劉明，肖自添，邱耀明，邱桂根，何煥清**

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，廣東廣州510640；2.廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東廣州510640；3.珠海市東大食用菌新技術研究有限公司，廣東珠海519101）

茶樹菇液體菌種培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的篩選及其應用*

劉明1，2，肖自添1，2，邱耀明3，邱桂根3，何煥清1，2**

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，廣東廣州510640；2.廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東廣州510640；3.珠海市東大食用菌新技術研究有限公司，廣東珠海519101）

茶樹菇（Agrocybe cylindracea）液體菌種的培養(yǎng)是工廠化生產(chǎn)的關鍵技術和發(fā)展趨勢。本研究以廣昌2號茶樹菇作為供試菌株，通過搖瓶培養(yǎng)，以菌絲體生物量為指標，篩選到適合茶樹菇液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基為豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%，最適培養(yǎng)溫度為26℃，pH值6.5；通過栽培試驗發(fā)現(xiàn)茶樹菇液體菌種栽培周期短，相比固體菌種，更適合工廠化栽培應用。

茶樹菇；液體菌種；培養(yǎng)基；豆粕粉

茶樹菇（Agrocybe cylindracea）是一種珍稀的食用菌，富含人體所需的蛋白質、氨基酸和微量元素，不僅味美且具有廣泛的藥理作用[1-2]。最近的研究表明茶樹菇具有抗腫瘤、抗突變的活性，開發(fā)利用價值極大[3-5]。目前茶樹菇的栽培主要以季節(jié)性手工作坊式為主，使用的固體菌種要經(jīng)過母種、原種、栽培種三級培育后才能擴大到栽培生產(chǎn)環(huán)節(jié)。固體菌種因生產(chǎn)勞動強度大、生長周期長、污染率高等因素，制約了茶樹菇的發(fā)展[5]。而液體菌種在生產(chǎn)時有諸多優(yōu)點，例如發(fā)菌時間短、生長快速、污染率低等，因此推廣液體菌種將有助于茶樹菇的產(chǎn)量和質量的提高[6-7]。本研究主要通過對茶樹菇液體菌種培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件進行篩選，為應用液體菌種進行工廠化栽培茶樹菇提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗菌株

茶樹菇廣昌2號，為本實驗室保存。

1.2各種培養(yǎng)基制備

碳源篩選培養(yǎng)基，在基礎培養(yǎng)基（蛋白胨1%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%）中，分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉4種碳源，高溫高壓滅菌。

氮源篩選培養(yǎng)基，在基礎培養(yǎng)基（葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%）中，分別加入0.5%的蛋白胨、豆粕粉、麩皮、硫酸銨4種氮源。

培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)基：豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%。

固體菌種培養(yǎng)基：棉籽殼98%、麩皮1%、石膏1%。裝袋1 000 g，高溫高壓滅菌。

栽培培養(yǎng)基（棉籽殼培養(yǎng)基）：棉籽殼94%、麩皮5%、石膏1%。裝袋1 000 g，高溫高壓滅菌。

1.3菌種活化

將茶樹菇菌種接種到PDA培養(yǎng)基平板，26℃恒溫培養(yǎng)7 d，備用。

1.4碳源、氮源的篩選

將活化的菌種用直徑2 mm的打孔器，接種5塊到去掉瓊脂粉的PDA培養(yǎng)液中，26℃，160 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d后測定菌絲生物量。將培養(yǎng)好的菌種接種15 mL到篩選培養(yǎng)基中（500 mL三角瓶），裝液量200 mL，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.5液體培養(yǎng)基不同組分配比試驗

培養(yǎng)基中碳源、氮源、KH2PO4、MgSO4·7H2O各組分的濃度及其配比，按L9(34)設計四因素三水平正交試驗，重復3次。試驗設計見表1。

表1　正交試驗因子與水平L9(34)表Tab.1Factors and levels of the L9(34)orthogonal experiment

1.6菌絲體生物量測定

取50 mL液體培養(yǎng)基用8層紗布過濾，收集菌絲后用蒸餾水洗去多余豆粕粉，干燥箱50℃烘至恒重后稱量。

1.7固體菌種的制備

將活化好的菌種接種到棉籽殼培養(yǎng)基，在25℃左右條件下培養(yǎng)至滿袋。

1.8起始pH對菌絲體生物量的影響

按配比試驗得出的最適組合配制培養(yǎng)基，滅菌前用鹽酸或氫氧化鈉調節(jié)pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共6個梯度，重復3次，26℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d后，測定不同pH對菌絲體生物量的影響。

1.9最適發(fā)酵溫度篩選

在500 mL三角瓶中加入200 mL培養(yǎng)基，接入15 mL液體菌種，于160 r·min-1，并分別于20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃條件下培養(yǎng)，每個溫度重復3次，7 d后測定菌絲體生物量。

1.10出菇試驗

將固體和液體菌種分別接種25 g或25 mL到栽培培養(yǎng)基中，各100袋，25℃左右培養(yǎng)至滿袋，在26℃、相對濕度85%～90%條件下出菇兩茬，記錄相關信息。

1.11數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用Microsoft Excel 2007和SPSS Version 21軟件。

2　結果與分析

2.1茶樹菇液體菌種培養(yǎng)基配方篩選結果

2.1.1不同碳源對茶樹菇菌絲體生長的影響

以葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉4種不同碳源，研究碳源對茶樹菇液體菌種生長的影響，在各培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后測定菌絲生物量，見表2。

表2　碳源對茶樹菇液體培養(yǎng)的影響Tab.2Effect of different carbon source on the mycelial growth of Agrocybe cylindracea

由表2可見，茶樹菇菌絲在葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉3種碳源條件下，生物量差異不大，表明茶樹菇對碳源的利用較廣。但在以蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基上生物量相對較低，明顯低于其他3種碳源。

2.1.2不同氮源對茶樹菇菌絲體生長的影響

在基礎培養(yǎng)基中分別加入蛋白胨、豆粕粉、麩皮、硫酸銨4種氮源，不同氮源對茶樹菇液體培養(yǎng)的影響見表3。

表3　氮源對茶樹菇液體培養(yǎng)的影響Tab．3Effect of different nitrogen source on the mycelial growth of Agrocybe cylindracea

從表3中可以看出，不同氮源對茶樹菇的生物量有明顯影響。在有機氮中，以蛋白胨和豆粕粉最好，其次是麩皮，在以硫酸銨為氮源的液體培養(yǎng)基中茶樹菇菌絲體生物量最低。說明茶樹菇對有機氮的利用率較高，而對無機氮的利用率偏低。

2．1．3培養(yǎng)基不同組分配比試驗結果

選用豆粕粉為氮源，葡萄糖為碳源，以MgSO4和KH2PO4為無機鹽進行L9(34)正交試驗，其結果見表4。

表4　正交試驗結果Tab．4Results of the L9(34)orthogonal experiment

根據(jù)表4極差值（R）比較，四個因素對菌絲體生物量的影響大小依次為A＞B＞D＞C。根據(jù)各因素各水平菌絲體的生物量，茶樹菇液體培養(yǎng)基理論最優(yōu)水平組合為A2B3C2D2，即豆粕粉0．4%、葡萄糖2%、MgSO40．1%、KH2PO40．1%。

2.2茶樹菇液體菌種培養(yǎng)條件篩選

2．2．1不同起始pH對菌絲體生物量的影響

采用篩選得到的培養(yǎng)基配方，研究起始pH對茶樹菇液體菌種發(fā)酵的影響，結果見圖1。

由圖1可見，茶樹菇對pH的適應范圍較廣，在液體培養(yǎng)基中pH5．5～8．0時菌絲生長較好，起始pH為6．5時菌絲體生物量最高。

2．2．2培養(yǎng)溫度對菌絲體生物量的影響

為了找出茶樹菇液體菌種發(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度，采用篩選得到的培養(yǎng)基，在不同溫度下進行發(fā)酵實驗，結果見圖2。

圖1　起始pH對茶樹菇菌絲體生物量的影響Fig．1Effects of initial pH on mycelial growth in shake flask cultures of Agrocybe cylindracea

圖2　培養(yǎng)溫度對茶樹菇菌絲體生物量的影響Fig．2Effects of temperature on mycelial growth in shake flask cultures of Agrocybe cylindracea

由圖2可見，茶樹菇在液體發(fā)酵過程中，培養(yǎng)溫度為26℃時菌絲體生物量最高，在高于26℃后菌絲生物量趨于平緩。

2.3液體菌種的應用

為了確定最佳培養(yǎng)時間，應用篩選得到的培養(yǎng)基配方和條件，將經(jīng)過6 d、7 d、8 d培養(yǎng)的液體菌種接種到棉籽殼培養(yǎng)基上后，觀察菌絲生長情況，結果見表5。

表5　茶樹菇液體和固體菌種出菇比較Tab.5Comparison of fruiting condition of Agrocybe cylindracea between liquid culture and solid culture

菌絲長滿袋平均天數(shù)分別為18 d、15 d、16 d。培養(yǎng)7 d的菌種萌發(fā)時間最短，長滿袋所需時間最短，長勢旺盛。記錄同時接種固體菌種和液體菌種的菌袋生長過程，發(fā)現(xiàn)液體菌種栽培袋長滿菌袋時間相比固體菌種提前15 d左右，頭潮菇采收提前8 d左右。

3　小結

在食用菌的液體培養(yǎng)中，碳源、氮源和礦物質元素影響菌絲生長。通過對茶樹菇液體菌種培養(yǎng)過程中營養(yǎng)因子對生物量的影響研究，發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源，培養(yǎng)基的效果較好，這與苗秉義[8]的結果一致。在最佳氮源的選擇上，蛋白胨和豆粕粉的差異不顯著，但豆粕粉來源廣泛且價格低廉，可應用于大規(guī)模的生產(chǎn)。在此基礎上進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化得出最佳的培養(yǎng)基配方為豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%。發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，對食用菌生長具有非常明顯的影響，也是影響培養(yǎng)過程中各種酶活性的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)茶樹菇廣昌2號對pH值的適應性較廣，在初始pH5.5～8.0條件下都能正常生長；在pH6.5時菌絲生物量最大，這與劉競男等[9]和曾澤彬等[10]的研究結果基本一致，而與Kim HO[11]等的結果略有差異，可能是由于選擇的菌種不同而引起的。溫度是食用菌生長相對敏感的因素。試驗發(fā)現(xiàn)茶樹菇廣昌2號在26℃液體培養(yǎng)的菌絲體生物量最大。液體菌種相比固體菌種在大規(guī)模生產(chǎn)上有明顯優(yōu)勢。通過出菇試驗，液體菌種菌絲長滿栽培袋的時間為17 d，相比固體菌種縮短了15 d的時間，頭潮菇出菇時間也有所減少；生物轉化率與固體菌種相比沒有明顯差異，說明使用液體菌種能縮短栽培周期，可以應用于工廠化生產(chǎn)。

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Optimization and Application on Liquid Spawns Cultivation Medium of Agrocybe cylindracea

LIU Ming1,2,XIAO Zi-tian1,2,QIU Yao-ming3,QIU Gui-gen3,HE Huan-qing1,2
(1.Vegetables Research Institute Guangdong Academy of Agriculture Sciences,Guangzhou 510640,China; 2.Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables,Guangzhou 510640,China; 3.Dongda Mushroom New Technology Research Company Limited,Zhuhai 519101,China)

Liquid spawn cultivation was the key technology and developmental trend for Agrocybe cylindracea production.The optimization of nutritional requirements was studied for the mycelial biomass of A.cylindracea guangchang-2 in a shake flask culture.The optimum concentration of each medium component was determined using the orthogonal matrix method.The optimal combination of the media constituents for mycelial growth was as follows:soybean meal 0.4%,glucose 2%,MgSO40.1%, KH2PO40.1%.The optimal temperature was 26℃and initial pH was 6.5.Producing experiments showed use liquid spawn has shorter cultivation period and better for industrial application.

Agrocybe cylindracea;liquid spawn;cultivation medium;soybean meal

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0039-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.010

廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所所長基金項目（所-201405）；廣東省“三區(qū)”科技人才選派和培養(yǎng)項目（2015A020224015）；佛山市順德區(qū)產(chǎn)學研合作項目（2014CXY16）。

劉明（1984-）男，博士，助理研究員，主要從事食用菌遺傳與育種研究。E-mail:liuming2021@163.com

**通信作者：何煥清（1964-），男，本科，研究員，主要從事食用菌栽培與推廣研究。E-mail:hhq407@sina.com

2016-05-29