王 鑫，楊德強(qiáng)，張文超，姜一峰，虞凌雪，楊 莘，高 飛，李麗薇，黃勤峰，童光志，周艷君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒JX14T2毒株的分離與鑒定

王 鑫，楊德強(qiáng)，張文超，姜一峰，虞凌雪，楊 莘，高 飛，李麗薇，黃勤峰，童光志，周艷君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

江西省某豬場(chǎng)育肥豬群出現(xiàn)高熱、呼吸困難和死亡等癥狀，為確定疫病病原，本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病豬場(chǎng)隨機(jī)采取20份病死豬血樣和組織，用RT-PCR的方法進(jìn)行病原檢測(cè)。結(jié)果顯示，19份臨床樣品呈現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）陽(yáng)性。隨后對(duì)病死豬肺組織進(jìn)行病毒分離，結(jié)果顯示分離的第1代病毒感染后48 h即可出現(xiàn)典型的致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），對(duì)傳至第5代的病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)和間接免疫熒光鑒定，結(jié)果證實(shí)我們分離獲得的病毒為PRRSV，命名為JX14T2。將JX14T2 P5代次的病毒與高致病性PRRSV強(qiáng)、弱毒代表株進(jìn)行生長(zhǎng)特性比較分析，結(jié)果顯示，JX14T2在Marc-145細(xì)胞上形成的細(xì)胞病變、病毒噬斑形態(tài)以及病毒增殖動(dòng)態(tài)均與HP-PRRSV毒株相似。對(duì)JX14T2進(jìn)行全長(zhǎng)基因測(cè)序和序列比較分析，結(jié)果表明JX14T2基因組全長(zhǎng)14 960 bp，屬于北美型毒株，其N(xiāo)SP2除存在的1+29個(gè)氨基酸的缺失而外，在598～717 aa還存在120個(gè)氨基酸的缺失，與HP-PRRSV親緣關(guān)系較近。本研究結(jié)果為掌握PRRSV流行情況以及致病機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；JX14T2；分離；鑒定

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病為特征的傳染病[1]。1987年，PRRS首發(fā)于美國(guó)，隨后遍布全球。PRRSV的基因型主要分為歐洲型和美洲型，在我國(guó)主要流行美洲型。PRRSV基因組長(zhǎng)度為15 kb左右，具有5'和3'非編碼區(qū)，有至少10個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）：ORF1a、ORF1b、ORF2～ORF7。ORF1a和ORF1b編碼病毒復(fù)制酶，可分為1～12個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein，NSP），ORF2～ORF7編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白[2]。其中，NSP2為非結(jié)構(gòu)蛋白中具有多功能的病毒RNA復(fù)制相關(guān)蛋白，也是各毒株之間變異較大基因編碼區(qū)。2006年我國(guó)爆發(fā)高致病性PRRSV（HP-PRRSV），該毒株與經(jīng)典的VR-2332株和CH-1a株相比，除了NSP2基因存在大量的核苷酸點(diǎn)突變而外，最具特征的是NSP2還存在1+29個(gè)氨基酸缺失[3,4]。盡管已有研究表明新出現(xiàn)的1+29個(gè)氨基酸缺失與HP-PRRSV的致病性增強(qiáng)無(wú)關(guān)[5]，但是NSP2基因高頻率變異的潛在意義仍然值得引人深思。目前針對(duì)PRRSV疫情的防控主要通過(guò)疫苗免疫。隨著一系列HP-PRRSV傳代致弱的弱毒苗的廣泛使用，HP-PRRS的疫情已得到有效控制[6]，但是PRRSV的地方性流行和散發(fā)所帶來(lái)的危害仍不容忽視。近期江西省某豬場(chǎng)育肥豬群出現(xiàn)高熱、呼吸困難和死亡等臨床癥狀，本研究采集了病死豬的病料樣本，對(duì)其進(jìn)行病原檢測(cè)和病毒分離，以確定此次疫情的病因，為該豬場(chǎng)有效控制疫情提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒、細(xì)胞和樣品來(lái)源 PRRSV強(qiáng)毒HuN4株、傳代致弱的HuN4-F112株和Marc-145細(xì)胞均由本研究室保存，病料樣品采集自江西省某發(fā)病豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；cDNA合成試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；pMD18-T 載體、LA Taq DNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；PRRSV 特異性N和M蛋白單抗由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存[7,8]；FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自Inc公司。

1.3 樣品核酸提取及RT-PCR檢測(cè) 按照RNeasy Mini Kit說(shuō)明書(shū)提取樣品的總RNA，再根據(jù)cDNA合成試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用實(shí)驗(yàn)室已有的PRRSV、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）和豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）特異性鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定[4]。

1.4 病毒的分離 取檢測(cè)為陽(yáng)性的肺臟組織研磨，10 800×g 離心5 min，樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾獲取病毒感染液，吸取500 μL感染單層Marc-145細(xì)胞，37℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，隨后棄去感染液，加入含有2% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）。出現(xiàn)80%CPE時(shí)，收取病毒液，并傳代至P5代，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分離病毒的鑒定 提取分離病毒細(xì)胞上清RNA，方法同上。用鑒定檢測(cè)引物對(duì)分離病毒進(jìn)行擴(kuò)增，將回收純化的PCR產(chǎn)物克隆在pMD18-T 載體，測(cè)序。同時(shí)將分離PRRSV毒株感染Marc-145細(xì)胞，48 h后冰甲醇固定細(xì)胞，分別用針對(duì)PRRSV N蛋白和M蛋白的特異性單抗進(jìn)行間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay，IFA）檢測(cè)，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 分離毒株病變特性比較 將新分離的PRRSV JX14T2 P5代病毒與高致病性PRRSV強(qiáng)毒HuN4和弱毒HuN4-F112分別以0.01 MOI的劑量感染Marc-145細(xì)胞，分別在感染后36、60 h觀察CPE。

1.7 病毒生長(zhǎng)曲線的繪制 采用多步法將新分離的PRRSV JX14T2 P5代病毒與PRRSV強(qiáng)毒HuN4和弱毒HuN4-F112分別以0.01 MOI的劑量感染Marc-145細(xì)胞，分別于感染后12、24、36、48、72 h收取細(xì)胞上清液，測(cè)定TCID50，繪制其生長(zhǎng)曲線。

1.8 病毒全長(zhǎng)基因擴(kuò)增及序列分析 提取JX14T2 P5代病毒的基因組，利用文獻(xiàn)[4]報(bào)道的方法對(duì)其全長(zhǎng)基因進(jìn)行分段擴(kuò)增，將回收純化的PCR產(chǎn)物克隆在pMD18-T 載體后進(jìn)行測(cè)序和拼接，對(duì)獲得的JX14T2 P5全長(zhǎng)基因利用軟件Lasergene，MEGA 6 進(jìn)行序列比較分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品的檢測(cè) 對(duì)采集的20份臨床樣品用特異引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示其中19份呈現(xiàn)PRRSV陽(yáng)性，擴(kuò)增條帶大小與HP-PRRSV HuN4陽(yáng)性對(duì)照一致（圖1），而樣品中CSFV、JEV、PRV、PPV等檢測(cè)均呈陰性（圖略）。

圖1 20份臨床樣品PRRSV RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection of PRRSV in 20 samples by RT-PCR

2.2 病毒的分離 將臨床樣品處理后，接種Marc-145單層細(xì)胞，結(jié)果顯示接種后48 h后可觀察到明顯CPE，感染的細(xì)胞出現(xiàn)聚集成簇、隆起，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)伴有少量細(xì)胞脫落（圖略）。感染后72 h收獲分離的病毒，并將其命名為JX14T2。

2.3 分離病毒的RT-PCR及IFA鑒定 將分離獲得的JX14T2毒株在Marc-145細(xì)胞上連續(xù)傳至 P5代，提取JX14T2 P5代病毒的RNA，進(jìn)行PRRSV特異性RTPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示其擴(kuò)增條帶大小與HP-PRRSV HuN4陽(yáng)性對(duì)照相似（圖略）。進(jìn)一步利用抗PRRSV N蛋白和M蛋白特異性單抗對(duì)JX14T2感染后的Marc-145細(xì)胞進(jìn)行IFA，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，JX14T2感染后的Marc-145細(xì)胞胞漿中均呈現(xiàn)特異性熒光，證實(shí)我們所分離得到的JX14T2毒株為PRRSV毒株（圖2）。

圖2 JX14T2株感染Marc-145細(xì)胞的IFA鑒定Fig.2 Detection of JX14T2 strain in Marc-145 cell by IFA

2.4 PRRSV JX14T2株生長(zhǎng)特性比較 新分離獲得的PRRSV JX14T2株感染Marc-145細(xì)胞所引起的CPE較為集中、聚集，同強(qiáng)毒HuN4株感染所引起的CPE相似，而弱毒HuN4-F112株形成的CPE較為彌散，呈網(wǎng)狀（圖3）。JX14T2感染Marc-145細(xì)胞所形成的噬斑形態(tài)也與HuN4株形成的病毒噬斑形態(tài)相近，而HuN-F112株形成的噬斑形態(tài)則較大而彌散（圖4）。

2.5 JX14T2株在Marc-145細(xì)胞上的增殖動(dòng)態(tài)比較 以相同劑量（0.01MOI）感染Marc-145細(xì)胞，比較JX14T2株與HuN4株和HuN4-F112株在Marc-145細(xì)胞上的增殖動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示，在感染48 h前3株病毒增殖幅度較大，其中HuN4-F112增殖滴度最高，HuN4增殖滴度最低，而JX14T2株增殖滴度居于二者之間，且與HuN4株在Marc-145細(xì)胞上的增殖動(dòng)態(tài)趨勢(shì)相近（圖5）。

2.6 JX14T2株基因序列分析 對(duì)JX14T2株進(jìn)行全長(zhǎng)基因測(cè)序和拼接，結(jié)果顯示，JX14T2株全基因長(zhǎng)度為14 960 bp（不包含polyA），序列比較分析顯示以HuN4株為代表的HP-PRRSV變異株全長(zhǎng)基因?yàn)?5 320 bp。JX14T2株在NSP2區(qū)域除了具有1+29個(gè)氨基酸的缺失外，相對(duì)于HuN4類(lèi)毒株，其下游在598～717 aa的位置還存在120 aa的連續(xù)缺失（圖6）。將JX14T2株與14株國(guó)內(nèi)外PRRSV代表性毒株的全基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示，JX14T2株屬于II型PRRSV株，且與HPPRRSV處于同一分支（圖7），與原株型VR-2332的同源性為89.4%，與HuN4株的同源性為98.9%，與CH-1a的同源性為94.9%（圖8）。

圖3 PRRSV JX14T2與HuN4株、HuN4-F112株感染Marc-145細(xì)胞CPE比較Fig.3 Cytopathic effect of Marc-145 cell infected with PRRSV JX14T2, HuN4 and HuN4-F112 strains

圖4 PRRSV JX14T2與HuN4株、HuN4-F112株蝕斑形態(tài)比較Fig.4 The plaque morphology of different PRRSV strains

圖5 PRRSV JX14T2與HuN4株、HuN4-F112株增殖動(dòng)態(tài)比較Fig.5 Growth curve of different PRRSV strains in Mac-145 cell

3 討論

我國(guó)目前流行PRRSV的主要為北美型PRRSV毒株[9,10]，在臨床上針對(duì)該病的預(yù)防手段主要是依賴(lài)于疫苗免疫，目前國(guó)內(nèi)用于防控PRRS的疫苗除了商品化的滅活疫苗而外，還有由經(jīng)典毒株和高致病性毒株弱化而來(lái)的兩類(lèi)商品化的活疫苗，每類(lèi)活疫苗株又包含不同來(lái)源毒株。PRRS疫苗種類(lèi)較多，對(duì)預(yù)防PRRS的發(fā)生發(fā)揮了重要作用，但是由于諸多疫苗的交叉和普遍使用，又增加了對(duì)PRRSV防控難度，如在疫苗免疫壓力下易造成PRRSV毒株的變異[4,11]，弱毒疫苗株可能會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)，野毒株和疫苗株在豬群中共存，可能會(huì)出現(xiàn)新型重組的PRRSV等。目前國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)新的PRRSV毒株出現(xiàn)的研究報(bào)道，如2006年我國(guó)暴發(fā)的HP-PRRSV的NSP2基因存在1+29 aa的缺失[3,4]。2008年美國(guó)分離獲得了1株新的HP-PRRSV命名為NADC30毒株，該毒株的特征是分別在NSP2蛋白的322～432 aa、483 aa 和504～522 aa區(qū)域存在111、1、19 aa缺失[12]。2013年在我國(guó)河南省某豬場(chǎng)，從疑似PRRSV癥狀的發(fā)病豬群病料中分離得到PRRSV毒株Henan-A10，該毒株在GP2蛋白的247～256 aa存在10 aa的缺失[13]。在對(duì)2013～2014年P(guān)RRSV毒株流行調(diào)查分析中發(fā)現(xiàn)，我國(guó)也存在NADC30樣毒株，此前報(bào)道該毒株主要流行于美洲，我國(guó)并未發(fā)現(xiàn)該毒株的存在，并推測(cè)其是由CH-1a與NADC30 的NSP2基因發(fā)生重組的演化而來(lái)的毒株[14]。由此可見(jiàn)，在自然條件下PRRSV還在不斷地進(jìn)行變異，因此及時(shí)監(jiān)測(cè)PRRSV在自然感染條件下的流行和進(jìn)化趨勢(shì)對(duì)于科學(xué)預(yù)防和控制該病是必要的。本研究采集的臨床樣品來(lái)自江西省某豬場(chǎng)中發(fā)生高熱、呼吸困難和死亡等臨床癥狀的育肥豬群，該豬場(chǎng)在發(fā)病之前一直使用經(jīng)典PRRSV弱毒疫苗株進(jìn)行免疫預(yù)防接種，未使用過(guò)HP-PRRSV弱毒疫苗。檢測(cè)結(jié)果顯示19份臨床樣品均呈現(xiàn)HPPRRSV陽(yáng)性，從肺臟組織樣品中分離得到的PRRSV毒株JX14T2，NSP2基因除了存在1+29 aa缺失以外，還存在120 aa的缺失，遺傳演化分析證實(shí)該毒株與HP-PRRSV毒株親緣關(guān)系較近。此外，對(duì)新分離的JX14T2毒株進(jìn)行生物學(xué)特性分析的結(jié)果顯示，該毒株在Marc-145細(xì)胞形成的CPE、噬斑形態(tài)及增殖動(dòng)態(tài)均與HP-PRRSV強(qiáng)毒株HuN4相似，我們推測(cè)新分離的PRRSV JX14T2株屬于自然感染的HP-PRRSV類(lèi)毒株，但該毒株對(duì)動(dòng)物的致病性如何尚不明確，還需要進(jìn)一步開(kāi)展研究。

圖6 JX14T2毒株NSP2基因氨基酸缺失區(qū)域比較Fig.6 The amino sequence comparison of NSP2 coding region between JX14T2 strain and reference strains

圖7 PRRSV JX14T2株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.7 Phylogenetic tree of JX14T2 strain

圖8 PRRSV毒株間同源性分析Fig.8 Homology analysis between different PRRSV strains

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CHARACTERIZATION OF A NEW HIGHLY PATHOGENIC JX14T2 STRAIN OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS

WANG Xin, YAMG De-qiang, ZHANG Wen-chao, JIANG Yi-feng, YU Ling-xue,YANG Shen, GAO Fei, LI Li-wei, HUANG Qin-feng, TONG Guang-zhi, ZHOU Yan-jun
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

To investigate the etiological agent causing high fever, dyspnea and death of fattening pigs on a pig farm in Jiangxi province, a total of 20 blood and tissue samples were collected from dead pigs and examined in RT-PCR.As a result, 19 out of 20 samples were positive for Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV).Then, one lung sample that was positive in RT-PCR was inoculated to Marc-145.The typical PRRSV-induced cytopathic effect (CPE) developed after 48 hours of inoculation.The viruses at the fi fth passage were demonstrated to be PRRSV in RT-PCR and IFA.Therefore, the isolate was confi rmed to be PRRSV designate as strain JX14T2.In addition, the strain JX14T2 showed similar characters to the highly pathogenic strains in formation of CPE and plague and growth curve in Marc-145.The sequence analysis of the strain JX14T2 showed that its complete genome was 14 960 bp and belonged toNorth American genotype.A continuous deletion of 120 aa between residues 598-717 was identifi ed in NSP2 protein, in which the 1+29 aa deletion existed that was typically found in HP-PRRSV.The characterization of the strain JX14T2 added new information for further understanding of epidemiology of PRRSV.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; JX14T2; isolation; identifi cation

S852.659.6

A

1674-6422（2016）02-0001-07

2016-02-02

973 計(jì)劃(2014CB542702)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2015BAD12B01-1)；國(guó)家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31302098、31300140、31502072）；上海市閔行區(qū)人才發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金

王鑫，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

周艷君，E-mail：yjzhou@shvri.ac.cn