劉 飛，童 武，鄭 浩，李國(guó)新，梁 超，鄭旭晨，田 青，童光志

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

偽狂犬病毒的microRNAs靶基因預(yù)測(cè)及功能鑒定

劉 飛，童 武，鄭 浩，李國(guó)新，梁 超，鄭旭晨，田 青，童光志

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

為研究豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）編碼的微小RNA（microRNA，miRNA）的功能，本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證方法，對(duì)病毒miRNA（virus miRNA，vmiRNA）進(jìn)行靶基因鑒定。結(jié)果表明，PRV編碼的prv-miR-LLT1、prv-miR-LLT7和prv-miR-LLT9對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄極早期基因IE180有抑制作用，prv-miR-LLT7對(duì)參與調(diào)控病毒復(fù)制的UL48基因有抑制作用。初步研究表明這些vmiRNA可能在病毒感染過(guò)程中具有基因調(diào)控作用，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究PRV vmiRNA在病毒復(fù)制、免疫逃避及潛伏感染過(guò)程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

偽狂犬病毒；微小RNA；靶基因

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）為皰疹病毒科（Herpesviridae）成員，感染動(dòng)物后具有發(fā)病迅速、嗜神經(jīng)性和潛伏感染特性。微小RNA（microRNA，miRNA）是長(zhǎng)約22～24 nt的小分子非編碼RNA。miRNA通常與靶基因mRNA的3'UTR發(fā)生不同程度的互補(bǔ)，可以對(duì)mRNA進(jìn)行降解（完全互補(bǔ)）和翻譯抑制（不完全互補(bǔ)）。皰疹病毒vmiRNA（virus miRNA，vmiRNA）通常參與病毒潛伏感染、裂解感染或潛伏再激活等生理過(guò)程[1,2]，從而發(fā)揮與免疫逃避、抑制宿主細(xì)胞凋亡和維持潛伏感染等重要作用[3]。

目前為止，研究發(fā)現(xiàn)PRV共編碼11條vmiRNA，均位于PRV基因組潛伏轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子（LLT）區(qū)，被命名為prv-miR-LLT1～prv-miR-LLT11[4-6]。已有研究表明，缺失prv-miR-LLT1～prv-miR-LLT9這9 條vmiRNA后，不影響PRV在其天然宿主豬體內(nèi)的三叉神經(jīng)節(jié)中建立潛伏感染，但會(huì)使一些宿主基因上調(diào)，導(dǎo)致與細(xì)胞免疫相關(guān)的功能受損，可能預(yù)示著PRV vmiRNA可能參與免疫抑制等過(guò)程[7]，但這些vmiRNA的功能尚不清楚。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法，初步鑒定了PRV vmiRNA的靶基因，為進(jìn)一步研究PRV或其他皰疹病毒vmiRNA的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與毒株 HeLa細(xì)胞株、PRV變異毒株JS-2012均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 載體與主要試劑 pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector購(gòu)自Promega公司；PCR試劑購(gòu)自大連寶生物有限公司（TaKaRa）；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；ClonExpress?II One Step Cloning Kit購(gòu)自諾唯贊公司；基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒提取試劑盒及TOP-10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生物科技有限公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System購(gòu)自Promega公司；Lipofectamin 3000轉(zhuǎn)染試劑、OPTIMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；miRNA mimics由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；胎牛血清（FBS）和 DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。

1.3 vmiRNA靶基因預(yù)測(cè) 本文使用miRanda軟件（http://www.microrna.org/microrna/home.do）預(yù)測(cè)PRV vmiRNA靶向病毒基因的3'UTR。限定的條件為miRNA序列5'端開(kāi)始1～9 nt的堿基處不允許錯(cuò)配（允許G-U配對(duì)），同時(shí)G-U配對(duì)的總量≤3。

1.4 雙熒光素酶重組載體構(gòu)建 根據(jù)miRanda軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，獲取到miRNA靶基因信息后，綜合預(yù)測(cè)結(jié)果及各個(gè)靶基因的功能，進(jìn)行靶基因的篩選。然后根據(jù)GenBank中登錄的PRV JS-2012（NO.KP257591）基因組序列，利用CE Design V1.03軟件，設(shè)計(jì)5'端帶有載體同源臂的特異性引物，引物均由上海桑尼生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 vmiRNA靶基因3'UTR的PCR擴(kuò)增引物Table1 Primers used in PCR amplifi cation for 3'UTR of vmiRNA target gene

以JS-2012的DNA為模板，利用特異性引物擴(kuò)增各靶基因的3'UTR片段，50 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，68℃退火15 s，72℃延伸0.5～2.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，利用重組酶將目的片段定向重組至經(jīng)Nhe I線性化的pmirGLO雙熒光素酶載體中。轉(zhuǎn)化后挑菌送至上海桑尼有限公司測(cè)序。

1.5 vmiRNA與雙熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染 將HeLa細(xì)胞鋪于24孔板，待細(xì)胞匯合度為80%左右時(shí)。按照人工說(shuō)明書，利用Lipo 3000轉(zhuǎn)染試劑，將合成的PRV miRNA mimics/亂序的NC mimics對(duì)照與重組載體/pmirGLO空載體對(duì)照分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)染（每孔轉(zhuǎn)染量：mimics 80 pmol，質(zhì)粒DNA 100 ng）。共轉(zhuǎn)染后24 h檢測(cè)熒光素酶相對(duì)表達(dá)情況。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，并進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 熒光素酶表達(dá)水平檢測(cè) 按照人工操作說(shuō)明書配制新鮮的1×PLB、螢火蟲發(fā)光液LARⅡ及螢火蟲終止液Stop&Glo?。用1×PBS清洗細(xì)胞2次，棄凈PBS。每孔加入200 μL 1×PLB裂解液，室溫輕搖培養(yǎng)板15 min。將裂解后的細(xì)胞移至新EP管中，10 000×g離心 30 s，吸取20 μL上清至檢測(cè)的96孔板中。將自動(dòng)進(jìn)樣器1和2分別放置適量的LARII 和Stop&Glo?試劑。測(cè)量時(shí)，設(shè)置參數(shù)每孔加入100 μL LARII，檢測(cè)螢火蟲螢光素酶。加入100 μL Stop&Glo?試劑，檢測(cè)海腎螢光素酶的活性，使用2 s延遲和10 s讀數(shù)。其他孔如此循環(huán)操作。

2 結(jié)果

2.1 vmiRNA對(duì)病毒基因的調(diào)控預(yù)測(cè) 利用miRanda軟件對(duì)PRV已知的11條vmiRNA與56個(gè)PRV的基因3'UTR進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，vmiRNA與病毒靶基因形成了一個(gè)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。一條miRNA能靶向多個(gè)基因，如prv-miR-LLT1能靶向EP0、IE180、UL14、UL25、UL48、UL44、UL39、UL33和LLT等多個(gè)基因。一個(gè)基因同時(shí)也能受到多個(gè)靶基因的調(diào)控，如IE180基因可以受prvmiR-LLT1、prv-miR-LLT7、prv-miR-LLT9、prvmiR-LLT10和prv-miR-LLT11的調(diào)控。因此，我們選擇與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄激活及毒力相關(guān)的UL1、UL14、UL48、UL52、US3、EP0和IE180基因，作為進(jìn)一步驗(yàn)證的靶基因。選取的驗(yàn)證的靶基因見(jiàn)表2。

2.2 vmiRNA的病毒靶基因驗(yàn)證 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pmiR-EP0U、pmiR-US3U、pmiRUL1U、pmiR-UL14U、pmiR-U52U、pmiR-IE180U 和pmiR-UL48U。將合成的vmiRNA分別與相應(yīng)重組載體共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，檢測(cè)vmiRNA作用于靶基因的3'UTR后，對(duì)螢火蟲熒光素酶表達(dá)水平的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

表2 選取驗(yàn)證的vmiRNA及其靶基因Table2 The vmiRNAs and target genes used in this study

雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)prv-miR-LLT1、prv-miR-LLT7和prv-miR-LLT9對(duì)PRV轉(zhuǎn)錄極早期基因IE180有抑制作用，其中prv-miR-LLT-1的抑制作用較顯著（P＜0.05）。prv-miR-LLT7對(duì)參與病毒復(fù)制調(diào)控的UL48基因有顯著抑制作用（P＜0.05），說(shuō)明這些vmiRNA可能具有調(diào)控病毒復(fù)制或維持潛伏感染等功能。本研究中其他vmiRNA則對(duì)相應(yīng)靶基因無(wú)抑制作用，而prv-miR-LLT3對(duì)UL14及UL48，prv-miR-LLT10對(duì)UL48及UL52的作用，因?yàn)閜rvmiR-LLT3和prv-miR-LLT10本身會(huì)對(duì)pmirGLO空載體具有明顯的下調(diào)作用，所以這兩個(gè)miRNA可能抑制了載體上的啟動(dòng)子活性，從而導(dǎo)致熒光素酶表達(dá)水平下降。

3 討論

1993年miRNA被發(fā)現(xiàn)以來(lái)[8]，研究人員對(duì)這種結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的小分子的形成機(jī)制、功能和作用方式充滿了好奇。隨著研究的深入，miRNA的一些調(diào)控機(jī)制正在逐漸明晰，miRNA可以通過(guò)其短小的“種子區(qū)”識(shí)別并結(jié)合mRNA的3'UTR，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄或者翻譯過(guò)程達(dá)到調(diào)控的目的[9]?，F(xiàn)有的關(guān)于vmiRNA的功能研究主要集中于雙鏈DNA病毒，且大多數(shù)的研究成果集中于皰疹病毒。已有研究表明vmiRNA在皰疹病毒中對(duì)建立和維持潛伏感染及再激活、免疫逃避和細(xì)胞生存等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如α-皰疹病毒科的HSV-1和HSV-2，γ-皰疹病毒科的EBV、KSHV和β-皰疹病毒科的CMV編碼的vmiRNA能夠靶向病毒編碼的基因，許多是靶向病毒立即早期基因從而調(diào)控病毒的復(fù)制，或與病毒在宿主中建立及維持潛伏感染和再激活作用有關(guān)[10]。有些vmiRNA則在病毒的生命過(guò)程通過(guò)調(diào)控細(xì)胞基因發(fā)揮免疫逃避的作用，以創(chuàng)造更有利于病毒生存，在病毒生活周期中扮演重要的角色。

圖1 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證vmiRNA對(duì)病毒靶基因3'UTR的作用Fig.1 Function analysis of vmiRNA-gene on 3'UTR by the luciferase reporter system

目前，miRNA靶基因的預(yù)測(cè)為miRNA功能鑒定提供一個(gè)驗(yàn)證的數(shù)據(jù)支持。我們通過(guò)miRanda靶基因預(yù)測(cè)軟件分析，發(fā)現(xiàn)vmiRNA與病毒的mRNA之間能夠形成復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們選擇與PRV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的IE180、EP0、UL52、UL48、UL14、UL1和US3基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，prvmiR-LLT1、prv-miR-LLT7和prv-miR-LLT9對(duì)IE180有抑制作用，prv-miR-LLT7對(duì)UL48有抑制作用。說(shuō)明這幾個(gè)vmiRNA在病毒感染后可能會(huì)抑制PRV的復(fù)制，從而有利于PRV維持潛伏感染或免疫逃避等過(guò)程，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的prv-miR-LLTs可能調(diào)控極早期基因IE180結(jié)果相一致[4]。而其他vmiRNA未見(jiàn)對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因有顯著抑制作用。總而言之，相對(duì)于蛋白的強(qiáng)大調(diào)控作用，miRNA分子很小不會(huì)被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除，可以在病毒生命周期中起到多層次的微調(diào)控作用，從而創(chuàng)造一個(gè)有利于病毒生存的環(huán)境。目前，對(duì)PRV vmiRNA功能研究尚處于探索階段，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討PRV vmiRNA在病毒復(fù)制、免疫逃避及潛伏感染過(guò)程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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TARGET PREDICTION AND FUNCTIONAL IDENTIFICATION OF PSEUDORABIES VIRUS-ENCODED MICRORNAS

LIU Fei, TONG Wu, ZHENG Hao, LI Guo-xin, LIANG Chao, ZHENG Xu-chen, TIAN Qing, TONG Guang-zhi
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

In order to understand the function of microRNA (miRNA) encoded by Pseudorabies virus (PRV), the objective of the present study was to defi ne potential vmiRNA-gene interaction based on bioinformatic analysis in combination with the dual luciferase reporter assay system.The results showed prv-miR-LLT1, prv-miR-LLT7 and prv-miR-LLT9 targeted the transcription activator IE180 gene and prv-miR-LLT7 targeted the UL48 gene involved in viral DNA replication.These vmiRNAs might have regulatory functions in the course of PRV infection.The results were of signifi cance for further research on functions of vmiRNAs regarding virus replication, immune evasion and latent infection.

Pseudorabies virus; microRNA; target gene

S852.659.1

A

1674-6422（2016）02-0008-05

2016-01-16

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(14ZR1448900)；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2015）第1-7號(hào)）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014JB02）

劉飛，女，博士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn