楊永勝，陳 研，薛亞飛，徐欣欣，王 西，杜曉莉， MD Nazrul，宮艷杉，胡青海

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

鴨疫里默氏桿菌感染（Riemerella anatipestifer infection，RA）是鴨、鵝以及火雞等禽類(lèi)的一種接觸性傳染病[1]，其病死率可高達(dá)90%以上，病鴨消瘦、胴體品質(zhì)下降、疾病治療等給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]，是目前危害全世界養(yǎng)鴨業(yè)的一種主要的疾病。

自郭玉璞等[3]1982年首次報(bào)道北京鴨發(fā)生血清1型鴨疫里默氏桿菌感染、胡青海等[4]1997年首次在國(guó)內(nèi)發(fā)病鴨群分離鑒定到非血清1型鴨疫里默氏桿菌（后來(lái)鑒定為2型）以來(lái)，目前國(guó)內(nèi)鑒定的鴨疫里默氏桿菌血清型至少有13個(gè)[5]，鵝感染鴨疫里默氏桿菌的病例也時(shí)有報(bào)道[6-10]。近幾年來(lái)，隨著鴨疫里默氏桿菌病油乳劑滅活疫苗在鴨群中的推廣使用，鴨群因發(fā)生鴨疫里默氏桿菌引起大規(guī)模死亡的病例已很少見(jiàn)到，但目前相繼在江蘇、安徽和四川等地鵝群見(jiàn)到發(fā)生鴨疫里默氏桿菌病的病例，逐漸使鵝發(fā)生鴨疫里默氏桿菌感染的問(wèn)題突顯出來(lái)。早在1904年，Riemer[11]就報(bào)道了鵝發(fā)生的一種鵝滲出性敗血癥，這是最早報(bào)道的鴨疫里默氏桿菌感染鵝病例，所以鵝發(fā)生鴨疫里默氏桿菌感染并不奇怪，我們關(guān)注的是江蘇、安徽和四川等地飼養(yǎng)鵝一直就比較多，為什么以前鵝發(fā)生本病的病例沒(méi)有現(xiàn)在這樣突出，是因?yàn)橐郧傍喨喊l(fā)生的病例較多，使人們更多地去關(guān)注鴨群發(fā)生本病，還是因?yàn)檫@些地區(qū)鴨和鵝飼養(yǎng)量都很大，使一些原先感染鴨的鴨疫里默氏桿菌適應(yīng)鵝后，對(duì)鵝的致病性增強(qiáng)？或者鵝發(fā)生鴨疫里默氏桿菌病是否與菌株特性有關(guān)？這些鵝源鴨疫里默氏桿菌分離株對(duì)鴨的致病性怎樣？等等。本研究將從菌株的溶血特性、生物被膜形成能力、對(duì)雛鴨的致病性及對(duì)一些藥物的敏感性等對(duì)鵝源鴨疫里氏桿菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料不同血清型兔抗鴨疫里默氏桿菌陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 鵝源鴨疫里默氏桿菌的鑒定將從四川省不同發(fā)病鵝群分離到的4株疑似鴨疫里默氏桿菌克隆純化后，用雙重PCR對(duì)鴨疫里默氏桿菌16S rRNA和dnaB基因的進(jìn)行鑒定[12]，以鴨疫里默氏桿菌CH3株和大腸桿菌DH5α作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。鑒定到的4株鵝源鴨疫里默氏桿菌分別命名為SC-11、SC-12、SC-13和SC-17。

1.3 血清型鑒定參照文獻(xiàn)[13]方法，用玻片凝集法對(duì)4株鴨疫里默氏桿菌的血清型進(jìn)行鑒定。以鴨源鴨疫里默氏桿菌CH3株作為陽(yáng)性對(duì)照、以無(wú)菌PBS溶液作為空白對(duì)照。結(jié)果判定：菌液與血清混合后3 min內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀凝集者判為陽(yáng)性，不出現(xiàn)顆粒狀凝集者判為陰性，只出現(xiàn)輕微凝集的判為可疑。

1.4 溶血實(shí)驗(yàn)分別取4株鵝源鴨疫里默氏桿菌在TSB中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（D600=1.0左右）的菌液，離心后用PBS洗滌2次，再用同等體積PBS重懸。在含4%鴨血的血平板上打孔后，加入10 μL菌液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。觀察并記錄溶血現(xiàn)象。

1.5 生物被膜形成的測(cè)定將4株鵝源鴨疫里默氏桿菌、已知的鴨疫里默氏桿菌強(qiáng)生物被膜形成菌株CH3株和不形成生物被膜菌株NJ-1和HXb2株[14]，以及大腸桿菌DH5α的新鮮菌液（D600=1.0左右）用TSB作1∶200稀釋后，加入U(xiǎn)型底96孔板中，每孔200 μL，每株菌設(shè)立3個(gè)重復(fù)孔，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)24 h時(shí)用結(jié)晶紫染色法[14]檢測(cè)其生物被膜形成情況。最后每孔加入200 μL 75%乙醇充分溶解后，用BioTek酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔D595值。生物被膜形成能力的判定標(biāo)準(zhǔn)[14]：D595≥1.00為強(qiáng)生物被膜形成菌株；0.31

1.6 藥敏試驗(yàn)采用藥敏紙片擴(kuò)散法檢測(cè)了20種抗菌藥物的敏感性，包括青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、糖肽類(lèi)、磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、酰胺醇類(lèi)以及其他類(lèi)。取新鮮培養(yǎng)的菌液均勻涂布到TSA平板，藥敏片貼到平板后置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h，觀察并記錄抑菌圈直徑。

1.7 對(duì)雛鴨的致病性試驗(yàn)將新鮮培養(yǎng)的各株鵝源鴨疫里默氏桿菌菌液分別在TSA平板上劃線，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，用無(wú)菌PBS洗下并洗滌2次，最后用PBS重懸并調(diào)整菌數(shù)至6×109CFU/mL。每株細(xì)菌接種6日齡櫻桃谷鴨12只，每只經(jīng)腿部肌肉注射500 μL，觀察并記錄每株細(xì)菌接種后雛鴨的發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 血清型鑒定玻片凝集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：SC-11、SC-12株和陽(yáng)性對(duì)照CH3株均能與兔抗血清1型陽(yáng)性血清發(fā)生片狀凝集，與其他血清型的陽(yáng)性血清不發(fā)生凝集，鑒定為血清型1型；SC-13和SC-17株與1、2、6、10、14、15型陽(yáng)性血清均未出現(xiàn)凝集，未能確定血清型。陰性對(duì)照大腸桿菌DH5α不與以上任一血清型的陽(yáng)性血清發(fā)生凝集。

2.2 4株鵝源RA的溶血實(shí)驗(yàn)血平板置37℃培養(yǎng)24 h后，再4℃過(guò)夜。溶血結(jié)果如圖1所示，4株鵝源鴨疫里默氏桿菌在鴨血平板上均有溶血現(xiàn)象，其中SC-13和SC-17株在鴨血平板上出現(xiàn)明顯的溶血圈，以SC-13株的溶血能力最強(qiáng)，SC-17的溶血能力次之；而SC-11和SC-12株的溶血能力較弱。陰性對(duì)照J(rèn)Y-1株（另文報(bào)道）和PBS加樣孔周?chē)闯霈F(xiàn)溶血圈。

圖1 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Results of hemolytic activity of 4 RA strains

2.3 RA生物被膜形成實(shí)驗(yàn)采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定這4株鵝源RA和3株鴨源RA（CH3、NJ-1以及Hxb2）菌株以及大腸桿菌DH5α靜置培養(yǎng)24 h時(shí)的生物被膜形成能力，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明：鵝源RA分離株SC-12和SC-13株的生物被膜形成能力與已知的強(qiáng)生物被膜形成株CH3株相近；鵝源分離株SC-11、SC-17株和鴨源分離株NJ-1、HXb2株以及大腸桿菌DH5α的生物被膜形成能力較弱。

圖2 不同鴨疫里默氏桿菌菌株生物被膜形成能力Fig.2 The capacity of different R.anatipestifer strains to form biofilms, examined

2.4 藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果4株鵝源鴨疫里默氏桿菌的藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果如表1。結(jié)果表明：4株鵝源RA均對(duì)頭孢類(lèi)抗生素敏感，對(duì)多粘菌素，諾氟沙星耐藥，對(duì)另外14種抗生素表現(xiàn)不同程度的耐藥性。SC-11和SC-12對(duì)紅霉素、氧氟沙星、氨 西林敏感，而SC-13和 SC-17株對(duì)這三種抗生素完全耐受。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)室自1997年來(lái)分離到的鴨疫里默氏桿菌分離株均對(duì)卡那霉素完全耐受，但本研究中鵝源鴨疫里默氏桿菌分離株SC-11和SC-17株對(duì)卡那霉素敏感，且SC-17株對(duì)卡那霉素高度敏感。

2.5 對(duì)雛鴨的致病性實(shí)驗(yàn)記錄攻毒后10 d內(nèi)各組雛鴨的死亡情況。結(jié)果顯示：SC-11、SC-13、SC-17株攻毒的雛鴨100%（12/12）死亡；SC-12株攻毒鴨死亡41.7%（5/12）。表明這4株鵝源鴨疫里默氏桿菌分離株中有3株對(duì)雛鴨有較強(qiáng)的致病性。

3 討論

近幾年來(lái)從各地鵝群發(fā)生鴨疫里默氏桿菌感染的病例有增多的現(xiàn)象，為了分析其原因，我們對(duì)4株鵝源四川分離株的血清型、溶血能力、生物被膜形成能力、對(duì)藥物敏感性以及對(duì)雛鴨的致病性等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，以期分析這幾株鵝源鴨疫里默氏桿菌是否來(lái)自鴨源流行株。

表1 4株鵝源鴨疫里默氏桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Susceptibility of four isolates from goose to antibiotics

目前世界范圍內(nèi)已確認(rèn)的鴨疫里默氏桿菌血清型至少有21個(gè)，我國(guó)鴨源鴨疫里默氏桿菌分離株鑒定的血清型有10多個(gè)，其中1、2、6、10為優(yōu)勢(shì)血清型。本研究4株鵝源分離株的血清型至少有2種，前期已報(bào)道的國(guó)內(nèi)鵝源鴨疫里默氏桿菌分離株的血清型主要有血清1、2、11、15型等[6-10]。不同發(fā)病鵝群分離到的鴨疫里默氏桿菌血清型可能不同，與鴨源鴨疫里默氏桿菌分離株的血清型有著相似的復(fù)雜性，呈現(xiàn)區(qū)域性的特點(diǎn)。

細(xì)菌的溶血活性可能與其在感染宿主體內(nèi)的獲鐵相關(guān)，一些細(xì)菌的溶血活性與其致病性相關(guān)。本研究中4株鵝源鴨疫里默氏桿菌在血平板上均具有溶血活性，但溶血性弱的SC-11和SC-12株對(duì)雛鴨的致病性也較強(qiáng)，提示其溶血能力強(qiáng)弱與致病性強(qiáng)弱無(wú)直接相關(guān)性。

生物被膜是細(xì)菌在水相環(huán)境中為了黏附于生物或非生物表面分泌出的多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將自體包被于這種不均一的混合基質(zhì)中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物[15-16]，與細(xì)菌感染宿主的能力，以及致病性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明一些鴨疫里默氏桿菌能形成生物被膜，鴨疫里默氏桿菌在一些鴨場(chǎng)持續(xù)存在，可能與生物被膜中的鴨疫里默氏桿菌能在鴨場(chǎng)墊料等存活時(shí)間長(zhǎng)有關(guān)[14]。本研究中4株鵝源鴨疫里默氏桿菌分離株都能形成生物被膜，且其中2株的生物被膜形成能力較強(qiáng)。鵝源鴨疫里默氏桿菌是否通過(guò)形成生物被膜而在養(yǎng)鵝場(chǎng)持續(xù)存在有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

隨著抗生素在一些鴨場(chǎng)的廣泛使用，鴨疫里默氏桿菌耐藥性的問(wèn)題越來(lái)越受到人們的重視。 程安春等[17]對(duì)1993-1996年在四川各地發(fā)病鴨分離鑒定的25株鴨疫里默氏桿菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)測(cè)定，結(jié)果表明25個(gè)分離株對(duì)環(huán)丙沙星、氨 青霉素、羧 青霉素、先鋒霉素、潔霉素、土霉素、四環(huán)素高度敏感；對(duì)慶大霉素、新霉素、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素耐藥；胡青海等[4]測(cè)定了1995-1996年間在江蘇省和安徽省等地發(fā)病鴨分離鑒定的10株鴨疫里默氏桿菌對(duì)藥物的敏感性，結(jié)果表明這些菌株對(duì)羧 青霉素、氨 青霉素、氧呱嗪青霉素、頭孢唑啉均高敏（10/10）；對(duì)妥布霉素均耐藥；9/10菌株對(duì)紅霉素高敏；只有1株（1/10）對(duì)卡那霉素敏感。作者1998-2017年間分離的100余株鴨源鴨疫里默氏桿菌分離株均對(duì)卡那霉素耐受(未發(fā)表資料)，由于最早分離的那株卡那霉素敏感菌株已丟失，無(wú)法進(jìn)一步確認(rèn)，有時(shí)我們甚至懷疑鴨疫里默氏桿菌對(duì)卡那霉素是不是天然耐受的，且鴨疫里默氏桿菌中的卡那霉素抗性基因也可能是某種持家基因。本研究鑒定到有2株鵝源鴨疫里默氏桿菌分離株對(duì)卡那霉素敏感，這是本實(shí)驗(yàn)室近20年來(lái)首次鑒定到對(duì)卡那霉素敏感（其中1株高敏）的鴨疫里默氏桿菌，這推翻我們之前的推測(cè)，也提示這2株鴨疫里默氏桿菌可能與我們前面分離的鴨源鴨疫里默氏桿菌不是同一來(lái)源，這2株對(duì)卡那霉素敏感的鵝源鴨疫里默氏桿菌是從哪里來(lái)的，尚需進(jìn)一步跟蹤分析。4株鵝源鴨疫里默氏桿菌對(duì)雛鴨的致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，這些菌株對(duì)鵝和鴨都是致病性的，在理論上存在自然感染過(guò)程中鴨源鴨疫里默氏桿菌傳播鵝、鵝源鴨疫里默氏桿菌傳播鴨的可能，但也需要進(jìn)一步跟蹤分析。