李兵

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

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丹參多酚酸鹽對(duì)過氧化氫所致乳鼠心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究

李兵

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的：研究丹參多酚酸鹽(Salvianolate)對(duì)過氧化氫(H2O2)所致乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：分離并培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞72 h后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、H2O2組、丹參多酚酸鹽(50、100和200 mg/L)+H2O2組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔；給藥干預(yù)24 h后，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率；檢測(cè)細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量，測(cè)定培養(yǎng)液中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量；ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1、IL-6含量；通過Flow Cytometry檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽各干預(yù)組乳鼠心肌細(xì)胞生存狀態(tài)呈不同程度好轉(zhuǎn)，其中以丹參多酚酸鹽(200 mg/L)+H2O2組效果最為顯著；丹參多酚酸鹽(100和200 mg/L)+H2O2組細(xì)胞存活率顯著升高，SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低，培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量顯著降低，TNF-α、IL-1、IL-6水平均顯著降低；丹參多酚酸鹽各干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡狀況呈不同程度改善，其中丹參多酚酸鹽(100和200 mg/L)+H2O2組凋亡率顯著降低，上述差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：丹參多酚酸鹽能夠通過改善細(xì)胞生存狀態(tài)、提高細(xì)胞存活率、降低氧化應(yīng)激損傷、抑制炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡而對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。

丹參多酚酸鹽；過氧化氫；乳鼠；心肌細(xì)胞；保護(hù)

中藥丹參為唇形科植物丹參的干燥根及根莖，始載于《神龍本草經(jīng)》，其味苦、微寒，具有活血通絡(luò)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩之功效，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[1]。丹參多酚酸是中藥丹參的主要活性成分之一[2]，王強(qiáng)等[3]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，丹參多酚酸能夠通過改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷以及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠起到保護(hù)作用；但丹參多酚酸是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡具有抑制作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將通過過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)制備乳鼠心肌細(xì)胞損傷模型，研究丹參多酚酸鹽對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

丹參多酚酸鹽(上海綠谷制藥有限公司，規(guī)格：50 mg/瓶，批號(hào)150307)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；甲基四唑藍(lán)(MTT，美國Sigma公司)；SOD、CAT、MDA試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；AST、CPK、LDH試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；ROS 檢測(cè)試劑盒，AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，NF-kB單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；TNF-α、IL-1、IL-6檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠1～3 d乳鼠[3]，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003，動(dòng)物合格證號(hào)：1506013。

1.3 主要儀器

VD-650-U型超凈工作臺(tái)(上海楚度儀器設(shè)備有限公司)；MCO- 175型CO2培養(yǎng)箱(日本三洋集團(tuán))；UV-1800 PC型紫外-可見分光光度計(jì)(廣州科曉科學(xué)儀器有限公司)；BS-300型全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；Model-680 型酶標(biāo)儀(美國 BIO-RAD公司)；FACS Aria型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.4 細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

參照李澎等[4]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法分離和培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞：于無菌環(huán)境下開胸取心臟并剪取心室組織，剪碎后加入0.1%的胰酶后于37℃振蕩消化6 min，去上清取沉淀繼續(xù)用0.1%胰酶于37℃振蕩消化6 min，如此循環(huán)直至組織碎塊消化完畢，收集消化上清液，1500 rpm離心10 min，取沉淀，加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)基(10%胎牛血清 DMEM，內(nèi)含105U/L的青霉素和鏈霉素)，吹打均勻，壁立1.5 h。收集未貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞至6×108個(gè)/L，接種于35 mm培養(yǎng)器皿中，37℃，5% CO2，100%濕度，培養(yǎng)72 h后，將狀態(tài)良好的原代乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：空白對(duì)照組、H2O2組、丹參多酚酸鹽(50、100和200 mg/L)+H2O2組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔；經(jīng)藥物干預(yù)24 h后，檢測(cè)細(xì)胞及其培養(yǎng)液中各指標(biāo)。

1.5 細(xì)胞形態(tài)的觀察

經(jīng)藥物干預(yù)24 h后，去培養(yǎng)液取細(xì)胞，經(jīng)PBS溶液沖洗2次后用去離子水洗劑，直至顯微鏡下細(xì)胞間隙清晰止，晾干后通過倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并照相保存。

1.6 細(xì)胞存活率的檢測(cè)

將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(n=6)，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)振蕩15 min后，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%

1.7 細(xì)胞中SOD、CAT活性和MDA含量的測(cè)定

取細(xì)胞并通過超聲波細(xì)胞破碎儀冰浴中破碎后，經(jīng)低溫(4℃)離心取上清液，通過紫外-可見分光光度計(jì)平行測(cè)定各組細(xì)胞裂解液中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.8 培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量的測(cè)定

取各組細(xì)胞培養(yǎng)液并按照各試劑盒操作方法進(jìn)行處理后，通過全自動(dòng)生化分析儀平行測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量。

1.9 培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1、IL-6含量水平的測(cè)定

分別取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒操作步驟：包被、加樣、加酶標(biāo)抗體、加底物液顯色、終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀平行測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1、IL-6含量水平。

1.10 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)及細(xì)胞凋亡率的計(jì)算

經(jīng)0.25%的胰酶消化后離心棄上清液，應(yīng)用PBS溶液將沖洗2次后，按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作方法步驟依次進(jìn)行處理后通過Flow Cytometry檢測(cè)，觀察各組細(xì)胞凋亡狀況并在流式二維圖中計(jì)算凋亡率。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 丹參多酚酸鹽對(duì)H2O2損傷乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)的影響

空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)及生存狀態(tài)未見異常：?jiǎn)螌哟貭钌L，偽足多而飽滿，搏動(dòng)明顯，節(jié)律一致；而H2O2組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的病理性形態(tài)學(xué)變化：胞漿出現(xiàn)空泡、偽足減少，細(xì)胞脫落、懸浮、溶解壞死，搏動(dòng)減弱、頻率降低、節(jié)律不齊等；較H2O2組，丹參多酚酸鹽各組乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)呈不同程度好轉(zhuǎn)，其中以丹參多酚酸鹽(100、200 mg/L)+H2O2組效果最為顯著，見圖1。

圖1 各組乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)注：A：空白對(duì)照組；B：H2O2組；C：丹參多酚酸鹽(50 mg/L)+H2O2組；D：丹參多酚酸鹽(100 mg/L)+H2O2組；E：丹參多酚酸鹽(200 mg/L)+H2O2組。

2.2 丹參多酚酸鹽對(duì)H2O2損傷乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響

經(jīng)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn),H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.01)；較H2O2組，丹參多酚酸鹽(100、200 mg/L)+H2O2組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.01)，見表1。

表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞存活率比較±s,n=8)

注：與空白對(duì)照組比較，bP<0.01；與H2O2組比較，dP<0.01。

2.3 丹參多酚酸鹽對(duì)H2O2損傷乳鼠心肌細(xì)胞SOD、CAT活性和MDA含量的影響

H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞SOD、CAT活性較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)；與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽(100、200 mg/L)+H2O2組SOD、CAT活性均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01)，見表2。

2.4 丹參多酚酸鹽對(duì)H2O2損傷乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量的影響

H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH活性較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.01)；與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽(100、200 mg/L)+H2O2組AST、CPK、LDH活性均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，見表3。

2.5 丹參多酚酸鹽對(duì)H2O2損傷乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1、IL-6含量水平的影響

H2O2干預(yù)組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1、IL-6含量水平較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.01)；與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽(100、200 mg/L)+H2O2干預(yù)組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1、IL-6含量水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果見表4。

表2 各組乳鼠心肌細(xì)胞SOD、CAT活性和MDA含量

注：與空白對(duì)照組比較，bP<0.01；與H2O2組比較，cP<0.05，dP<0.01。

表3 各組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、CPK、LDH含量

注：與空白對(duì)照組比較，bP<0.01；與H2O2組比較，cP<0.05，dP<0.01。

表4 各組乳鼠細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1、IL-6水平比較

注：與空白對(duì)照組比較，bP<0.01；與H2O2組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.6 丹參多酚酸鹽對(duì)H2O2損傷乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

采用Flow Cytometry檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)：H2O2組凋亡細(xì)胞數(shù)量較空白對(duì)照組明顯增多；而較H2O2組，丹參多酚酸鹽各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況呈不同程度好轉(zhuǎn)，其中以丹參多酚酸鹽(200 mg/L)+H2O2組效果優(yōu)最為顯著，見圖2。H2O2組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.01)；與H2O2組比較，丹參多酚酸鹽(100、200 mg/L)+H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，見表4。

表4 各組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率±s,n=8)

注：與空白對(duì)照組比較，bP<0.01；與H2O2組比較，dP<0.01。

3 討論

近年來，隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變，冠心病及其所誘發(fā)的急性心肌梗死的發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)發(fā)展成為危害人類生命健康的主要疾病之一。臨床上通過溶栓、介入手術(shù)等治療手段及時(shí)恢復(fù)血流供應(yīng)，能夠極大地緩解缺血癥狀并降低死亡率，但 “再灌注損傷”并發(fā)癥的存在嚴(yán)重影響著患者愈后[5-11]。近年來，Chen O等[12]和史婷婷等[13]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，再灌后隨著氧的大量涌入，氧自由基(ROS)過剩而引發(fā)的廣泛的氧化應(yīng)激損傷以及繼發(fā)的細(xì)胞凋亡，是缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制。

Lartigue A等[14]和Jin Y等[15]研究發(fā)現(xiàn)，正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)ROS的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，在ROS的還原清除過程中有多種抗氧化酶參與，其中被稱為體內(nèi)防御ROS損傷“第一道屏障”的超氧化物歧化酶(SOD)能夠提供氫原子配體而催化還原ROS生成H2O2，并在GSH-Px或CAT的催化作用下進(jìn)一步還原生成對(duì)人無害的H2O和O2，所以SOD、GSH-Px、CAT的活性能夠直接反映機(jī)體抗氧化能力；而脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量也能夠間接反映心肌細(xì)胞損傷程度。正常生理狀態(tài)下，血清中心肌酶含量非常低，而當(dāng)細(xì)胞膜受氧自由基攻擊而受損后將導(dǎo)致細(xì)胞中心肌酶(AST、CPK、LDH)迅速釋放入血，導(dǎo)致血清中AST、CPK、LDH活性陡然增高，因此血清中三者的活性水平能夠敏感地反映心肌細(xì)胞受損程度[16]。細(xì)胞凋亡是一種有多種基因參與調(diào)控的程序化死亡過程，是一種繼發(fā)行為，氧化應(yīng)激損傷是其最重要的誘發(fā)因素之一[17-18]。

圖2 各組細(xì)胞凋亡狀況注：A：空白對(duì)照組；B：H2O2組；C：丹參多酚酸鹽(50 mg/L)+H2O2組；D：丹參多酚酸鹽(100 mg/L)+H2O2組；E：丹參多酚酸鹽(200 mg/L)+H2O2組。

本實(shí)驗(yàn)通過過氧化氫誘導(dǎo)損傷乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行體外研究發(fā)現(xiàn),與H2O2組比較，經(jīng)丹參多酚酸鹽干預(yù)24 h能夠有效提高H2O2誘導(dǎo)損傷乳鼠心肌細(xì)胞存活率，改善SOD、GSH-Px、CAT活性，降低MDA和培養(yǎng)液中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量，抑制細(xì)胞凋亡，提示丹參多酚酸鹽對(duì)H2O2所致乳鼠心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，作用機(jī)制可能與其能夠有效改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[1] 茍占平,呂應(yīng)年,龔先玲,等.丹參類中藥的品種與鑒定研究概述[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2008,19(12):2869-2871.

[2] 溫薇.丹參的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].中醫(yī)藥信息,2007,24(4):54-55.

[3] 王強(qiáng),張一,李璐,等.丹參多酚酸鹽對(duì)大鼠腦缺血再灌注過氧化損傷的保護(hù)作用[J].右江醫(yī)學(xué),2010,38(6):665-667.

[4] 李澎,王建農(nóng),盧樹杰,等.山楂葉原花青素對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國中藥雜志,2009, 34(1): 96-99.

[5] 裴志萍，牛文革，柴靜波,等.黃芪預(yù)處理對(duì)大鼠腸系膜缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(3):20-25.

[6] 曹明明，高彥宇，馬育軒,等.黃芪化學(xué)成分及對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(3):120-123.

[7] 韓宇博，田苗，郭維毅,等.苓桂術(shù)甘湯預(yù)防性給藥對(duì)心肌缺血再灌注損傷NO、NOS含量的影響[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(5):84-86.

[8] 馬育軒，郭蕊珠，周海純，等.心肌缺血再灌注損傷的中醫(yī)藥治療研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2013,30(5):116-118.

[9] 張洋，王明春，阿日棍，等.丹參(凍干)粉針對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷的IL-6和IL-10的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016,44(3):30-32.

[10] 馬育軒，郭蕊珠，周海純，等.丹參抗心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013,41(5):91-93.

[11] 李冀，曹明明，高彥宇.烏腺金絲桃與丹參配伍對(duì)心肌缺血模型動(dòng)物影響的研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2012,40(1):17-19.

[12] Chen O,Ye Z,Cao Z,et al.Methane attenuates myocardial ischemia injury in rats through anti-oxidative,anti-apoptotic and anti-inflammatory actions[J].Free Radic Biol Med,2015,90:1-11.

[13] 史婷婷,白建平,梁月琴,等.芹菜素對(duì)大鼠缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2011,27(5):666-671.

[14] Lartigue A, Burlat B, Coutard B, et al. The megavirus chilensis Cu, Zn-superoxide dismutase: the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme[J].J Virol,2014,2588(14):254-261.

[15] Jin Y, Liu K, Peng J, et al. Rhizoma dioscoreae nipponicae polysaccharides protect HUVECs from H2O2-induced injury by regulating PPARγ factor and the NADPH oxidase/ROS-NF-κB signal pathway[J].Toxicol Lett, 2014,232(1):149-158.

[16] 潘蓉,李玲.丹參水提物對(duì)心肌缺血/再灌注損傷大鼠心率及心肌酶譜的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(4):232-234.

[17] 陳良金,石孟瓊,賀海波,等.珠子參總皂苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2012,17(8):860-867.

[18] 王艷華,張慧萍,田玨,等.NO水平下降通過氧化應(yīng)激引起人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2014,30(9):1287-1292.

Protective Effect of Salvianolate on Cardiomyocytes Damage of Neonatal Rats Induced by H2O2

LI Bing

(HandanCentralHospital,Handan056001,China)

Objective：To investigate the protective effect of Salvianolate on cardiomyocytes damage of neonatal rats induced by H2O2. Methods：Cardiomyocytes damage of neonatal rats was induced for 72 hours and they were divided into the following groups: normal control group, H2O2group, Salvianolate (50, 100, 200 mg/L)+H2O2groups(n=8). Twelve hours after the drugs were given,and the morphology changes were observed; the survival rate was detected by MTT; the activities of SOD, CAT and the content of MDA in cardiomyocytes were determinted; the activities of AST, CPK, LDH in culture medium were detected; the levels of TNF-α, IL-1 and IL-6 were detected by ELISA; the cardiomyocytes apoptosis was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was calculated. Results：Compared with H2O2group, the morphology in Salvianolate groups was significantly improved; the survival rates in Salvianolate (100, 200 mg/L)+H2O2groups were significantly increased; the activities of SOD, CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the contents of MDA were significantly decreased; the activities of AST, CPK, LDH in culture medium were significantly decreased; the levels of TNF-α, IL-1, IL-6 were significantly decreased; the cardiomyocytes apoptosis was improved and the apoptosis rates were significantly decreased. All of the differences were significant(P<0.05,P<0.01). Conclusion：Salvianolate can effectively improve morphology, improve the activity of antioxidase, depress oxidative stress and inhibit inflammatory response, suggesting that Salvianolate has a protective effect on cardiomyocytes damage of neonatal rats induced by H2O2.

Salvianolate; H2O2; Neonatal rats; Cardiomyocytes; Protection

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.20130359)

李兵(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要研究方向：急診內(nèi)科疾病研究。

2016-01-27

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0007-05

修回日期：2016-02-10