許謙

（菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東菏澤274015）

藥用真菌桑黃原生質(zhì)體的制備和誘變*

許謙

（菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東菏澤274015）

利用酶處理桑黃（Phellinus igniarius）菌絲體，分離到原生質(zhì)體并對其進(jìn)行紫外線誘變，確定誘變后的致死率，以利于桑黃原生質(zhì)體誘變及融合的合理實施。菌齡為10 d的桑黃菌絲體在1.5%溶壁酶、100 r·min-1、30℃條件下酶解3 h，獲得原生質(zhì)體；再分別經(jīng)紫外線照射10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s后；利用血球計數(shù)板對美蘭染色后的活性原生質(zhì)體計數(shù)，計算桑黃原生質(zhì)體紫外誘變后的致死率。結(jié)果顯示，原生質(zhì)體致死率隨著照射時間的延長而增大，在40 s～50 s誘變時間內(nèi)，曲線的變化最為劇烈；誘變時間為45 s時，致死率達(dá)到73%；誘變時間達(dá)到90 s時，致死率為100%。該結(jié)果能夠為桑黃原生質(zhì)體誘變育種及融合育種的實施提供切實的理論依據(jù)。

桑黃；原生質(zhì)體；制備；誘變

桑黃（Phellinus igniarius）屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）[1]，是目前國際公認(rèn)的抗癌效果最好的藥用真菌之一[2-3]，具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗胃潰瘍、抗菌、抗病毒等多種藥理活性[4-5]。主要分布在中國、韓國、日本、朝鮮、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、菲律賓、澳大利亞、北美、中南美等地，被現(xiàn)代人稱為“森林黃金”[6]。

桑黃子實體自然形成周期長，其產(chǎn)品難以滿足市場需求。為高效生產(chǎn)其產(chǎn)品，一方面依靠液體培養(yǎng)，縮短桑黃產(chǎn)品的生產(chǎn)時間[7]；另一方面則進(jìn)行桑黃高產(chǎn)菌株的育種研究[8-10]。原生質(zhì)體誘變是一種行之有效的育種方法[11-13]。微生物原生質(zhì)體因細(xì)胞壁缺失而對外界刺激敏感度提高，使誘變的生物學(xué)效率更加明顯，有利于變異菌株的篩選和誘變機(jī)理探討[1 4-1 5]。誘變劑有物理誘變劑和化學(xué)誘變劑，兩者可單獨(dú)使用也可復(fù)合使用。常用的物理誘變劑有紫外線、γ射線、激光、離子注入等，而化學(xué)誘變劑有烷化劑（NTG等）、堿基類似物（5-BU等）、脫氨基（亞硝酸）、移碼誘變劑（吖啶類染料等）等[16]。紫外線作為物理誘變劑，因設(shè)備簡單，成本低，誘變效果好，被廣泛應(yīng)用于誘變育種[17-24]。

誘變育種有2個重要的環(huán)節(jié)，即誘變和篩選，篩選重于誘變。篩選需要經(jīng)驗積累基礎(chǔ)上的合理判斷。有研究認(rèn)為，原生質(zhì)體誘變后，其致死率在70%～80%，獲得的正突變菌株比率較高[25-26]。原生質(zhì)體誘變的另一個作用是原生質(zhì)體致死。原生質(zhì)體致死是進(jìn)行原生質(zhì)體融合的一個有效方案。雙親原生質(zhì)體致死后進(jìn)行融合，便于融合子的順利檢出。但原生質(zhì)體最好是在剛剛致死的狀態(tài)下才有利于融合的成功實現(xiàn)[27]。所以100%致死率的精確判斷會為原生質(zhì)體的高效融合奠定堅實的基礎(chǔ)。

本試驗是為有效地進(jìn)行桑黃原生質(zhì)體誘變育種和原生質(zhì)體融合育種而進(jìn)行的前期工作，擬探索桑黃原生質(zhì)體的制備及紫外線誘變技術(shù)，總結(jié)桑黃原生質(zhì)體誘變后的致死率規(guī)律，為桑黃原生質(zhì)體誘變育種及融合育種的實施提供切實的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

桑黃菌由菏澤學(xué)院生命科學(xué)系微生物實驗室保藏；馬鈴薯、玉米粉、麩皮均為山東菏澤牡丹區(qū)生產(chǎn)；溶壁酶＞2 000 μ·mg-1，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；葡萄糖為AR，汕頭市西隴化工廠有限公司；硫酸鎂為AR，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；磷酸二氫鉀為AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇95%，安徽安特生物有限公司；甘露醇均為AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉為BR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌器MLS-3780，日本三洋電器株式會社；標(biāo)準(zhǔn)型雙人凈化工作臺SW-CJ-1C，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；單人單面紫外誘變臺（垂直）ZYT-DDC，濟(jì)南杰康凈化設(shè)備廠；恒溫培養(yǎng)箱PYX-250B-Z，上海博訊實業(yè)有限公司；全溫振蕩器HZQ-Y，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；電冰箱BCD-282VBP，海信（北京）電器有限公司；藥品保存箱HYC-360，上?？蠌?qiáng)儀器有限公司；電子天平FA1004，梅特勒-托利儀器有限公司；移液槍brand，上海恒奇儀器儀表有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)HR/T20M，湖南赫西儀器裝備有限公司；血球計數(shù)板1103，姜堰市慧成玻璃制品廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱01932，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3方法

1．3．1培養(yǎng)基配制

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，去芽去皮切成小塊，沸水中煮20 min，4層紗布過濾，取濾液，加入葡萄糖20 g、瓊脂18 g，加水定容至1 000 mL，pH值為6，121℃蒸汽滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：玉米粉25 g、麩皮35 g，沸水中煮30 min，4層紗布過濾，取濾液加入硫酸鎂1．5 g、磷酸二氫鉀1 g，加水定容至1 000 mL，pH值為6，121℃蒸汽滅菌20 min。

1．3．2菌種活化

在無菌的條件下，將原種接種到PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)18 d。

1．3．3液體培養(yǎng)

菌種平板活化培養(yǎng)18 d后，在無菌條件下，用滅菌打孔器在活化平板外圈打取菌餅（直徑1 cm），向裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中接入2個菌餅，29℃、160 r·min-1條件下液體培養(yǎng)10 d。

1．3．4桑黃原生質(zhì)體制備的前期工作

（1）酶解液的制備（配制1．5%溶壁酶）

稱量固體粉末狀的溶壁酶0．12 g，放入15 mL滅菌離心管內(nèi)，用滅菌的5 000 μL槍頭取8 mL、0．6 mol·L-1滲透壓穩(wěn)定劑于上述15 mL離心管內(nèi)溶解酶液。溶解起始時，由于酶制劑在冰箱內(nèi)保存，易結(jié)成小塊狀固體，可上下顛倒離心管數(shù)次，使其完全溶解混勻。用無菌針管吸取15 mL離心管內(nèi)的8 mL酶液，將針頭拔掉，向上推出管內(nèi)多余空氣，再將0．22 μm滅菌微孔濾膜的兩頭，分別與針管和無菌針頭安裝，取另一支15 mL滅菌離心管，將酶液緩慢推入其中，過濾除菌后，上下顛倒離心管數(shù)次，使其混勻，置于離心管架待用。

（2）稱量桑黃菌絲體

超凈工作臺滅菌30 min，無菌操作取29℃、160 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)10 d的菌絲體，8層滅菌紗布過濾，無菌水洗滌2次，用牙簽鈍頭攪拌，洗滌干凈后用滅菌濾紙吸去表面水分，并用滅菌鑷子挑取個體較小的菌絲體于放有稱量紙的滅菌培養(yǎng)皿的天平上稱量，稱取5份150 mg菌絲體，分別放入5個2 mL滅菌EP管內(nèi)待用。

1.3.5桑黃原生質(zhì)體的制備

在無菌條件下，按150 mg濕菌絲加0.5 mL酶液，用1 000 μL移液槍取無菌酶液（5份）0.5 mL分別加入到上述待用的5個2 mL的EP管中，用牙簽鈍頭攪拌，使EP管中的菌絲體與酶液混勻，在30℃下以100 r·min-1轉(zhuǎn)速搖床振蕩3 h[1]。

1.3.6桑黃原生質(zhì)體的精制

將5個EP管的酶解液分別倒入滅菌漏斗中過濾，并用滅菌滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2 mLEP管，每個EP管用1 000 μL移液槍量取0.5 mL的0.6 mol·L-1滅菌滲透壓穩(wěn)定劑沖洗，重復(fù)2次，合并沖洗液倒入滅菌漏斗中過濾，并用牙簽鈍頭緩慢攪拌，過濾除去菌絲碎片，用1 000 μL移液槍吸取濾液置于50 mL滅菌離心管中，用0.6 mol·L-1滅菌滲透壓穩(wěn)定劑沖洗過濾使用的錐形瓶，將沖洗液倒入上述50 mL離心管中，稀釋到15 mL，3 800 r·min-1離心10 min去上清液，用0.6 mol·L-1滅菌滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2次，得到純化后白色的桑黃原生質(zhì)體沉淀。稀釋后，通過血球計數(shù)板計數(shù)求得桑黃原生質(zhì)體的平均產(chǎn)量。

1.3.7桑黃原生質(zhì)體的紫外誘變

將原生質(zhì)體用0.6 mol·L-1滲透壓穩(wěn)定劑稀釋成原生質(zhì)體懸液，用潔凈的血球計數(shù)板計數(shù)，稀釋到濃度1.58×106個·mL-1待用[17]。無菌操作下用1 000 μL移液槍各取1 mL稀釋原生質(zhì)體懸液于27個直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，輕微晃動，使菌液均勻分布在培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入距15 W的紫外燈管30 cm處（已預(yù)熱30 min），打開皿蓋進(jìn)行紫外誘變，1組10 s，2組20 s，3組30 s，4組40 s，5組50 s，6組60 s,7組70 s,8組80 s，9組90 s，每組3個重復(fù)。誘變結(jié)束后，用移液槍吸取適量于血球計數(shù)板上，0.01%美蘭染色后，計算誘變后桑黃原生質(zhì)體的致死率，求3個重復(fù)的平均值。

(3)對供電可靠性要求較高的小區(qū)內(nèi)，需要在環(huán)網(wǎng)柜進(jìn)線側(cè)加裝電流互感器，選擇型號為LZZB610 0.5/10P，額定電壓10 kV，用作電氣測量和電力保護(hù)。

1.3.8桑黃誘變原生質(zhì)體致死率計算

誘變致死率（P）計算公式為：

式中：A為誘變后存活的原生質(zhì)體數(shù)，即經(jīng)酶處理后的混合液用高滲溶液稀釋，經(jīng)紫外線誘變后，在顯微鏡下，血球計數(shù)板上存活的原生質(zhì)體數(shù)（無色或淡藍(lán)色原生質(zhì)體，個/中格）；B為未經(jīng)誘變存活的原生質(zhì)體數(shù)，即經(jīng)酶處理后的混合液，用高滲溶液稀釋，在顯微鏡下，血球計數(shù)板上存活的原生質(zhì)體數(shù)（無色或淡藍(lán)色原生質(zhì)體，個/中格）。

2　結(jié)果與分析

2.1桑黃原生質(zhì)體在顯微鏡下的形態(tài)

將純化的白色原生質(zhì)體沉淀，用0.6 mol·L-1滅菌滲透壓穩(wěn)定劑適當(dāng)稀釋后，得到原生質(zhì)體懸液，用血球計數(shù)板觀察桑黃原生質(zhì)體的顯微形態(tài)（圖1）。

圖1　桑黃原生質(zhì)體的顯微形態(tài)（×40）Fig.1 Microscopic morphology of Phellinus igniarius protoplast（×40）

圖1顯示，去壁后所得到的桑黃原生質(zhì)體，個體較大，形態(tài)圓潤，折光性較低?？赡苁怯捎诮?jīng)溶壁酶處理后，細(xì)胞外層僅有一層細(xì)胞膜，細(xì)胞膜外層不再有細(xì)胞壁的存在，使細(xì)胞的形態(tài)不再受細(xì)胞壁的限制，因此細(xì)胞形態(tài)在適當(dāng)范圍內(nèi)變大，呈圓球狀。由于細(xì)胞失去細(xì)胞壁，這就意味著細(xì)胞同時也失去了細(xì)胞壁中折光性較強(qiáng)的成分，使之在顯微鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞折光性降低。

2.2桑黃原生質(zhì)體的產(chǎn)量

桑黃原生質(zhì)體的產(chǎn)量為5個重復(fù)所獲原生質(zhì)體產(chǎn)量的平均值，即4 576萬個·mL-1，見表1。

由表1可以看出，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為47.79，數(shù)值較小，說明5個重復(fù)桑黃原生質(zhì)體的產(chǎn)量比較穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為1.04%，表示5個重復(fù)桑黃原生質(zhì)體產(chǎn)量精密度較高。

2.3桑黃原生質(zhì)體紫外線誘變后的致死率

誘變結(jié)束后，用移液槍吸取少量誘變后菌液于血球計數(shù)板上，計數(shù)中方格平均活性原生質(zhì)體數(shù)（0.01%美蘭∶原生質(zhì)體懸液=9∶1，染色5 min，對無色或淡藍(lán)色的活性原生質(zhì)體進(jìn)行計數(shù)），其結(jié)果見表2、圖2。

由圖2可以看出，桑黃原生質(zhì)體經(jīng)紫外線誘變10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s后，致死率隨著時間的延長而增大，在40 s～50 s誘變時間內(nèi)，曲線的變化最為劇烈，當(dāng)誘變時間達(dá)到50 s以后，曲線變化趨于平穩(wěn)，并于90 s達(dá)到100%。

根據(jù)試驗結(jié)果，40 s～50 s誘變時間內(nèi)，致死率由54%增加到87.3%，跨過了誘變育種的最佳致死率70%～75%的范疇；誘變90 s時，致死率達(dá)到100%。由于不能確認(rèn)是否恰好達(dá)到100%，又設(shè)計了45 s和85 s兩個誘變時間進(jìn)行誘變。誘變結(jié)果是45 s時，致死率達(dá)到73%；85 s時，致死率為98.4%。所以可以確定用于誘變育種的最佳誘變時間為45 s[25-26]，用于原生質(zhì)體致死處理后進(jìn)行融合育種的誘變時間以90 s為宜[27]。

表1　桑黃原生質(zhì)體產(chǎn)量Tab.1Yield of Phellinus igniarius protoplast

表2　桑黃原生質(zhì)體紫外線誘變后的致死率Tab.2Fatality rate of Phellinus igniarius protoplast after being mutagenized by UV

圖2　桑黃原生質(zhì)體致死率變化曲線Fig.2Phellinus igniarius protoplast fatality rate curve

3　討論

原生質(zhì)體誘變是一種有效的育種方式。丁興紅等[13]利用離子注入對桑黃原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，獲得了高產(chǎn)黃酮、多糖的菌株。El-Bondkly AM[17]曾用紫外線和NTG對木聚糖酶產(chǎn)生菌曲霉菌sp.NRCF5進(jìn)行復(fù)合誘變，然后用于原生質(zhì)體融合。Wang M[18]曾用紫外線和NTG對紅豆杉內(nèi)生菌Tubercularia sp.TF5的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，產(chǎn)生了新的代謝產(chǎn)物。祝子坪[8]利用紫外線與He-Ne激光對桑黃原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，獲得了新性狀菌株。陳敏等[19]利用紫外線和γ射線對刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngii GIM 5.280）原生質(zhì)體進(jìn)行復(fù)合誘變獲得了木質(zhì)素酶高產(chǎn)菌株，酶產(chǎn)量可達(dá)110 U·mL-1。李恒等[20]對亞麻刺盤孢ST的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，獲得高產(chǎn)7α,15α-diOH-DHEA菌株，摩爾得率可達(dá)36.9%，比出發(fā)菌株提高了50%。梅凡等[21]對漆酶產(chǎn)生菌原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變，獲得誘變菌株UV-56，漆酶酶活比出發(fā)菌株提高56%。宋細(xì)忠等[22]采用紫外誘變方法對蝙蝠蛾擬青霉原生質(zhì)體進(jìn)行選育，選出l株菌絲體得率和腺苷含量明顯高于原始菌株的誘變株，經(jīng)過10代繼代培養(yǎng)、搖瓶試驗，結(jié)果表明該誘變株發(fā)酵性狀穩(wěn)定。Hou X[23]通過誘變和原生質(zhì)體融合對木糖發(fā)酵酵母菌抑制劑耐受性能進(jìn)行了改善。劉新星等[24]采用原生質(zhì)體紫外誘變、DES（硫酸二乙酯）誘變、紫外等常規(guī)誘變技術(shù)結(jié)合高通量篩選的方法，篩選出可利霉素高產(chǎn)菌株。El-Bondkly AM[17]利用紫外線照射和NTG結(jié)合誘變的方法，對木聚糖酶產(chǎn)生菌曲霉菌sp.NRCF5進(jìn)行復(fù)合誘變，獲得高木聚糖酶產(chǎn)生菌。

本試驗是在前期工作的基礎(chǔ)上[1]，對桑黃原生質(zhì)體的制備及誘變進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，利用優(yōu)化的原生質(zhì)體制備方法可以獲得高質(zhì)量桑黃原生質(zhì)體，取1 mL濃度為1.58×106個·mL-1的原生質(zhì)體懸液于直徑6 cm的培養(yǎng)皿里，在15 W紫外光燈（預(yù)熱30 min）下30 cm處進(jìn)行紫外誘變，誘變致死率隨著時間的延長而增大，在40 s～50 s誘變時間內(nèi)，曲線的變化最為劇烈，在45 s時達(dá)到73%，當(dāng)誘變時間達(dá)到50 s以后，曲線變化趨于平穩(wěn)，并在90 s時達(dá)到100%。

以上結(jié)果與祝子坪等[8]把桑黃原生質(zhì)體（1 mL于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中）于15 W紫外燈（預(yù)熱20 min）、燈距30 cm處誘變，0～20 s照射時間內(nèi)，曲線變化劇烈，20 s后趨于平穩(wěn)的結(jié)果不同。原因可能與誘變時原生質(zhì)體懸液濃度不同有關(guān)。

另外，對于原生質(zhì)體紫外致死的記載，有郭成金等[27]對蛹蟲草原生質(zhì)體致死的記載，認(rèn)為距離30 W紫外光燈10 cm處，垂直照射13 min，能使原生質(zhì)體致死率達(dá)到100%；有朱蘊(yùn)蘭等[28]對冬蟲夏草原生質(zhì)體誘變致死的記載，認(rèn)為取3 mL濃度為105個·mL-1的原生質(zhì)體懸液于直徑9 cm的培養(yǎng)皿里，15 W紫外燈、燈距30 cm，誘變30 s，致死率達(dá)到80%，誘變40 s后，致死率達(dá)到90%；有吳強(qiáng)等[29]對蓮花菌原生質(zhì)體誘變致死的記載，認(rèn)為取5 mL濃度為108個·mL-1的原生質(zhì)體懸液于直徑9 cm的培養(yǎng)皿里，15 W紫外燈、燈距30 cm，紫外誘變120 s時，原生質(zhì)體的致死率為87.3%，300 s時，接近100%；有陳建中[30]對草菇原生質(zhì)體誘變致死的記載，認(rèn)為取0.1 mL濃度為105/mL的原生質(zhì)體懸液涂布在培養(yǎng)基上，15 W紫外燈，燈距30 cm，原生質(zhì)體致死時間為110 s；有劉海英[31]對杏鮑菇原生質(zhì)體誘變致死的記載，認(rèn)為取0.1 mL濃度為105/mL的原生質(zhì)體懸液涂布在半固體培養(yǎng)基上，20 W紫外燈（245 nm，預(yù)熱20 min），燈距30 cm，原生質(zhì)體致死時間為120 s以上。造成紫外致死時間不同的原因可能與菌種不同、起始原生質(zhì)體濃度不同、誘變的原生質(zhì)體懸液量不同有關(guān)。

原生質(zhì)體致死是原生質(zhì)體融合有效實施的準(zhǔn)備條件之一。紫外致死與熱致死、離子注入致死相比，紫外致死用時較短，一般為1 min左右即完成滅活，處理迅速。熱致死則需要較多時間，陳建忠[30]報道的草菇熱致死條件為50℃，3 min，耗時較長；丁興紅[13]報道的離子注入的致死方式，對設(shè)施要求較高，準(zhǔn)備工作較繁瑣。所以，原生質(zhì)體紫外致死具有省時、操作簡單方便的優(yōu)勢。

4　結(jié)論

利用溶壁酶高效制備的桑黃原生質(zhì)體在15 W紫外燈下30 cm處進(jìn)行紫外誘變，誘變時間為45 s時，誘變致死率為73%，誘變時間為90 s時，誘變致死率為100%。

原生質(zhì)體誘變后，其致死率達(dá)到70%～75%的誘變效果最好[25-26]；致死率剛剛達(dá)到100%時利于進(jìn)行致死后原生質(zhì)體間的融合育種[27]。所以本試驗結(jié)果對于進(jìn)行桑黃原生質(zhì)體的誘變育種及桑黃種間、桑黃與其他種間的原生質(zhì)體融合的實施提供了理想的實驗基礎(chǔ)。

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Preparation and Mutagenesis of Protoplast from Medicinal Mushroom Phellinus igniarius

XU Qian
(Department of Life Science,Heze University,Heze 274015,China)

In order to facilitate the reasonable implementation of Phellinus igniarius protoplasts mutagenesis and fusion,protoplast of Phellinus igniarius mycelia was obtained through the method of enzymolysis and mutagenized by UN,and the fatality rate was determined after mutagenesis.Protoplast was gained under the condition of strain age 10 d,1.5%lywallzyme solution, 100 r·min-1,30℃,3 h,and mutagenized by UV for 10 s，20 s，30 s，40 s，50 s，60 s，70 s，80 s，90 s respectively,active protoplasts after meilan dyeing were counted by using blood count slabs after mutagenesis,then the fatality rate was determined.Results showed that protoplast fatality rate increased with the extension of over time,in the 40 s and 50 s mutagenesis time,the shape of the curve varied sharply.When the mutagenesis time was 45 s,the fatality rate was 73%.When mutagenesis time was 90 s,the fatality rate reached 100%.The results will provide practical theory basis for the implementation of protoplast mutation breeding and the fusion breeding.

Phellinus igniarius;protoplast;preparation;mutagenesis

〈貯運(yùn)加工〉

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0067-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.017

菏澤市科技發(fā)展計劃項目（2012N002）。

許謙（1971-），女，碩士，副教授，主要從事食（藥）用菌開發(fā)應(yīng)用、微生物遺傳育種研究。E-mail:xq710301@163.com

2016-06-02