楊寶玲，陳福廣，謝 芳，劉思國(guó)，沈國(guó)順，張躍靈

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng)110866；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150001）

·研究論文·

2型豬鏈球菌SsU05-0474的表達(dá)純化及單克隆抗體制備

楊寶玲1，陳福廣2，謝 芳2，劉思國(guó)2，沈國(guó)順1，張躍靈2

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng)110866；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150001）

為了鑒定2型豬鏈球菌（Streptococcus suis serotype 2，Ss2）菌毛骨架蛋白SsU05-0474（本文中簡(jiǎn)稱SsMps）在菌體中的位置和存在形式，本研究以2型豬鏈球菌05ZYH33菌株基因組作為模板，PCR擴(kuò)增菌毛骨架蛋白基因SsU05-0474，將其克隆至表達(dá)載體pET22b，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b/SsMps，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SsMps蛋白，并通過(guò)親和層析純化。純化的SsMps蛋白免疫BALB/c雌鼠，利用細(xì)胞融合篩選制備該重組蛋白的單克隆抗體。結(jié)果顯示，SsMps蛋白在大腸桿菌中以可溶形式表達(dá)，分子質(zhì)量大小為45 kDa。每升大腸桿菌培養(yǎng)物可獲得SsMps重組蛋白約30 mg，純度大于95%。獲得了1株該重組蛋白的單克隆抗體1D9，抗體亞型為IgG1/κ。通過(guò)單抗1D9與05ZYH33菌體蛋白組分Western blot，發(fā)現(xiàn)該抗體能夠特異識(shí)別SsMps，并定位出SsMps大部分存在于細(xì)胞壁蛋白成分中，呈不同聚體存在。本研究制備的SsMps純化蛋白及其單克隆抗體為研究SsMps蛋白的功能提供了工具。

2型豬鏈球菌；SsMps基因；蛋白表達(dá)；蛋白純化；單克隆抗體

2 型豬鏈球菌（Streptococcus suis serotype 2，Ss2）是一種人畜共患傳染病病原體，可引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、急性敗血癥及死亡，而且可通過(guò)傷口和呼吸道傳播給人，導(dǎo)致人的感染發(fā)病和死亡[1,2]。Ss2感染在全球范圍發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)相關(guān)從業(yè)人員的健康也構(gòu)成嚴(yán)重威脅。1998年和2005年在我國(guó)江蘇省和四川省分別爆發(fā)了大規(guī)模的Ss2感染人的公共衛(wèi)生事件，共造成200余例感染，42人死亡，更是引起了國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注[3-5]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種Ss2毒力因子，包括莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、溶血素、胞外蛋白因子和表面LPXTG蛋白等，其中存在于菌體表面的LPXTG蛋白由于直接接觸宿主細(xì)胞或蛋白，在致病性中往往發(fā)揮重要作用[6,7]。經(jīng)基因組序列分析，我們找到了Ss2菌株05ZYH33的一種LPXTG蛋白，基因組編號(hào)為SsU05-0474。該基因編碼蛋白與菌毛骨架蛋白具有較高同源性[8]，因此在本文中簡(jiǎn)稱SsMps蛋白。據(jù)報(bào)道菌毛骨架蛋白在與宿主的相互作用中扮演重要角色[9]。我們的初步研究發(fā)現(xiàn)SsMps具有結(jié)合宿主的一種重要免疫因子的能力，可能在Ss2致病性中起作用，但是SsMps在Ss2中的位置和存在形式還不確定。本文表達(dá)純化了SsMps蛋白并制備了該蛋白的單克隆抗體，有效識(shí)別并定位了SsMps，并為深入研究SsMps的新功能及其在Ss2致病性中的作用提供了工具。

1 材料與方法

1.1 菌種、載體、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2型豬鏈球菌05ZYH33菌株由蔡雪輝研究員贈(zèng)予；E.coli DH5α 和E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生物科技有限公司；表達(dá)載體pET22b和SP2/0細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存；5 w BALB/c雌鼠購(gòu)自北京維通利華有限公司。

1.2 主要試劑 Prime STAR Max DNA Polymerase購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI和T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基和雙抗購(gòu)自HyClone公司；HAT、HT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和PEG3350購(gòu)自Sigma公司；TMB和DAB顯色液購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 SsMps基因的克隆 根據(jù) Ss2菌株05ZYH33的SSU05_0474（GenBank登錄號(hào)：145688934）基因序列，設(shè)計(jì)引物Nde I F：5'-GATCCATATGCAAA CTGTTGATAGCGGAA-3'（下劃線處為 Nde Ι酶切位點(diǎn)）和XhoΙR：5'-GATCCTCGAGGACACC ACCCTTTTTATTGA-3'（下劃線處為 Xho Ι酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μL：25 μL Prime STAR Max DNA Polymerase、1 μL引物NdeΙF（10 μmol/L）、1 μL引物XhoΙR（10 μmol/L）、1～2 ng 05ZYH33基因組DNA，23 μL ddH2O。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，52℃退火15 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，用NdeΙ和XhoΙ的雙酶切，然后用T4 DNA連接酶與經(jīng)NdeΙ、XhoΙ雙酶切的pET22b載體連接后，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。轉(zhuǎn)化菌株提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，取含有正確大小插入片段的重組質(zhì)粒pET22b/ SsMps，送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。經(jīng)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行下一步的SsMps蛋白的表達(dá)與純化。

1.4 SsMps蛋白的表達(dá)和純化 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET22b/SsMps轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），涂布于固體LB氨芐平板（含氨芐青霉素100 μg/mL），挑取單個(gè)菌落接種于LB氨芐液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 μg/mL）中，37℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，然后以1:100的比例轉(zhuǎn)接于1 L LB氨芐液體培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度0.8 μmol/L，22℃、220 r/min過(guò)夜誘導(dǎo)。4℃、4000×g離心10 min，收集菌液，用40 mL 20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、5 mmol/ L咪唑、pH 7.9溶液重懸，超聲破碎，18 000×g離心10 min。上清采用Ni-NTA親和樹(shù)脂純化，用梯度咪（20、40、60、80、100、250 mmol/L）進(jìn)行洗脫。將收集的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)結(jié)果合并含有純化的SsMps蛋白的收集液，采用超濾柱（Millipore）進(jìn)行濃縮。然后用PD-10脫鹽柱（GE）將蛋白溶解緩沖液轉(zhuǎn)換為50 mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.4，分裝后于－70℃凍存。

1.5 SsMps單克隆抗體的制備

1.5.1 動(dòng)物免疫 用純化的SsMps蛋白為抗原，按照標(biāo)準(zhǔn)免疫程序進(jìn)行免疫[10]，將等體積的目的蛋白與佐劑均勻混合乳化后，背部多點(diǎn)皮下注射，每只小鼠注射100 μL含有100 μg重組蛋白的混合乳化液。第1次免疫用弗氏完全佐劑，第1次和第2次用弗氏不完全佐劑，間隔2周免疫1次。第3次免疫后d7尾靜脈采血，分離血清，用ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1:2.56×105時(shí)，取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.5.2 雜交瘤細(xì)胞的篩選及單克隆抗體腹水的制備無(wú)菌條件下分離制備免疫小鼠的脾細(xì)胞，按照脾細(xì)胞:SP2/0細(xì)胞為10:1的比例，將細(xì)胞于50 mL離心管中混勻后離心，棄掉上清后加入700 μL 37℃預(yù)熱的PEG3350，輕輕攪拌30 s后靜置30 s，而后慢慢加入30 mL預(yù)熱的RPMI 1640培養(yǎng)基終止融合，離心后將上清棄凈，用加入飼養(yǎng)層細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基重懸后，均勻鋪布于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后d10換用HT培養(yǎng)基，并連續(xù)用ELISA進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選與純化，直至篩選到單一的陽(yáng)性克隆。按照常規(guī)的試驗(yàn)方法制備腹水[11]，利用辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗SsMps的單克隆抗體。

1.5.3 腹水單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定及抗體亞型的鑒定效價(jià)測(cè)定 以SsMps重組蛋白作為檢測(cè)抗原，用間接ELISA進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定。亞型鑒定參照Southern Biotech公司的抗體亞類試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.6 05ZYH33菌株蛋白組分提取 挑取05ZYH33菌株的單菌落接種于2 mL Todd-Hewitt肉湯培養(yǎng)基（THB），37℃過(guò)夜靜置培養(yǎng)后，按1:100接種量接種于80 mL新鮮THB培養(yǎng)基。37℃靜置培養(yǎng)12 h后，3500×g離心10 min。上清液用超濾管超濾濃縮60倍，即為05ZYH33胞外蛋白組分。菌體沉淀用去離子水洗滌后懸浮于800 μL PBS-蔗糖（20%蔗糖于PBS）溶液，加入溶菌酶和鏈溶菌素（Sigma），37℃過(guò)夜輕搖孵育后，8000×g離心10 min，上清即為細(xì)胞壁蛋白組分。沉淀用PBS-蔗糖溶液洗滌1次，800 μL PBS重懸后，超聲破碎。然后15 000×g離心3 h，上清為胞內(nèi)蛋白組分，沉淀用緩沖液（800 μL 1 % Tween、50 mmol/L Hepes、200 mmol/L NaCl，pH 4.0）溶解，即膜蛋白組分。

1.7 Western blot 參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行。將目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后以15 V恒壓，60 min半干轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)好的膜浸入封閉液（5%脫脂乳，PBST配制）中，4℃輕搖封閉過(guò)夜。封閉后，PBST洗膜3次，以制備的SsMps單克隆抗體為一抗，用PBST以1:300比例稀釋，4℃輕搖孵育過(guò)夜。PBST洗膜3次，熒光二抗用PBST以1:5000稀釋，37℃輕搖孵育1 h，PBST洗膜3次，最后用掃膜儀掃膜存圖。

2 結(jié)果

2.1 SsMps基因的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定以Ss2菌株05ZYH33的基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增出目的片段，經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測(cè)與SsMps基因（1443 bp）的大小一致（圖1A）。獲得的重組質(zhì)粒pET22b/SsMps經(jīng)NdeΙ和XhoΙ雙酶切鑒定，插入片段與SsMps基因大小吻合（圖1B），并經(jīng)測(cè)序證實(shí)為正確的SsMps序列，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 SsMps蛋白的表達(dá)與純化 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDSPAGE分析發(fā)現(xiàn)，相比pET22b空載體轉(zhuǎn)化菌株，pET22b-SsMps轉(zhuǎn)化菌株在45 kDa處出現(xiàn)了1個(gè)蛋白條帶，與純化后的SsMps大小一致。超聲破碎離心后，這個(gè)蛋白仍然存在于上清中，說(shuō)明SsMps可溶表達(dá)。經(jīng)Ni-NTA親和樹(shù)脂純化后，獲得了純度高于95 %的SsMps蛋白（圖2）。

圖1 SsMps基因擴(kuò)增（A）及重組質(zhì)粒pET22b/SsMps的雙酶切鑒定（B）Fig.1 PCR amplifi cation of SsMps gene (A) and identifi cation of pET22b/SsMps by double digestion (B)

圖2 重組SsMps蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinent SsMps protein

2.3 抗SsMps蛋白單抗制備、效價(jià)測(cè)定及亞型鑒定以SsMps蛋白為抗原，經(jīng)動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合和篩選等過(guò)程，最終獲得1株抗SsMps蛋白的單克隆抗體1D9，用辛酸-硫酸銨沉淀法純化出高純度抗體（圖3A）。以純化的SsMps重組蛋白為檢測(cè)原（5 μg/mL），采用間接ELISA的方法測(cè)定單抗的效價(jià)，結(jié)果達(dá)到了1:2.56×105。采用亞型鑒定試劑盒鑒定出抗體亞型重鏈為IgG1，輕鏈為κ鏈，結(jié)果見(jiàn)圖3B。

圖3 抗SsMps單克隆抗體的SDS-PAGE分析（A）及亞型鑒定（B）Fig.3 SDS-PAGE analysis of purifi ed anti-SsMps monoclonal antibody (A) and subtype identifi cation of the antibody (B)

2.4 單克隆抗的特異性檢測(cè) 為了檢測(cè)獲得的ID9對(duì)SsMps的特異性，我們制備了05ZYH33菌株的不同菌體組分，包括細(xì)胞壁蛋白（胞壁）、膜蛋白（胞膜）、胞內(nèi)蛋白（胞內(nèi)）和分泌蛋白（胞外）（圖4A）。通過(guò)單克隆抗體ID9與各菌體蛋白組分進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示胞壁蛋白組分中出現(xiàn)了多個(gè)條帶，大小約呈倍數(shù)，最小條帶分子量約55 kDa。胞外蛋白組分中只出現(xiàn)了微弱的最小分子量的條帶，胞膜和胞內(nèi)蛋白組分中沒(méi)有出現(xiàn)任何條帶（圖4B）。這與鏈球菌中菌毛骨架蛋白呈不同聚體形式存在相符，并與相關(guān)研究中的結(jié)果類似[8,13]。除了這些大小呈倍數(shù)的蛋白條帶，沒(méi)有擴(kuò)增出其他條帶，說(shuō)明制備的的單克隆抗體特異性良好。需要指出的是，檢測(cè)出的SsMps單體蛋白分子量約55 kDa，較預(yù)測(cè)的分子量（45 kDa）略大。

3 討論

Ss2是一種重要的人獸共患傳染病病原體，其致病因子和致病機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。Ss2菌株05ZYH33的SsMps組裝于菌體表面，與宿主環(huán)境直接接觸，可能在Ss2致病中起重要作用。我們研究發(fā)現(xiàn)它具有結(jié)合宿主免疫因子的能力，但是對(duì)其具體功能的深入研究，需要純化的SsMps蛋白和單克隆抗體。

圖4 05ZYH33菌體組分提?。ˋ）和抗SsMps單克隆抗體對(duì)05ZYH33菌體組分的Western blot分析（B）Fig.4 05ZYH33 cell fraction isolation and Western blot analysis of anti-SsMps monoclonal antibody against cell protein fractions of 05ZYH33 (B)

本研究成功構(gòu)建了pET22b/SsMps表達(dá)載體，對(duì)目的蛋白進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)過(guò)大量表達(dá)純化獲得了高純度的SsMps蛋白。以此蛋白為免疫原免疫小鼠獲得了穩(wěn)定分泌抗SsMps蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。Western blot結(jié)果顯示，本研究獲得的單克隆抗體1D9能夠特異識(shí)別SsMps，并檢測(cè)出SsMps主要存在于Ss2的胞壁上，呈不同聚體狀態(tài)存在，這與SsMps是LPXTG蛋白及菌毛骨架蛋白的特性相符。同時(shí)本研究檢測(cè)出SsMps蛋白分子量約55 kDa，較預(yù)測(cè)的分子量略大。我們推測(cè)在SsMps作為菌毛骨架，天然狀態(tài)下可能共價(jià)連接有小分子量的寡糖或肽，但這還有待進(jìn)一步證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)獲得的SsMps蛋白和抗SsMps的單克隆抗體1D9，為深入研究SsMps的功能以及SsMps在Ss2致病性中的作用提供了工具。

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EXPRESSION AND PURIFICATION OF SsU05-0474 OF STREPTOCOCCUS SUIS 05ZYH33 AND PREPARATION OF SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODY

YANG Bao-ling1, CHEN Fu-guang2, XIE Fang2, LIU Si-guo2, SHEN Guo-shun1, ZHANG Yue-ling2
(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, Shengyang 110866, China; 2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, CAAS, Harbin 150001, China)

To determine the location and formation of the major pilus subunit SsU05-0474 (SsMps) in Streptococcus suis serotype 2 (Ss2), the gene coding for SsMps was amplifi ed in PCR from the genome of Streptococcus suis serotype 2 strain 05ZYH33 and cloned into pET22b to construct the expression plasmid pET22b/SsMps, which was then transformed into E.coli BL21(DE3).The recombinant SsMps was expressed with induction of IPTG and purified in affinity chromatography.BALB/c mice were immunized with purified SsMps.The anti-SsMps monoclonal antibody was prepared via cell fusion and subsequent screening.The results showed that the recombinant SsMps protein, with a molecular mass of about 45 kDa, was expressed as soluble form.About 30 mg of SsMps with purity above 95% could be obtained from 1 L of E.coli culture.One monoclonal antibody 1D9 was obtained and determined to be subtype of IgG1 with κ chain.As demonstrated in Western blot, the monoclonal antibody ID9 specifi cally reacted with natural SsMps in cellularwall fraction of 05ZYH33 and SsMps was presentas polymers with different lengths.The availability of purified SsMps protein and monoclonal antibody laid solid foundation for further research on its functions.

Streptococcus suis serotype 2; SsMps gene; protein expression; protein purifi cation; monoclonal antibody

S852.61

A

1674-6422（2016）02-0025-06

2016-01-06

楊寶玲，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

沈國(guó)順，E-mail：shengguoshun2000@126.com；張躍靈，E-mail：zhangyueling@caas.cn