阮寶陽，王 林，宮曉倩，劉曉敏，張 鵬，汪 琪，李澤君，童光志，于 海

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271000）

·研究論文·

歐洲禽源H1N1亞型豬流感病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立

阮寶陽1,2，王 林2，宮曉倩1，劉曉敏1，張 鵬1,2，汪 琪1，李澤君1，童光志1，于 海1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271000）

本研究利用原核表達(dá)并純化的重組蛋白pCold TF-HA1作為包被抗原，建立歐洲禽源H1N1亞型豬流感病毒抗體的間接ELISA檢測方法。通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了間接ELISA最佳工作條件：抗原最佳包被濃度為800 ng/孔，血清稀釋度為1:200，封閉時(shí)間為1 h，一抗血清最佳作用時(shí)間為2 h，酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1:40 000，二抗最佳作用時(shí)間為1 h，TMB顯色時(shí)間為7 min。陰/陽性血清的判斷結(jié)果分別為OD450≤0.255和OD450≥0.292，介于兩者之間為可疑。符合性試驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的間接ELISA方法與血凝抑制（haemagglutination inhibition，HI）檢測的陽性率分別為53.27%和49.53%，兩者總復(fù)合率達(dá)96.27%。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法與古典H1N1亞型和H3N2亞型豬流感陽性血清無交叉反應(yīng)。通過重復(fù)性試驗(yàn)表明，同一批制備的重組蛋白包被96孔酶標(biāo)板，檢測OD450值的批內(nèi)變異系數(shù)為1.97%～7.85%，批間變異系數(shù)為1.94%～6.93%。總之，本研究建立的禽源H1N1亞型豬流感病毒抗體間接ELISA方法，具有敏感性較高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)，為豬流感抗體檢測提供了一種準(zhǔn)確、快捷、簡便、有效的技術(shù)手段，可用于禽源H1N1亞型豬流感抗體檢測和流行病學(xué)調(diào)查。

歐洲禽源H1N1豬流感病毒；重組蛋白；間接ELISA；特異性

豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）是一種高接觸性、高傳染性的病毒，可引起豬高熱、咳嗽、呼吸困難，同時(shí)易繼發(fā)其他病毒和細(xì)菌性疾病混合感染，如豬繁殖與呼吸綜合征、傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌等[1]，對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重危害。研究表明，豬呼吸道上皮細(xì)胞中同時(shí)存在禽流感病毒受體和人流感病毒受體[2]，因此存在人流感病毒和禽流感病毒感染豬的可能性。自1974年全球首次報(bào)道SIV感染人并造成傷亡以來，SIV感染人的事件在世界范圍內(nèi)均有報(bào)道[3-5]，更為重要的是，1957年、1968年和2009年3次世界性流感大流行均與豬流感病毒有關(guān)[6-8]。

目前已發(fā)現(xiàn)和鑒定的SIV包括H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等多種血清亞型，我國流行的主要是H1N1、H1N2和H3N2[9,10]。H1N1亞型SIV主要包括歐洲禽源H1N1亞型和北美古典H1N1亞型兩種。在我國南方地區(qū)商品化成年豬群中，歐洲禽源H1N1亞型SIV近些年來出現(xiàn)明顯增長趨勢，已逐漸成為主要流行的H1亞型之一[10,11]。因此，對(duì)禽源H1N1亞型SIV抗體和抗病原的檢測，可為監(jiān)控SIV的流行提供有效的技術(shù)支持，在防控禽流感和人流感中提供積極的輔助作用。

1 材料與方法

1.1 主要毒株和試劑 歐洲禽源H1N1亞型豬流感A/ Swine/Shanghai/1/2014（H1N1）病毒；Anti-Pig IgG-Peroxidase antibody 購自Sigma公司；豬血清樣品；碳酸鹽包被液；5%的BSA；TMB顯色液；2 mol/L硫酸等；BCA測蛋白濃度試劑盒購自碧云天公司；旋窩震蕩器；96孔酶標(biāo)板；酶標(biāo)儀購自基因生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備與純化 原核表達(dá)出歐洲禽源H1N1亞型豬流感病毒HA1可溶性重組蛋白（簡稱pCold TF-HA1），超聲破碎菌液，將收集的上清液按照His-Tag融合蛋白純化操作手冊(cè)進(jìn)行重組蛋白的純化，對(duì)純化后重組蛋白進(jìn)行抗原性分析[12]。

1.2.2 間接ELISA反應(yīng)程序 包將抗原通過碳酸鹽緩沖液（pH=9.4）稀釋，包被96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，置濕盒，4℃過夜；棄去包被液，加入PBST緩沖液（pH=7.4）并放入水平搖床上室溫洗滌3次，5 min/次；加入5%脫脂乳（BSA），100 μL/孔，置濕盒，37℃封閉1 h，甩干并同上洗滌；血清樣品用5% BSA稀釋加至酶標(biāo)板，100 μL/孔，置濕盒，37℃孵育1 h，甩干，同上洗滌；用5% BSA稀釋將HRP標(biāo)記的兔抗豬二抗稀釋至工作濃度，100 μL/孔，置濕盒，37℃孵育1 h，甩干，同上洗滌。每孔加入TMB顯色液，50 μL/孔，避光顯色；加入2 mol/L H2SO4，50 μL/孔，終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測定各孔OD450值。

1.2.3 最佳抗原量與血清稀釋度的確定 根據(jù)方陣測定法，將重組蛋白抗原每孔以100、200、400、800、1000 ng稀釋包被酶標(biāo)板，將陽性血清用5%BSA以50、100、200、400倍稀釋酶標(biāo)板，進(jìn)行ELISA檢測，酶標(biāo)儀測定OD450值。取OD450值近似1.0，P/N值最大時(shí)抗原量和血清稀釋度，即為最佳抗原包被濃度和最佳一抗豬血清稀釋度。

1.2.4 封閉液最佳作用時(shí)間的確定 以最佳的抗原量包被酶標(biāo)板，4℃過夜。棄去包被液PBST洗滌3次，5 min/次。以5%BSA作為封閉液在37℃孵育，作用時(shí)間分別為0.5、1、1.5 h。同上PBST洗滌，以最佳血清稀釋度加入一抗37℃孵育2 h。同上PBST洗滌，用5%BSA以1:40 000倍稀釋二抗，37℃孵育1 h。同上PBST洗滌，加入50 μL/孔TMB避光顯色5 min，加入2 mmol/L H2SO4，50μL/孔，終止反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)做4個(gè)重復(fù)，取OD450值近似1.0，P/N值最大時(shí)封閉液作用時(shí)間，即為封閉最佳時(shí)間。

1.2.5 血清最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 以最佳抗原量包被酶標(biāo)板，4℃過夜，PBST洗滌3次，5 min/次，以最佳反應(yīng)時(shí)間37℃封閉。同上PBST洗滌，以最佳血清稀釋度加入酶標(biāo)板中，在37℃分別孵育0.5、1、1.5、2 h。同上PBST洗滌，加入二抗37℃作用1 h。同上PBST洗滌，加入50 μL/孔TMB避光顯色5 min，加入2 mmol/L H2SO4，50 μL/孔，終止反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)做4個(gè)重復(fù)，取OD450值近似1.0，P/N值最大血清反應(yīng)時(shí)間，即為血清最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.6 二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 以最佳抗原量包被酶標(biāo)板，4℃過夜，PBST洗滌3次，5 min/次，以最佳反應(yīng)時(shí)間37℃封閉。同上PBST洗滌，以最佳血清稀釋度加入酶標(biāo)板中，在37℃以最佳反應(yīng)時(shí)間孵育一抗血清。同上洗滌，40 000倍稀釋二抗加入酶標(biāo)板中，在37℃分別孵育0.5、1、1.5、2 h。同上PBST洗滌，加入50 μL/孔TMB避光顯色5 min，加入2 mmol/L H2SO4，50 μL/孔，終止反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)做4個(gè)重復(fù)，取OD450值近似1.0，P/N值最大時(shí)二抗反應(yīng)時(shí)間，即為最佳二抗反應(yīng)時(shí)間。

1.2.7 TMB最佳顯色時(shí)間的確定 以最佳抗原量包被酶標(biāo)板，4℃過夜，PBST洗滌3次，5 min/次，以最佳反應(yīng)時(shí)間37℃封閉。同上PBST洗滌，以最佳血清稀釋度加入酶標(biāo)板中，在37℃以最佳作用時(shí)間孵育。同上洗滌，40 000倍稀釋二抗加入酶標(biāo)板中，在37℃以最佳反應(yīng)時(shí)間孵育二抗。同上洗滌，加入50 μL/孔TMB避光顯色3、5、7min。2 mmol/ L H2SO4，50 μL/孔，終止反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)做4個(gè)重復(fù)，取OD450值近似1.0，P/N值最大時(shí)顯色時(shí)間，即為TMB最佳顯色時(shí)間。

1.2.8 陰/陽性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的確定 選取21份SIV陰性的豬血清樣品，通過已確立的最佳間接ELISA反應(yīng)體系進(jìn)行OD450值測定。

1.2.9 符合性試驗(yàn) 采用確立的間接ELISA檢測最佳反應(yīng)條件和血凝抑制（hemagglutination inhibition， HI）試驗(yàn)兩種方法，檢測107份在豬場采集并實(shí)驗(yàn)室保存的臨床豬血清，比較兩者陽性率和符合率。

1.2.10 特異性實(shí)驗(yàn) 按照上述已確立的最佳反應(yīng)條件建立的間接ELISA檢測方法，進(jìn)行特異性檢測。選取古典H1N1亞型豬流感病毒和H3N2亞型豬流感病毒的陽性血清作為比較，同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性豬血清對(duì)照，比較各組間特異性差異。

1.2.11 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

1.2.11.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 分別取SIV陽性血清和陰性血清在同一批制備的重組蛋白包被酶標(biāo)板、同一批試驗(yàn)，同一條件，同一時(shí)間，按照上述確立的間接ELISA最佳反應(yīng)體系進(jìn)行OD450值的測定，每份血清重復(fù)4孔，最后用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析批內(nèi)重復(fù)效果。

1.2.11.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批制備的重組蛋白包被酶標(biāo)板，按照已確立的最佳ELISA反應(yīng)體系，在4個(gè)不同時(shí)間進(jìn)行OD450值測定，每份血清重復(fù)4孔，最后用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析批間重復(fù)效果。

2 結(jié)果

2.1 最佳抗原量與血清稀釋度的確定 采用方陣滴定法確定血清最佳稀釋度和抗原包被量，結(jié)果顯示，血清用5%BSA以1:200倍稀釋，抗原包被量800 ng/孔，4℃過夜，此時(shí)P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0（表1）。

表1 血清最佳稀釋度和抗原最佳包被量結(jié)果Table1 Determination of optimal serum dilution and antigen content

2.2 封閉液最佳作用時(shí)間的確定 以最佳抗原量800 ng/孔包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜，血清1:200倍稀釋，用5%BSA作為封閉液，37℃封閉，測得OD450值見表2。結(jié)果顯示，封閉1 h時(shí)效果最佳，此時(shí)P/N值最大，且陽性血清OD450值接近1.0。

表2 最佳封閉時(shí)間的確定Table2 Determination of the optimal incubation time of blocking solution

2.3 血清最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 采用最佳抗原量800 ng/孔包被酶標(biāo)板，血清200倍稀釋，用5%BSA在37℃封閉 1 h，測得的OD450值見表3。結(jié)果分析得出，血清37℃孵育2 h時(shí)，陽性值接近1.0，且P/N值最大，因此血清37℃孵育2 h為最佳反應(yīng)時(shí)間。

表3 血清最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇Table3 Determination of optimal serum incubation time

2.4 二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 以抗原量800 ng/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜，血清200倍稀釋，用5%BSA于37℃封閉1 h，血清37℃孵育2 h，測得的OD450值見表4。結(jié)果分析可知，酶標(biāo)二抗37℃孵育1.0 h時(shí)，此時(shí)陽性值最接近1.0，且P/N值最大。

表4 二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇Table4 Determination of optimal incubation time of HRP-IgG

2.5 TMB最佳顯色時(shí)間的確定 以抗原量800 ng/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜，血清200倍稀釋，5%BSA在37℃封閉1 h，血清37℃孵育2 h，測得的OD450值見表5。TMB室溫顯色時(shí)間7 min時(shí)，此時(shí)P/N值為最大，陽性值也較接近1.0。

表5 TMB顯色最佳時(shí)間的選擇Table5 Determination of optimal reaction time of TMB

2.6 陰/陽性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的確定 用已確立的間接ELISA反應(yīng)體系對(duì)21份血清樣品（HI檢測為SIV陰性）進(jìn)行檢測，結(jié)果見表6。對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用Microsoft Excel 軟件中AVERAGE（平均函數(shù)）和STDEVP（標(biāo)準(zhǔn)差函數(shù)）計(jì)算出平均值（x）及標(biāo)準(zhǔn)差(s)。得到平均值x=0.180571，s=0.037262，根據(jù)置信區(qū)間上限x+3s≈0.292，作為陽性血清判定下限；置信區(qū)間下限x+2s≈0.255，定位可疑界限。因此，間接ELISA的判定標(biāo)準(zhǔn)OD450≥0.292時(shí)判定為陽性，OD450≤0.255時(shí)判定為陰性，介于兩者之間的樣品判定為可疑。

表6 陰/陽性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的確定Table6 Determination of positive or negative of standard control

2.7 符合性試驗(yàn) 選取的107份臨床樣品，檢測結(jié)果如表7所示，其中53/107×100%=49.53%為HI試驗(yàn)檢測樣品的陽性率，而57/107×100%=53.27%為間接ELISA的陽性率，以103/107×100%=96.27%作為HI 和ELISA檢測方法的復(fù)合率。說明間接ELISA檢測結(jié)果與HI試驗(yàn)結(jié)果有較高的復(fù)合率，同時(shí)間接ELISA檢測的陽性率高于HI試驗(yàn)結(jié)果，說明其具有更高的靈敏性。

表7 符合性試驗(yàn)Table7 The result of conformance test

2.8 特異性試驗(yàn) 用確立的間接ELISA反應(yīng)體系進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果如表8所示。表明建立的間接ELISA檢測方法與豬流感病毒其他亞型無交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。

表8 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table8 Identifi cation of specifi city for indirect ELISA

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

2.9.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批制備的重組蛋白包被酶標(biāo)板，同一條件，同一時(shí)間中，依照已建立的間接ELISA最佳反應(yīng)體系檢測OD450值，結(jié)果見表9所示。統(tǒng)計(jì)并分析上述表檢測數(shù)據(jù)結(jié)果，可以看出變異系數(shù)均小于10%，為1.97%～7.85%，表明在同一批試驗(yàn)中同一樣品變異程度較小，重復(fù)性較好。

2.9.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批制備的重組蛋白抗原包被酶標(biāo)板，按照建立的間接ELISA最佳反應(yīng)體系在4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)檢測OD450值，結(jié)果見表10所示。結(jié)果顯示在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行間接ELISA檢測，變異系數(shù)為1.94%～6.93%，小于10%，表明同一批試驗(yàn)中同一樣品變異程度較小，重復(fù)性較好。

表9 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)Table9 Repeatability test in bath

表10 批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table1 0 Repeatability test between bath

3 討論

目前國內(nèi)外用于診斷豬流感病毒抗體常用的是血清學(xué)方法，常見的有血凝抑制試驗(yàn)（HI）、中和試驗(yàn)（seraneutralization，SN）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和ELISA檢測等。HI也是檢測流感病毒感染最常見的血清學(xué)診斷方法，具有操作簡單、耗時(shí)短、方便等優(yōu)點(diǎn)，但是哺乳動(dòng)物血清中存在非特異性血凝因子，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此血清需要進(jìn)行特別處理，且使用哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞檢測效果要比雞紅細(xì)胞更好，同時(shí)紅細(xì)胞需要現(xiàn)配現(xiàn)用。SN具有很好的敏感性和特異性，但是由于其耗時(shí)且操作過程較復(fù)雜，同時(shí)其抗體與吸附的抗原需要高度匹配，這無疑給檢測過程帶來挑戰(zhàn)，因此SN在臨床疾病診斷中沒有得到廣泛的應(yīng)用。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)具有敏感性高和適應(yīng)性廣的優(yōu)點(diǎn)，但是操作過程較復(fù)雜且要求高，反應(yīng)的各個(gè)因子量必須有恰當(dāng)比例，否則會(huì)影響結(jié)果判定。ELISA具有較高的敏感性和特異性，可以檢測特異性的抗原或者抗體，容易建立良好的檢測系統(tǒng)，結(jié)果容易分析，因此適合于大規(guī)模樣品的血清學(xué)調(diào)查[13]。

HA蛋白是介導(dǎo)病毒與細(xì)胞表面結(jié)合的主要成分，是流感最重要的保護(hù)性抗原，而HA1是重要的病毒受體結(jié)合位點(diǎn)和抗原決定簇區(qū)域。本研究利用HA1作為流感病毒最主要抗原蛋白這一特性[14]，將歐洲禽源H1N1亞型SIV A/Swine/Shanghai/1/2014 （SH1）HA1基因克隆至原核表達(dá)載體pCold TF上，原核表達(dá)出重組可溶性蛋白[12]，純化并包被96孔酶標(biāo)板中，通過確立最佳的ELISA反應(yīng)體系最終建立間接ELISA檢測方法。符合性試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的間接ELISA檢測方法與血凝抑制（HI）檢測結(jié)果有較高的符合率。特異性檢測結(jié)果顯示，建立的間接ELISA方法檢測結(jié)果與豬流感病毒其他亞型病毒無明顯交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。從批間重復(fù)性試驗(yàn)和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)檢測結(jié)果可以看出，其批間和批內(nèi)重復(fù)性的變異系數(shù)均小于10%，具有較好的重復(fù)性。因此，本研究基于HA1蛋白建立的間接ELISA方法，對(duì)于歐洲禽源H1N1亞型SIV抗體水平的檢測和臨床診斷具有重要的應(yīng)用價(jià)值，利于豬群中H1N1亞型SIV的生物安全預(yù)警、有效防控和流行病學(xué)調(diào)查。

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DEVELOPMENT OF AN INDIRECT ELISA FOR DETECTION OF ANTIBODIES TO EUROPEAN AVIAN-LIKE H1N1 SUBTYPE SWINE INFLUENZA VIRUS

RUAN Bao-yang1,2, WANG Lin2, GONG Xiao-qian1, LIU Xiao-min1, ZHANG Peng1,2, WANG Qi1, LI Ze-jun1, TONG Guang-zhi1, YU Hai1
(1.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271000, China)

In the present study, an indirect ELISA method was developed to detect antibodies to European avian-like H1N1 subtype Swine infl uenza virus (SIV) using prokaryotic expressed and purifi ed recombinant protein pCold TF-HA1 as the coating antigen.The reaction conditions were optimized, e.g.coating antigen at 800 ng, serum dilution at 1:200, 5% skim milk as the blocking solution, 1.0 h for closed time, 2.0 h for serum reaction time, HRP antibody dilution at 1:40 000, 1.0 h for labeled antibody reaction time and 7 min for reaction time of TM.Criteria for determining the negative, positive and suspect results of serum samples were OD450nm≤ 0.255,OD450nm≥ 0.292 and 0.255-0.292, respectively.The conformance testing showed the high agreement (96.27%) between the indirect ELISA method and hemagglutination inhibition (HI) test as their individual positive rates were 53.27% and 49.53%.The specifi c test results demonstrated that the established ELISA method had no cross reaction with positive serum samples of H1N1 and H3N2 subtypes SIV.The coeffi cient of variation was 1.97%-7.85% between ELISA plates coated with the same batch of recombinant protein and 1.94%-6.93% between batches of recombinant proteins.In conclusion, the indirect ELISA method developed in the present study had high sensitivity, specifi city and repeatability and thus could be used as an accurate, fast, convenient and effective technique for detection of antibodies to H1N1 subtype SIV and epidemiological surveillance.

European avian-like H1N1 subtype; Swine infl uenza virus (SIV); recombinant protein; indirect ELISA

S852.659.5

A

1674-6422（2016）02-0013-07

2016-04-09

國家青年自然科學(xué)基金（31201916）；上海市自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（12ZR1453500）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2015JB07）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程科研團(tuán)隊(duì)“動(dòng)物流感病毒病原生態(tài)學(xué)”項(xiàng)目

阮寶陽，男，碩士研究生，臨床獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn；于海，E-mail：haiyu@shvri.ac.cn