李云龍，彭一航，燕騰，鞏合德

（西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)旅游學(xué)院，云南昆明650224）

西南地區(qū)夏塊菌子實(shí)體內(nèi)的細(xì)菌多樣性分析*

李云龍，彭一航，燕騰，鞏合德**

（西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)旅游學(xué)院，云南昆明650224）

以夏塊菌（Tuber aestivum）為研究對(duì)象，采用傳統(tǒng)室內(nèi)分離培養(yǎng)的方式對(duì)其子實(shí)體內(nèi)細(xì)菌菌株分離培養(yǎng)，并對(duì)比篩選，對(duì)云南省保山市和四川省會(huì)東縣的夏塊菌子實(shí)體內(nèi)細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，所分離出的細(xì)菌屬于5門(mén)11屬19種，其中，γ-變形菌門(mén)所占比例最大，為67%，假單胞菌屬的Pseudomonas fuscovaginae為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群；厚壁菌門(mén)（Firmicutes）所占比例其次，為第二大群，以葡萄球菌屬的Staphylococcus simiae、Staphylococcus warneri為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。此外還分離得到擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）細(xì)菌22株，占9%；α-變形菌門(mén)細(xì)菌14株，占6%；β-變形菌門(mén)6株，占3%。

夏塊菌；子實(shí)體；細(xì)菌；優(yōu)勢(shì)類(lèi)群

塊菌（truffles）是一大類(lèi)地下生大型真菌的統(tǒng)稱(chēng)，因具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值且產(chǎn)地稀少，產(chǎn)量有限，而備受推崇。其中法國(guó)黑孢塊菌與意大利白塊菌更是塊菌家族中的明星成員，素有“地下黃金”和“上帝的食物”的美譽(yù)，其價(jià)值與珍稀程度可見(jiàn)一斑[1]。從分類(lèi)學(xué)上而言，塊菌有廣義與狹義之分，廣義的塊菌是指隸屬于真菌界（Fungi）子囊菌門(mén)（Ascmyeotina）擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomyeotina）和接合菌門(mén)（Zygomyeotina）的不同種，狹義上的塊菌是指子囊菌門(mén)中的塊菌屬（Tuber）所含種類(lèi)。后者也是日常多為人們平時(shí)所認(rèn)同的塊菌，而眾多經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的種類(lèi)多在本屬，本文所指塊菌也只是狹義上的塊菌種類(lèi)[2-3]。

夏塊菌（Tuber aestivum）是我國(guó)國(guó)產(chǎn)塊菌中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高但發(fā)現(xiàn)較晚的一個(gè)種，《中國(guó)的經(jīng)濟(jì)真菌》名錄中較早收錄了夏塊菌一詞，并指出我國(guó)北方及西南地區(qū)有該種的分布，但無(wú)標(biāo)本的引證[4]。隨后大量研究者也都報(bào)道和介紹了該種，但同樣無(wú)具體產(chǎn)地描述及標(biāo)本。從確認(rèn)該種在中國(guó)存在以后，國(guó)產(chǎn)夏塊菌與歐洲塊菌是否為同一種的爭(zhēng)論從未間斷，研究者各執(zhí)一詞，本文對(duì)此不予討論。關(guān)于國(guó)產(chǎn)夏塊菌的地理分布，2014年龍新華[5]分別對(duì)云南省保山市和四川省會(huì)東縣的夏塊菌進(jìn)行詳細(xì)報(bào)道，并有具體的采集記錄及野外采集形態(tài)特征記錄。筆者于2015年8月～10月分赴云南省保山市和四川省會(huì)東縣實(shí)地采集夏塊菌子實(shí)體，運(yùn)用分子實(shí)驗(yàn)手段，對(duì)其子實(shí)體內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，以期揭示夏塊菌子實(shí)體內(nèi)的細(xì)菌多樣性，為篩選優(yōu)勢(shì)菌株及促棲菌（MHB）研究打下基礎(chǔ)，進(jìn)而加深人們對(duì)夏塊菌的認(rèn)識(shí)，并為夏塊菌菌根合成乃至夏塊菌的人工栽培提供參考，促進(jìn)夏塊菌的研究開(kāi)發(fā)與保護(hù)。

1　材料與方法

1.1材料

以國(guó)產(chǎn)夏塊菌為研究實(shí)驗(yàn)材料，新鮮子實(shí)體分別采自云南省保山市與四川省會(huì)東縣，生境均為華山松（Pinus amandii）為優(yōu)勢(shì)樹(shù)種的森林，且菌塘（塊菌采集地點(diǎn)）均為塊菌的多年固定生長(zhǎng)點(diǎn)，距離與人類(lèi)主要活動(dòng)區(qū)域較遠(yuǎn)，受人類(lèi)活動(dòng)干擾較弱，干擾因素較少，較好地保持了塊菌生長(zhǎng)的原始生態(tài)環(huán)境。將發(fā)現(xiàn)的夏塊菌子實(shí)體放入無(wú)菌袋，置于事先準(zhǔn)備好的冰盒中保存，隨后，對(duì)采集地的地理信息（地名、采集日期、經(jīng)緯度、海拔）和生境信息（土壤、溫濕度、林型、優(yōu)勢(shì)種、伴生樹(shù)種）等進(jìn)行詳細(xì)記錄。采集完畢后在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將各地采集的子實(shí)體編號(hào)，見(jiàn)表1。

表1　樣品采集信息Tab.1Samples information used in this study

1.2樣品處理

1.2.1細(xì)菌的分離純化與培養(yǎng)

采集到的子實(shí)體在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行編號(hào)處理后，使用無(wú)菌水對(duì)子實(shí)體表面進(jìn)行沖洗，將泥土等沖洗干凈之后，置于超凈工作臺(tái)至晾干，晾干后使用酒精（75%）或酒精燈對(duì)其進(jìn)行表面消毒滅菌，而后徒手掰開(kāi)子實(shí)體[7]，并使用滅菌后的手術(shù)刀取菌肉0.5 g至裝有滅菌完畢的4.5 mL NaCl（0.85%）的離心管中。在稱(chēng)量前對(duì)電子天平進(jìn)行滅菌。將取好菌肉的離心管，使用高通量組織研磨儀進(jìn)行研磨至組織塊呈均勻糊狀。隨后在28℃的搖床中放置0.5 h，充分混勻，并將此時(shí)的菌液定義為10-1濃度的懸濁液。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用移液槍抽取1 mL的10-1的菌液至裝有9 mL無(wú)菌水的離心管中，反復(fù)吹吸，定義此時(shí)懸濁液濃度為10-2。以此類(lèi)推，得到10-3～10-6濃度的懸濁液[8-10]。將稀釋完畢的10-4～10-6濃度的懸浮液均勻涂抹到TSA培養(yǎng)基上，之后放置在28℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)約48 h。待培養(yǎng)基中細(xì)菌菌落長(zhǎng)成后，用消毒完畢的牙簽挑取單菌落至TSB培養(yǎng)液（TSA培養(yǎng)基不加瓊脂）中培養(yǎng)，并對(duì)其菌落數(shù)（CFU）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2細(xì)菌的篩選與純化

將TSB培養(yǎng)基中的細(xì)菌菌液培養(yǎng)3 d～5 d后，將其在GeneAmp9700 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增（25 μL的細(xì)菌V3區(qū)），PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系成分包括：2 μL 10× buffer（含Mg2+），0.5 μL dNTP（1 mmol·L-1），0.5 μL BSA（1%），1 μL MgCl2，0.5 U Taq Polymerase（Takara Taq,Takara Biotechnology,Dalian Co.Ltd., China），引物F341/R518各1 μL（5 μmol·L-1），DNA模板1 μL，加雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序具體如下：95°C預(yù)變性5 min；94°C變性1 min，60°C退火1 min，72°C延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。放入紫外儀觀(guān)察，選取條帶較亮者送檢。將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)入BLAST進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行建樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1微生物的計(jì)數(shù)

夏塊菌子實(shí)體內(nèi)細(xì)菌菌落數(shù)（CFU）統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

2.2種類(lèi)多樣性

將分離培養(yǎng)的細(xì)菌送檢后，以Korarchaeota（AF255604.1）、Uncultured Korarchaeota（KT453572.1）序列為外類(lèi)群，根據(jù)檢測(cè)細(xì)菌的16Sr-DNA序列，構(gòu)建得出夏塊菌子實(shí)體內(nèi)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖1。

由圖1可知，夏塊菌子實(shí)體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌主要分布于α-變形菌門(mén)、β-變形菌門(mén)、γ-變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)。

本次實(shí)驗(yàn)共得到可培養(yǎng)菌株233株，對(duì)其多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，本次實(shí)驗(yàn)中分離所得細(xì)菌所占比例最大的類(lèi)群是變形菌門(mén)。其中分離得到γ-變形菌門(mén)菌株157株，占總數(shù)的67%，為所占比例最大的一支。γ-變形菌門(mén)的細(xì)菌主要包括：假單胞菌屬（Pseudomonas），占40%（63/157）；布丘氏菌屬（Buttiauxella），占24%（37/157）；寡氧單胞菌屬（Stenotrophomonas），占18%（28/157）；埃希氏菌屬（Escherichia），占11%（18/157）；不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），占7%（11/157）。此外，布丘氏菌（Buttiauxella agrestis）占25%（37/157），寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）占18%（28/157），埃希氏桿菌（Escherichia vulneris）占11%（18/ 157），不動(dòng)桿菌（Acinetobacter junii）占7%（11/ 157）。

除γ-變形菌門(mén)外，厚壁菌門(mén)是本次實(shí)驗(yàn)分離得到的另一大類(lèi)群，占14%（33/233）。主要是葡萄球菌屬Staphylococcus simiae、Staphylococcus warneri、 Staphylococcus hominis。本次實(shí)驗(yàn)還得到α-變形菌門(mén)細(xì)菌14株，占總菌株數(shù)的6%，其中短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）、劍菌屬與根瘤菌屬（Ensifer/Sinorhiz obium）各7株。萬(wàn)山平[11]曾在攀枝花白塊菌土壤中分離得到此類(lèi)細(xì)菌，在一定程度上反映出塊菌子實(shí)體內(nèi)的細(xì)菌與其菌塘內(nèi)細(xì)菌具有一定的相關(guān)性。β-變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)細(xì)菌分別占總數(shù)的3%和9%，以金黃桿菌屬的Chryseobacterium vrystaatense為代表，擬桿菌門(mén)以馬賽菌屬的蒂莫內(nèi)馬賽菌（Massilia timonae）為主。

表2　12個(gè)夏塊菌子囊果內(nèi)篩選出的細(xì)菌及OTUsTab.2Number of bacterial isolates screened from 12 sporocarps of Tuber aestivum

表3　12個(gè)夏塊菌子囊果內(nèi)細(xì)菌的菌落數(shù)（CFU）Tab.3The bacterial CFU of 12 ascocarps of Tuber aestivum

3　討論

本實(shí)驗(yàn)中采集了12個(gè)夏塊菌子實(shí)體用作分析，結(jié)果表明12個(gè)子實(shí)體的生物量大致相同，共得5個(gè)門(mén)233株細(xì)菌，分布在α-變形菌門(mén)、β-變形菌門(mén)、γ-變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)，這與同類(lèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)所得細(xì)菌分布大致相同[10，12-15]。

γ-變形菌門(mén)是本次實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)量最多的一門(mén)，假單胞菌屬是其優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。假單胞菌類(lèi)群中多數(shù)與Pseudomonas rhizosphaerae、Pseudomonas japonica、Pseudomonas alkylphenolia、Pseudomonas entomophila相似度極高。假單胞菌屬種類(lèi)也常從塊菌屬中分離出來(lái)，分離自波式塊菌中的假單胞菌中的一些類(lèi)群具有抑制植物病原菌的作用，并通過(guò)控制纖維素分解、幾丁質(zhì)分解和蛋白水解的方式對(duì)波式塊菌菌絲的生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)育產(chǎn)生影響[16]；此外Barbara Citterio等[17]的研究表明假單胞菌對(duì)于波式塊菌子實(shí)體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建與修復(fù)具有積極的影響作用。因此假單胞菌屬是一種常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)種群，存在于塊菌子實(shí)體內(nèi)。

圖1　基于夏塊菌子實(shí)體內(nèi)部分細(xì)菌16S rDNA構(gòu)建的Neighbor-joining進(jìn)化樹(shù)Fig．1 Neighbor-joining tree based on 16S rDNA gene partial sequences of 21 OTUs isolated from a fruitbody of T.aestivum

厚壁菌門(mén)細(xì)菌在意大利塊菌和波式塊菌中同樣存在，此外在微繁培養(yǎng)的植株根系中也有此類(lèi)細(xì)菌。經(jīng)研究表明，此屬細(xì)菌在波式塊菌菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中起到抗菌的作用；α-變形菌門(mén)劍菌屬與根瘤菌屬細(xì)菌在其他種類(lèi)中經(jīng)常被分離得到，此外此屬細(xì)菌易與豆科植物產(chǎn)生共生聯(lián)合，從而具有固氮功能，也就是為人所熟知的固氮細(xì)菌。而劍菌屬與根瘤菌屬正是α-變形菌門(mén)細(xì)菌中固氮細(xì)菌最具典型性的代表，對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)過(guò)程甚至真菌的生長(zhǎng)及子實(shí)體的發(fā)育具有重要影響[18]。

β-變形菌門(mén)細(xì)菌在波式塊菌和意大利白塊菌中也曾被分離得到。除了相關(guān)研究中分離得到絕大多數(shù)細(xì)菌之外，本實(shí)驗(yàn)也分離得到其他實(shí)驗(yàn)中較少出現(xiàn)的一些細(xì)菌，如桿菌門(mén)馬賽菌屬的蒂莫內(nèi)馬賽菌（Massilia timonae）。相比較而言，β-變形菌門(mén)的金黃桿菌在塊菌子實(shí)體分離中較多地被分離出來(lái)，這與前人的結(jié)果相符，而擬桿菌門(mén)的細(xì)菌則較少地在塊菌中分離得到，此外，此類(lèi)細(xì)菌具有降解能力。筆者認(rèn)為，此類(lèi)細(xì)菌與塊菌子實(shí)體的降解腐壞具有一定的聯(lián)系。這對(duì)于豐富塊菌子實(shí)體可培養(yǎng)細(xì)菌的種類(lèi)及塊菌的防腐與保存也具有一定的意義。

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Bacteria Diversity Research on Tuber aestivum Fruiting Bodies from Southwest of China

LI Yun-long,PENG Yi-hang,YAN Teng,GONG He-de
(Ecotourism Faculty,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

In this paper,taking Tuber aestivum as the research object,the bacteria diversity in T.aestivum fruiting bodies was carried out in the form of the tradition way.The fruiting bodies of T.aestivum were collected from Baoshan city(Yunnan province)and Huidong city(Sichuang province).The results revealed that the culturable bacteria,which belonges to 19 species and 11 genera in 5 phyla respectively.Most of the culturable isolations(67%)are affiliated to the γ-Proteobacteria,among of them,the dominated taxon is Pseudomonas fuscovaginae.The second major group is Firmicutes(14%),mainly with Staphylococcus simiae and Staphylococcus warneri as the dominant taxa.The rest of culturable bacterial isolates are members of Bacteroidetes (9%),α-Proteobacteria(6%),and β-Proteobacteria(3%).

Tuber aestivum;fruiting bodies;bacteria;dominant communities

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0058-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.015

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31200482）。

李云龍（1990-），男，碩士，主要從事生物地理學(xué)研究。E-mail:1158116277@qq.com

**通信作者：鞏合德（1978-），男，博士，副教授，主要從事森林生態(tài)學(xué)研究。E-mail:gonghede3@163.com

2016-05-16