聶青青，張 璇，黃 攀，單文杰

（1.贛州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西贛州 341000；2.墊江縣市政服務(wù)中心，重慶 408300；3.巴南區(qū)人民政府蓮花街道農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，重慶 401321；4.共青城市農(nóng)業(yè)農(nóng)村水利局，江西九江 332020）

肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae）屬腸桿菌科（Enterobaeteriaceae）、克雷伯菌屬（Klebsiella），為革蘭氏陰性短桿菌，是1種人畜共患病病原，也是引起多種動(dòng)物患病的條件性致病菌，可引起肺炎、敗血癥、化膿性感染、支氣管炎、尿路感染及腦膜炎等[1-3]。現(xiàn)有研究表明，菌毛是肺炎克雷伯菌的1種主要的毒力因子[4-5]。在感染過程中，細(xì)菌通過菌毛接近宿主黏膜表面或者吸附于宿主細(xì)胞，進(jìn)而使機(jī)體致病[6]。肺炎克雷伯菌的菌毛可分為Ⅰ型和Ⅲ型菌毛[7]。Ⅰ型菌毛屬于甘露糖敏感性（mannose-sensitive hemagglutination，MSHA）菌毛，即甘露糖存在時(shí)會(huì)阻斷菌毛與紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象，主要附著于尿道上皮細(xì)胞；Ⅲ型菌毛具有甘露糖抵抗血凝特性（mannose-resistant hemagglutination，MRHA），又稱為甘露糖抵抗血凝特性菌毛，主要附著于呼吸道上皮細(xì)胞[8]。上述兩種菌毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位基因?yàn)閒imA和mrkA[9]。Ⅰ型菌毛由一組fim（B、E、A、I、C、D、F、G、H）基因群所表達(dá)，fimA是負(fù)責(zé)表達(dá)Ⅰ型菌毛柄的結(jié)構(gòu)基因；Ⅲ型菌毛由一組mrk（E、A、B、C、D、F）基因群所表達(dá)，mrkA是負(fù)責(zé)表達(dá)Ⅲ型菌毛柄的結(jié)構(gòu)基因。

本研究對(duì)近年在重慶、四川部分肉牛場分離到的20株肺炎克雷伯菌進(jìn)行了MSHA/MRHA試驗(yàn)，鑒定其菌毛類型，并對(duì)20株菌的fimA基因和mrkA基因進(jìn)行了測序及氨基酸序列分析。研究旨在揭示川渝地區(qū)克雷伯菌菌毛類型與fimA基因和mrkA基因的變異特點(diǎn)，為深入研究其致病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

通過棉拭子的方法采集重慶、四川部分肉牛場的牛上呼吸道黏液，分離細(xì)菌；通過生化試驗(yàn)、16S rRNA鑒定出20株肺炎克雷伯菌，分別編號(hào)為K.pn1～K.pn20，其中K.pn4、K.pn11、K.pn20分離自四川，其余分離自重慶。SPF豚鼠購自重慶市中藥研究院。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

D-甘露糖（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、DNA回收試劑盒（廣州飛揚(yáng)生化有限公司）、PCR試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）；小劑量DNA提取試劑盒、DL2000DNA Marker（生工生物工程（上海）有限公司）；改良Minka液體培養(yǎng)基、2%豚鼠紅細(xì)胞懸液等。

1.3 主要儀器

AR1140/C電子分析天平（上海奧豪斯公司）、LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械）、DYY-6C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、S10000PCR儀（Thermal Cycler）、TGL-16高速冷凍離心機(jī)等。

1.4 MSHA/MRHA試驗(yàn)

按照參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。將各菌株分別經(jīng)改良Minka液體培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)48 h，同樣培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代3次，即為菌毛化菌體。菌毛化菌體制成約50億CFU/mL細(xì)菌懸液，每株菌分為不加D-甘露糖和加D-甘露糖（終濃度為0.5%）的兩個(gè)樣本，加入等量2%豚鼠紅細(xì)胞懸液，設(shè)生理鹽水空白對(duì)照；振蕩后4℃保存2 h，觀察血球凝集反應(yīng)和D-甘露糖是否抑制凝集。將甘露糖抵抗血凝試驗(yàn)陽性的菌株，4℃條件下完全凝集，37℃靜置30 min，檢查凝集現(xiàn)象是否被解脫。凝集解脫后，重新混勻4℃保存1.5 h，觀察是否再現(xiàn)凝集反應(yīng)。能夠凝集豚鼠紅細(xì)胞的菌株可判定MSHA反應(yīng)陽性；若37℃出現(xiàn)解脫，4℃又重現(xiàn)凝集反應(yīng)，可判定為MRHA反應(yīng)陽性。

1.5 fimA和mrkA基因的PCR擴(kuò)增、測序

20株菌毛化菌體經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)后，核酸提取試劑盒提取其DNA，PCR擴(kuò)增fimA和mrkA基因序列，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

PCR反應(yīng)體系（25μL）：上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、ddH2O 9.5μL、DNA模板2μL、2×mix DNA聚合酶預(yù)混液12.5μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，56.5℃30 s，72℃40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

Ⅰ型菌毛菌株的PCR反應(yīng)體系與Ⅲ型相同，但反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃35 s，30個(gè)PCR循環(huán)；72℃10 min。

反應(yīng)結(jié)束后取5.0μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果。DNA回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收與純化，由上海生物工程有限公司測序。

1.6 序列分析

測序結(jié)果利用MEGA軟件與GenBank中登錄的fimA和mrkA基因序列進(jìn)行同源性比較，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。同時(shí)將基因翻譯成氨基酸序列，進(jìn)行氨基酸序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1肺炎克雷伯菌MSHA/MRHA試驗(yàn)結(jié)果（見圖1）

由圖1可知，將20株菌毛化肺炎克雷伯菌進(jìn)行MSHA/MRHA試驗(yàn)后，結(jié)果顯示，有5株菌株不能抵抗D-甘露糖的抑制作用，其余均能夠抵抗D-甘露糖的抑制作用，且在37℃下均可被解脫，在4℃下重現(xiàn)完全凝集，符合MRHA陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，陰性對(duì)照組無自凝現(xiàn)象。

上述結(jié)果表明，該20株肺炎克雷伯菌中產(chǎn)生Ⅰ型菌毛的有5株，為：K.pn16～K.pn20；產(chǎn)生Ⅲ型菌毛的有15株，為：K.pn1～K.pn15。

2.2 肺炎克雷伯菌基因的PCR鑒定（見圖2、圖3）

由圖2、圖3可知，20株供試菌株中，有5株菌針對(duì)Ⅰ型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位基因（fimA）序列的引物擴(kuò)增出549 bp的目的片段；15株菌針對(duì)Ⅲ型菌毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位基因（mrkA）序列的引物擴(kuò)增出609 bp的目的片段，與預(yù)期的大小相符，且PCR鑒定結(jié)果的肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株和Ⅲ型菌毛菌株與MSHA/MRHA試驗(yàn)結(jié)果相符。

2.3 序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（見圖4）

研究中的5株fimA基因和15株mrkA基因與GenBank中登錄的fimA和mrkA基因序列進(jìn)行同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，fimA基因核苷酸序列的同源性為82.6%～98.9%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性為90.9%～97.7%，mrkA基因核苷酸序列的同源性為80.7%～99.7%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性84.1%～100%。5個(gè)fimA基因與代表株NZ_CP009461.1的核苷酸序列同源性為83.1%～99.0%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性為90.3%～97.7%；15個(gè)mrkA基因與代表株AOGO01000023.1的核苷酸序列同源性80.7%～99.7%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性為84.1%～100.0%。

由圖4可知，分離株菌毛類型有Ⅰ型和Ⅲ型，Ⅰ型菌毛共5株，Ⅲ型菌毛菌株居多（15株）。

Ⅲ型菌毛菌株可分為4個(gè)分支，其中6個(gè)分離株（K.pn1～K.pn6）與AOGO01000023.1株同屬一個(gè)分支。

2.4 重慶、四川部分肉牛場的肺炎克雷伯菌氨基酸突變位點(diǎn)比對(duì)分析（見表2、表3）

由表2可知，測序的5個(gè)fimA氨基酸序列（菌毛類型均為Ⅰ型）與代表株NZ_CP009461.1比較，可分為2個(gè)分支，K.pn20與K.pn19為同一支，均僅在95位氨基酸位點(diǎn)存在特異性變異。K.pn16、K.pn17和K.pn18存在12個(gè)氨基酸差異，K.pn16和K.pn17均在19、95、97、101、104、118、129、133、142、151、170位氨基酸位點(diǎn)存在特異性變異，K.pn18在19、74、95、97、118、129、151、170氨基酸位點(diǎn)存在特異性差異，并在74位出現(xiàn)特有的變異。

表2 重慶、四川部分肉牛場的肺炎克雷伯菌fimA氨基酸突變位點(diǎn)比對(duì)分析Tab.2 Comparative analysis of fimA amino acid mutation sites of Klebsiellapneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan

由表3可知，測序的15個(gè)mrkA氨基酸序列（菌毛類型均為Ⅲ型）與代表株AOGO01000023.1比較，存在多個(gè)位點(diǎn)存在差異，分離株兩分支間有32個(gè)氨基酸存在差異。其中K.pn3分離株在20位出現(xiàn)特有變異，K.pn12分離株在17位出現(xiàn)特有變異，K.pn10分離株在70、187位出現(xiàn)特有變異，K.pn11分離株在132、181、185位出現(xiàn)特有變異，K.pn15分離株在115、119、144、146、175位出現(xiàn)特有變異。

表3 重慶、四川部分肉牛場的肺炎克雷伯菌mrkA氨基酸突變位點(diǎn)比對(duì)分析Tab.3 Comparative analysis of mrkA amino acid mutation sites of Klebsiellapneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan

續(xù)表3 重慶、四川部分肉牛場的肺炎克雷伯菌mrkA氨基酸突變位點(diǎn)比對(duì)分析Tab.3（continue）Comparative analysis of mrkA amino acid mutation sites of Klebsiellapneumoniae in some beef cattle farms in Chongqing and Sichuan

3 討論

本研究通過MSHA/MRHA試驗(yàn)和PCR方法，鑒定出近年重慶、四川部分肉牛場的20株肺炎克雷伯菌的菌毛類型。其中有5株為Ⅰ型菌毛，占25%；15株為Ⅲ型菌毛，占75%。來自四川的3株菌株中的1株是Ⅰ型菌毛，2株是Ⅲ型菌毛。分離自重慶的17株，其中4株是Ⅰ型菌毛，占23.5%；13株屬于Ⅲ型菌毛，占76.5%。本研究結(jié)果表明，重慶、四川肉牛所感染的肺炎克雷伯菌主要產(chǎn)Ⅲ型菌毛，進(jìn)行肺炎克雷伯菌感染的防控應(yīng)該更重視Ⅲ型菌毛。

MSHA/MRHA試驗(yàn)法確定菌毛類型較煩瑣、耗時(shí)。何禮洋等[11]、劉選梅等[12]報(bào)道，采用PCR方法可快速區(qū)分鑒別Ⅰ型、Ⅲ型菌毛肺炎克雷伯菌，與MSHA/MRHA試驗(yàn)相比更加敏感、快速、方便。本研究結(jié)果表明，運(yùn)用PCR對(duì)菌毛進(jìn)行分型，試驗(yàn)結(jié)果與MSHA/MRHA試驗(yàn)一致：MSHA/MRHA試驗(yàn)法鑒定出Ⅰ型菌毛的5株菌株均擴(kuò)增出了約549 bp大小的特異片段，而MSHA/MRHA試驗(yàn)法鑒定出Ⅲ型菌毛的15株菌株均擴(kuò)增出了約609 bp大小的特異片段。PCR法鑒定菌株菌毛類型可避免MSHA/MRHA試驗(yàn)的局限性，且更加快速、準(zhǔn)確、方便。

進(jìn)化樹是描述生物體形成或進(jìn)化順序的拓?fù)錁浣Y(jié)構(gòu)，一般由一系列節(jié)點(diǎn)和分支組成，節(jié)點(diǎn)間的連線代表物種之間的親緣關(guān)系[13]。為闡明fimA基因在各Ⅰ型菌毛菌株間及mrkA基因在各Ⅲ型菌毛菌株的進(jìn)化關(guān)系，采用鄰接法作進(jìn)化樹構(gòu)建。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，15株Ⅲ型菌毛的菌株可以分成4個(gè)分支，說明各區(qū)縣間的肺炎克雷伯菌菌毛類型進(jìn)化關(guān)系存在差異。

根據(jù)fimA和mrkA氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，本研究菌株的fimA和mrkA氨基酸序列存在多處變異；與參考菌株比較，fimA中12處位點(diǎn)存在變異，marA中32處氨基酸位點(diǎn)存在變異。四川株的fimA氨基酸序列相對(duì)于重慶株變異較少，如菌株K.pn20僅在95位氨基酸位點(diǎn)存在變異；重慶株除K.pn19與K.pn20相同，僅在95位氨基酸位點(diǎn)存在變異，其余分離株存在8～11個(gè)氨基酸存在差異。mrkA氨基酸序列的分離株有32個(gè)氨基酸存在差異，K.pn1～K.pn9氨基酸變異少，發(fā)生氨基酸變異位點(diǎn)0～3之間，其余6株菌氨基酸變異8～18個(gè)。

氨基酸的變異不僅表示基因的多態(tài)性，還可能表示蛋白質(zhì)的功能、菌株的致病性等特征發(fā)生變化。肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株aa95發(fā)生了氨基酸替代并由親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被?，K.pn16和K.pn17在aa19、aa118和aa142位點(diǎn)均由親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被?，K.pn18在aa19和aa118由親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被帷＂裥途じ阶饔玫年P(guān)鍵在于疏水能力的大小[14]，排斥水分子的能力增加時(shí)細(xì)菌菌毛的黏附能力更強(qiáng)，宿主機(jī)體更易致病。Ⅲ型菌毛的表達(dá)與細(xì)菌表面疏水性、致病性相關(guān)[15]，當(dāng)菌毛主要亞單位組成的疏水性氨基酸的比例增高時(shí)，Ⅲ型菌毛可提高肺炎克雷伯菌表面疏水性。

本研究中Ⅲ型菌毛菌株K.pn11～K.pn15中aa86、aa167、aa182均發(fā)生了氨基酸替代，mrkA氨基酸187個(gè)位點(diǎn)中28.13%的氨基酸由親水性變?yōu)槭杷?；因此，預(yù)測相應(yīng)菌株的黏附能力可能增強(qiáng)，毒力更強(qiáng)。

4 結(jié)論

MSHA/MRHA試驗(yàn)法對(duì)本研究的20株肺炎克雷伯菌敏感性不高。通過PCR方法，鑒定出20株肺炎克雷伯菌中有5株為Ⅰ型菌毛，15株為Ⅲ型菌毛，重慶、四川肉牛所感染的肺炎克雷伯菌主要產(chǎn)Ⅲ型菌毛，且各區(qū)縣之間的肺炎克雷伯菌菌毛類型進(jìn)化關(guān)系存在差異；分析fimA和mrkA氨基酸序列后發(fā)現(xiàn)，fimA中12處位點(diǎn)存在變異，mrkA中32處氨基酸位點(diǎn)存在變異，肺炎克雷伯菌Ⅰ型菌毛菌株aa95發(fā)生了氨基酸替代并由親水性氨基酸變?yōu)榱耸杷园被幔笮途闗.pn7、K.pn8和K.pn9在164位氨基酸上均發(fā)生了S164A。因此，預(yù)測相應(yīng)菌株的黏附能力可能增強(qiáng)，毒力更強(qiáng)。