔道的蛋白毒素。研究表明，金黃色葡萄球菌的Hla蛋白屬于穿孔毒素家族，在細(xì)胞表面形成七聚體破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，能夠快速裂解宿主紅細(xì)胞[7]。金黃色葡萄球菌的α-溶血素、大腸桿菌溶血素和肺炎鏈球菌的溶血素突變株在動物實驗中毒力明顯降低[8]，可能與其破壞宿主微生物入侵相關(guān)的成孔毒素相關(guān)[9]。Gaillard等[10]通過構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變株表明溶血素李斯特氏菌的一個重要毒力因子。

至今鴨疫里氏桿菌溶血素相關(guān)研究還未見報道。鴨疫里氏桿菌血清10型HXb2株是目前已知的對雛鴨致病性最強的鴨疫里默氏桿菌。本研究通過假定溶血素基因Riean_0415的原核表達(dá)和溶血活性分析后發(fā)現(xiàn)，重組rHRP蛋白具有裂解鴨紅細(xì)胞的活性。但該蛋白與鴨疫里氏桿菌的致病性之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。由于鐵離子是大多數(shù)細(xì)菌生長繁殖所必需的，參與到很多重要的生物學(xué)過程，而且紅細(xì)胞中含有豐富的鐵離子，因此我們推測，在宿主（如鴨）和鴨疫里默氏桿菌相互作用的過程中，鴨疫里默氏桿菌通過裂解宿主（鴨）的紅細(xì)胞來釋放鐵。同時，鴨疫里默氏桿菌的獲鐵系統(tǒng)可通過多種途徑來獲得鐵，以滿足其在鴨體內(nèi)迅速增殖所需要的鐵離子。前期本實驗室的研究也表明鴨疫里默氏桿菌的SIP（鐵載體相關(guān)作用蛋白）、TonB依賴受體[11]等都與鐵離子的轉(zhuǎn)運相關(guān)，且為鴨疫里默氏桿菌的重要的毒力因子。另外，本研究中制備的重組rHRP蛋白具有溶血活性，這一方面提示rHRP蛋白為鴨疫里默氏桿菌的一種溶血素，另一方面也為進(jìn)一步研究rHRP蛋白的功能和鴨疫里默氏桿菌的溶血機制等奠定了基礎(chǔ)。

[1] 程安春, 汪銘書, 汪開毓, 等.現(xiàn)代禽病診斷和防治全書[M].成都: 四川大學(xué)出版社, 1997: 181-186.

[2] Hu Q, Han X, Zhou X, et al.OmpA is a virulence factor of Riemerella anatipestifer[J].Vet Microbiol, 2011, 150(3): 278-283.

[3] Lu F, Miao S, Tu J, et al.The role of TonB-dependent receptor TbdR1 in Riemerella anatipestifer in iron acquisition and virulence[J].Vet Microbiol, 2013, 167(3): 713-718.

[4] Tu J, Lu F, Miao S, et al.The siderophore-interacting protein is involved in iron acquisition and virulence of Riemerella anatipestifer strain CH3[J].Vet Microbiol, 2014, 168(2): 395-402.

[5] Braun V, Focareta T.Pore-forming bacterial protein hemolysins (cytolysins)[J].Crit Rev Microbiol, 1991, 18(2): 115-158.

[6] Schmidt H, Beutin L, Karch H.Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157: H7 strain EDL 933[J].Infect Immun, 1995, 63(3): 1055-1061.

[7] 李迪, 高亞萍, 靳鵬, 等.金黃色葡萄球菌 α-溶血素的表達(dá), 純化及中和性抗體的制備[J].軍事醫(yī)學(xué), 2014, 38(11): 871-874

[8] Kennedy A D, Bubeck Wardenburg J, Gardner D J, et al.Targeting of alpha-hemolysin by active or passive immunization decreases severity of USA300 skin infection in a mouse model[J].J Infect Dis, 2010, 202(7): 1050-1058.

[9] Bhakdi S, Bayley H, Valeva A, et al.Staphylococcal alpha-toxin, streptolysin-O, and Escherichia coli hemolysin: prototypes of pore-forming bacterial cytolysins[J].Arch Microbiol, 1996, 165(2): 73-79.

[10] Portnoy D A, Jacks P S, Hinrichs D J.Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes[J].J Exp Med, 1988, 167(4): 1459-1471.

[11] Hu Q, Ding C, Tu J, et al.Immunoproteomics analysis of whole cell bacterial proteins of Riemerella anatipestifer[J].Vet Microbiol, 2012,157 (3): 428-438.

PROKARYOTIC EXPRESSION AND DETECTION OF HEMOLYTIC ACTIVITYOF HYPOTHETICAL HEMOLYSIN-RELATED PROTEIN RIEAN_0415 GENE OF RIEMERELLA ANATIPESTIFER

JIANG Pan, SUN Bing-qing, CUI Jun-sheng, TAO Min-jie, DING Yun-zhu, XUE Ya-fei, LIU Guang-qing, HU Qing-hai
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

To investigate the biological function of hypothetical hemolysin-related protein (HRP) of Riemerella anatipestifer, the Riean_0415 gene was prokaryotically expressed and hemolytic activity of the recombinant protein was evaluated.The Riean_0415 gene was amplifi ed from serotype 10 strain HXb2 in PCR and cloned into Promega T easy vector.Then, DNA fragments were ligated to the prokaryotic expression vector pET-43.1a.The expression of recombinant protein HRP was induced with IPTG and purifi ed with affi nity chromatograph.In red cell lysis test, the recombinant protein HRP had the ability to lyse duck erythrocytes.The result of this study will benefi t to further study on biological functions of HRP protein and hemolysis mechanism of Riemerella anatipestifer.

Riemerella anatipestifer; hemolysin-related protein; prokaryotic expression; hemolytic activity assay

S852.612

A

1674-6422（2016）02-0031-04

2016-01-19

國家自然科學(xué)基金（31272590、31472224）

姜盼，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

胡青海，E-mail：huqinghai@caas.cn