艾柳英，呂書儀，張杰，陳文星，賴春芬，王洪滔，孫淑靜

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州金山350002）

〈產(chǎn)業(yè)論壇〉

超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇菌種及其特性和生產(chǎn)性能*

艾柳英，呂書儀，張杰，陳文星，賴春芬，王洪滔，孫淑靜**

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州金山350002）

菌種退化是食用菌在保藏過程中易出現(xiàn)的一個(gè)難題。該研究通過比較分析由超干燥基質(zhì)保藏分離的杏鮑菇菌株P(guān)le-tm與子實(shí)體組織分離的菌株P(guān)le-fs的形態(tài)特征、生長(zhǎng)速度及酶活，探索超干燥基質(zhì)保藏法的可行性。研究結(jié)果顯示，菌株P(guān)le-tm菌絲生長(zhǎng)潔白濃密，生長(zhǎng)速度明顯快于菌株P(guān)le-fs，分別為1.08 cm·d-1和0.86 cm·d-1，兩者間具有極顯著差異。酶活測(cè)定結(jié)果表明Ple-tm各酶活均高于同期生長(zhǎng)的Ple-fs，漆酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、木聚糖酶、纖維素酶活分別為205.65 U·L-1、446.55 U·L-1、2.34 U·L-1、40.77 U·L-1和22.93 U·L-1。經(jīng)出菇培養(yǎng)，Ple-tm比Ple-fs具有明顯優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)量為27.28 g·瓶-1，生物學(xué)效率比Ple-fs高26.3%，Pletm的菌絲生長(zhǎng)速度、菌株生長(zhǎng)周期、產(chǎn)量均保持原種優(yōu)勢(shì)。該實(shí)驗(yàn)表明超干燥基質(zhì)保藏法可有效防止菌種退化，為食用菌菌種保藏方法的探究開辟新思路。

杏鮑菇；菌種退化；原種優(yōu)勢(shì)；生物學(xué)效率

食用菌菌種是食用菌生產(chǎn)的重要生產(chǎn)資料[1]，菌種的質(zhì)量直接影響食用菌的栽培結(jié)果，是影響經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因素之一[2]。菌種在栽培和保藏過程中，如果營(yíng)養(yǎng)或培養(yǎng)環(huán)境控制不當(dāng)，其生長(zhǎng)代謝，菌種次生代謝物數(shù)量及質(zhì)量均會(huì)受到影響[3]，發(fā)生退化現(xiàn)象。表現(xiàn)為菌種出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)速度不一致，菌絲體“吃料”速度減慢，出菇期延長(zhǎng)，菇潮不明顯，品質(zhì)、產(chǎn)量下降，抗性降低等。此外，菌絲的代謝能力[4]、菌絲對(duì)基質(zhì)降解能力，影響菌株生產(chǎn)周期的胞外酶活力[5-6]也會(huì)發(fā)生變化。菌種退化原因來自多方面，由遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)及基因突變[7]等因素導(dǎo)致的退化于常規(guī)條件不易改變，但保藏方法、繼代次數(shù)的影響卻可以優(yōu)化和避免。目前常用的保藏方法有低溫定期移植保藏法[3]、冷凍干燥保藏法和液氮超低溫保藏法，3種方法均需要低溫，成本高。其中低溫定期移植保藏法需要每隔4月～6月移植轉(zhuǎn)管1次[7]，易增加繼代次數(shù)，不利于長(zhǎng)期保藏。目前盡管不斷有新品種被發(fā)現(xiàn)與研究，但品種的老化或退化現(xiàn)象依然普遍存在。菌種保藏技術(shù)成熟與否關(guān)系到食用菌產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，因此，對(duì)菌種長(zhǎng)期保藏技術(shù)的探究具有重要意義。

杏鮑菇（Pleurotus eryngii Quel），別名剌芹側(cè)耳，屬真菌門（Eumycota）擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus）。因其具有杏仁香味和菌肉肥厚如鮑魚的口感[8]，是近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用于一體的珍稀食用菌新品種[9]，深受廣大消費(fèi)者喜愛，已成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)市場(chǎng)最具發(fā)展?jié)摿Φ氖秤镁贩N之一[10]。目前，中國(guó)、日本、韓國(guó)等都已實(shí)現(xiàn)杏鮑菇工廠化周年栽培[11]，在我國(guó)栽培主要集中于山東、河南、江西、福建、臺(tái)灣等地。但杏鮑菇生產(chǎn)過程中易出現(xiàn)菌種退化現(xiàn)象，即專用菌種[9]的退化，因此，對(duì)專用菌種保藏技術(shù)的探究尤為重要。

本研究以杏鮑菇為試材，首次采用超干燥基質(zhì)保藏法，通過對(duì)超干燥基質(zhì)保藏分離的杏鮑菇菌株P(guān)le-tm與子實(shí)體組織分離的菌株P(guān)le-fs的形態(tài)特征、生長(zhǎng)速度及酶活比較分析，探索超干燥基質(zhì)保藏法的可行性。該研究將為杏鮑菇菌種保藏提供新方法，并為食用菌菌種保藏提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

Ple-tm為試管超干燥基質(zhì)保藏3年后分離所得的杏鮑菇菌株，首次從子實(shí)體分離；Ple-fs為杏鮑菇成熟子實(shí)體直接組織分離菌株，二者均為實(shí)驗(yàn)室保藏的同種杏鮑菇菌種。

1.1.2供試培養(yǎng)基

超干燥基質(zhì)培養(yǎng)基：木屑25%、麩皮35%、玉米芯24%、玉米粉5%、米糠10%、石灰1%，含水量30%。

PDA加富培養(yǎng)基（1L）：葡萄糖20 g·L-1、馬鈴薯200 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、KH2PO41.5 g·L-1、蔗渣1 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1、瓊脂20 g·L-1，pH自然。0.11 MPa、121℃高壓滅菌20 min。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

生產(chǎn)培養(yǎng)基：木屑32.5%、玉米芯35%、麩皮15%、玉米粉5%、米糠10%、碳酸鈣1.5%、石灰1%，含水量65%，pH6.5～7.0。

1.2方法

1.2.1超干燥基質(zhì)保藏法

超干燥基質(zhì)保藏法的具體做法：按照超干燥基質(zhì)培養(yǎng)基配方，配制試管保藏基質(zhì)，121℃，180 min滅菌冷卻，每個(gè)試管接種1個(gè)杏鮑菇菌塊（直徑1 cm），于24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿試管（約2個(gè)月），然后轉(zhuǎn)移至室溫避光保藏。

1.2.2菌絲生長(zhǎng)速度與生物量測(cè)定試驗(yàn)

固體培養(yǎng)：將菌株P(guān)le-tm、Ple-fs接種于PDA加富培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接2次，24℃恒溫培養(yǎng)10 d，每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，每隔1 d測(cè)量菌絲生長(zhǎng)直徑、觀察菌絲形態(tài)。

液體培養(yǎng)：將菌株接種至裝有100 mL完全培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每瓶7塊（直徑1 cm），每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，120 r·min-1，24℃搖床培養(yǎng)9 d，測(cè)定菌株生物量濕重與干重。

1.2.3粗酶液的提取

從第3天開始，每隔3 d取一次上述液體培養(yǎng)發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，即為粗酶液。

1.2.4酶活測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[12]，分別測(cè)定兩菌株分別于3 d、6 d、9 d的漆酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、木聚糖酶、纖維素酶的酶活。

1.2.5出菇試驗(yàn)

根據(jù)生產(chǎn)培養(yǎng)基配方，以栽培料干重50 g·瓶-1的標(biāo)準(zhǔn)配備，裝入300 mL栽培瓶中，每個(gè)菌株設(shè)置14個(gè)重復(fù)，按照工廠化栽培流程培養(yǎng)至收獲。

收集子實(shí)體，記錄產(chǎn)量，計(jì)算生產(chǎn)周期、生物學(xué)效率。生產(chǎn)周期為接種發(fā)菌到采收完畢時(shí)間。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用DPS 7．05數(shù)據(jù)處理軟件，采用單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株菌絲生長(zhǎng)速度及生物量

菌株菌絲生長(zhǎng)速度及生物量見表1，菌絲生長(zhǎng)形態(tài)特征見圖1。

表1　超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇的菌絲生長(zhǎng)速度及生物量Tab．1Mycelial growth rate and biomass of Pleurotus eryngii strain from the strain preservation of ultra dry substrate

圖1　超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇菌株的菌絲形態(tài)特征Fig．1Mycelial morphology characteristics of Pleurotus.eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

由表1可知，菌株P(guān)le-tm生長(zhǎng)直徑為8．63 cm，生長(zhǎng)速度為1．08 cm·d-1，明顯快于菌株P(guān)le-fs。兩者菌絲生長(zhǎng)直徑和速度均達(dá)極顯著差異。菌株P(guān)le-tm和Ple-fs菌絲生物量干重分別為1．07 g/100mL和 0．95 g/100mL，相比無明顯差異；菌絲濕重達(dá)極顯著差異。

由圖1可知，Ple-tm長(zhǎng)勢(shì)均勻，菌絲潔白濃密，邊緣整齊，優(yōu)于Ple-fs。兩者菌絲生長(zhǎng)速度差異較大，Ple-tm生長(zhǎng)速度較快，8 d長(zhǎng)滿平皿，而Ple-fs生長(zhǎng)較慢，10 d才長(zhǎng)滿平皿。由此可知，保藏3年后分離得到的菌株P(guān)le-tm生長(zhǎng)活性依然高于Ple-fs，而后者顯現(xiàn)出較為明顯的菌種退化特征。

2.2酶活測(cè)定結(jié)果

漆酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、木聚糖酶、纖維素酶酶活力比較見圖2。

從圖2可知，2個(gè)菌株在不同酶活上都體現(xiàn)出一定差異。Ple-tm的5種主要酶活力最高分別為205．65 U·L-1、446．55 U·L-1、2．34 U·L-1、40．77 U·L-1和22．93 U·L-1，后4種較Ple-fs同期酶活達(dá)極顯著差異。

漆酶酶活力：前期（3 d～6 d）菌株P(guān)le-tm漆酶酶活的較高，后期（9 d）Ple-fs菌株漆酶酶活上升，而Ple-tm漆酶酶活下降。推測(cè)由于菌株P(guān)le-tm生長(zhǎng)速度快于Ple-fs，后者生長(zhǎng)滯后，于后期才表現(xiàn)出較高的酶活[4]（圖2A)。錳過氧化物酶活力：呈現(xiàn)與漆酶相似的趨勢(shì)（圖2B)。由圖2C可知，2個(gè)菌株前期木質(zhì)素酶酶活力都較低，后期才表現(xiàn)出活性，Pletm酶活明顯高于Ple-fs。木聚糖酶活力：Ple-tm、Ple-fs菌株木聚糖酶酶活力都隨時(shí)間增加而升高，但菌株P(guān)le-tm木聚糖酶酶活一直顯著高于Ple-fs；后期兩者仍較高但酶活已下降至第6天時(shí)的一半(圖2D)?？赡苡捎谂囵B(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)[2]消耗過快導(dǎo)致。纖維素酶活力：在菌絲生長(zhǎng)階段（3 d～9 d）菌株P(guān)letm、Ple-fs纖維素酶酶活力都隨時(shí)間增加而升高，但菌株P(guān)le-tm纖維素酶酶活一直高于菌株P(guān)le-fs，并在第9天達(dá)極顯著差異（圖2E）。

綜上可知，菌株P(guān)le-tm的主要酶活皆優(yōu)于同期Ple-fs菌株，由于酶活力高低程度與食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育及生物量息息相關(guān)[5]，體現(xiàn)了菌株生長(zhǎng)活力和對(duì)基質(zhì)的降解能力[6]，因此該結(jié)果間接表明Ple-tm菌株具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)代謝能力。

表2　超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇菌株的出菇結(jié)果Tab．2Mushroom cultivation results of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

2.3出菇試驗(yàn)結(jié)果

菌株P(guān)le-tm、Ple-fs出菇結(jié)果見表2，在栽培料干重相同、培養(yǎng)條件一致的條件下，對(duì)比2個(gè)菌株菌絲滿袋、原基形成、出菇時(shí)間、出菇產(chǎn)量、生物學(xué)效率。2個(gè)菌株不同時(shí)期對(duì)照見圖3。

由表2可見，菌株P(guān)le-tm在栽培過程中顯著地表現(xiàn)出原種優(yōu)勢(shì)，在菌絲出現(xiàn)、滿袋、原基形成、子實(shí)體成熟時(shí)間、菌絲長(zhǎng)勢(shì)及菇的質(zhì)量等方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過菌株P(guān)le-fs，菌絲滿袋只用了17 d，出菇45 d，生物學(xué)效率為54．56%，而Ple-fs菌株長(zhǎng)勢(shì)弱，出菇時(shí)間延長(zhǎng)，品質(zhì)下降，菌種退化嚴(yán)重。

圖2　超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇菌株的5種酶活力Fig．25 kinds of enzyme activity of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

圖3　超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇的菌株栽培對(duì)照Fig．3Mushroom cultivation comparison of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

3　討論

菌種是國(guó)家重要的生物資源，是生產(chǎn)、教學(xué)和科學(xué)研究的基本材料。菌種保藏過程中，不僅要保持菌種不死亡、不被雜菌污染，更主要的是保持菌種遺傳性狀不發(fā)生或盡可能少發(fā)生變異[13]。從1980年至今，世界各國(guó)都非常重視菌種的保藏工作，并作了大量研究[14]。本研究在前人的基礎(chǔ)上優(yōu)化配方，探索出超干燥基質(zhì)保藏法，該法在文獻(xiàn)中并無報(bào)道，也未應(yīng)用于其他菌種。

研究表明，超干燥基質(zhì)保藏法保藏3年后的菌株長(zhǎng)勢(shì)、主要酶活及菌株生長(zhǎng)周期均保持原種活性，與常規(guī)保種方法比較顯現(xiàn)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。探究機(jī)理，筆者認(rèn)為可以從以下三個(gè)方面考慮：超干燥條件下水分含量極少，不能滿足菌絲的進(jìn)一步生長(zhǎng)，使其生長(zhǎng)停滯，保持于原有水平，且干燥環(huán)境不利于雜菌生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失，因此，長(zhǎng)期保藏之后菌種活性亦能保持；該方法僅需常溫保藏，菌絲長(zhǎng)期生長(zhǎng)停滯，但不受低溫刺激，既防止原基的生成，又使其保持于正常環(huán)境溫度內(nèi)；保藏時(shí)需避光，亦是防止光照的刺激，理由同上。這與李紅等[7]提出的在保藏過程中光照、溫度刺激也可引起菌種退化的觀點(diǎn)一致，具體機(jī)理待進(jìn)一步研究。

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Characteristics and Production Performance of Pleurotus eryngii Strain from Preservation of Ultra Dry Substrate

AI Liu-ying,LV Shu-yi,ZHANG Jie,CHEN Wen-xing,LAI Chun-fen,WANG Hong-tao,SUN Shu-jing
(College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Strain degradation appears easily in the strain preservation of edible fungi.In this study,in order to investigate the feasibility of ultra dry substrate used in strain preservation,the comparative analysis was performed by determining the mycelial morphology,growth speed and enzyme activity of Ple-tm strain isolated from preservation ultra dry substrate and Ple-fs strain isolated from Pleurotus eryngii fruitbody tissue.The results showed that the mycelial growth rate of Ple-tm(1.08 cm·d-1)was faster than that of Ple-fs(0.86 cm·d-1),and the difference was extremely significant.At the same time,the hyphae of Ple-tm were denser,neater and whiter.Moreover,the laccase,manganese peroxidase,lignin peroxidease,xylanase and cellulase activity of Ple-tm reached 205.65 U·L-1,446.55 U·L-1,2.34 U·L-1,40.77 U·L-1and 22.93 U·L-1,respectively.These enzymatic activities were significantly higher than those of Ple-fs during the same growth period.The mushroom cultivation experiments showed that the fruitbody production of Ple-tm strain reached 27.28 g per bottle and the biological efficiency was 26.3%higher than that of Ple-fs strain.Furthermore,Ple-tm strain could maintain the protospecies advantages in terms of mycelial growth rate,growth period and fruitbody production.These results showed that the strain preservation of ultra dry substrate can inhibit the strain degradation effectively,which will develop new strategies on the research of preservation methods of edible fungi.

Pleurotus eryngii;strain degradation;protospecies advantages;biological efficiency

S646.1

A

1003-8310（2016）04-0072-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.018

福建省食用菌產(chǎn)業(yè)重大農(nóng)技推廣服務(wù)體系建設(shè)（KNJ-153011C）；福建省發(fā)改委農(nóng)業(yè)五新工程項(xiàng)目（閩發(fā)改委投資[2012]931號(hào)）；福建省政府專項(xiàng)項(xiàng)目（K8114002A）；福建省食用菌產(chǎn)業(yè)重大研發(fā)平臺(tái)（2014N2101）；福建省發(fā)改委生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)專項(xiàng)（2011878）。

艾柳英（1992-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)槭秤谜婢鷮W(xué)。E-mail:1178884710@qq.com

**通信作者：孫淑靜（1978-），女，博士，副教授，主要從事食（藥）用菌子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理、食用菌酶制備、食用菌遺傳育種研究。

E-mail:shjsun2004@126.com

2016-05-18