翟春梅，史連宏，陳忠新，王知斌，孟永海*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

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質(zhì) 量 工 藝

UPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定刺五加葉中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin四種成分的含量

翟春梅1,2，史連宏1,2，陳忠新1,2，王知斌1,2，孟永海1,2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：建立UPLC同時(shí)定量刺五加葉藥材中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin等4種有效成分的方法。方法:色譜柱：HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters)；柱溫：40℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫，洗脫條件：0～8 min，88%～75% A；8～9 min，75%～88% A；9～10 min，88%～88%A；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。結(jié)果：對(duì)9批產(chǎn)地的刺五加葉藥材進(jìn)行測(cè)定，綠原酸最高的是虎林(1.287 mg/g)；蘆丁含量最高的是雞東(0.122 mg/g)；金絲桃苷含量最高的是賓縣(0.528 mg/g)；異槲皮苷含量最高的是五常(0.337 mg/g)。結(jié)論：該方法可用于刺五加葉中四種成分的含量測(cè)定，本研究所建立的方法穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性良好，適用于刺五加葉的含量測(cè)定；不同來(lái)源的藥材成分含量差異顯著，對(duì)刺五加實(shí)施多指標(biāo)的含量控制是保證其臨床藥用安全可控的必要途徑。

刺五加葉；UPLC-DAD；綠原酸；蘆?。唤鸾z桃苷；異檞皮苷

中藥“刺五加” (根莖)自古即被視為具有添精補(bǔ)髓及抗衰老作用的良藥，主要用于治療風(fēng)濕痹痛，腰膝酸痛等證?，F(xiàn)代研究其具有抗疲勞、抗癌、抗心律失常、降血糖等作用。然而，由于刺五加食用藥用價(jià)值均高，長(zhǎng)期以來(lái)一直被掠奪式的采挖，致使野生資源遭到了嚴(yán)重破壞，1992年中國(guó)植物紅皮書(shū)已將刺五加列入漸危物種。然而如何使刺五加物盡其用，又能保護(hù)其資源呢？刺五加葉資源豐富、可再生，大部分刺五加葉自生自滅，至今無(wú)人利用。我國(guó)學(xué)者對(duì)刺五加葉進(jìn)行了治療糖尿病藥理學(xué)研究[1-7]，發(fā)現(xiàn)其具有良好的治療糖尿病活性。葉中主要含有皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)和酚酸類(lèi)等成分，與其根莖中的成分大部分類(lèi)似[8]，黃酮及酚酸類(lèi)成分中的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、綠原酸等成分含量較高。本研究釆用超高效液相色譜法并結(jié)合超高效液相色譜柱，在10 min內(nèi)同時(shí)測(cè)定了刺五加葉中這四種主要成分的含量，并進(jìn)行了全面的方法學(xué)考察。本研究建立了一種快速、有效地控制刺五加葉的質(zhì)量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，Xevo QTof MS質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)，采用電噴霧離子源(ESI)、二元高壓泵、在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱。數(shù)據(jù)采集與處理采用Masslynx 4.1軟件。數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào)：KQ-500DB，昆山市超聲儀器有限公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；Milli‐Q 純水器(密理博上海貿(mào)易有限公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；對(duì)照品金絲桃苷(批號(hào)111521-200303，含量≥98%,HPLC) 購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定中心。對(duì)照品綠原酸(批號(hào)110753)，蘆丁(批號(hào)MUST-14102301)， 異槲皮苷(批號(hào)MUST-14070211)均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司。

刺五加葉藥材購(gòu)自黑龍江省綏芬河地區(qū)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室王振月教授鑒定為五加科植物刺五加(Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harm)的干燥葉。

圖1 綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取對(duì)照品(經(jīng)減壓干燥至恒重)綠原酸5.06 mg，蘆丁4.12 mg，金絲桃苷6.19 mg，異槲皮苷5.08 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇分別配置成濃度為506 μg/mL，412 μg/mL,619 μg/mL,508 μg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。再將儲(chǔ)備液制成6個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，構(gòu)建成標(biāo)準(zhǔn)曲線。將刺五加葉藥材干燥并粉碎，過(guò)0.9 mm篩后用石油醚浸泡后超聲30 min，棄去浸提液，再加石油醚超聲，反復(fù)多次至浸提無(wú)色，使葉綠素完全除去后傾去浸提液，將藥材殘?jiān)糜谕L(fēng)處干燥。精密稱(chēng)取2 g藥材粉末置具塞錐形瓶中并向其中加入50 mL甲醇，密塞并稱(chēng)定其重量，浸泡2 h后，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，放冷后，稱(chēng)定其重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻并濾過(guò)，濾液為供試品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性

色譜柱：HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters)；柱溫：40℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫，洗脫條件：0～8 min，88%～75% A；8～9 min，75%～88% A；9～10 min，88%～88%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。甲醇按上述色譜法測(cè)定，結(jié)果表明溶劑對(duì)綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 樣品(A)、對(duì)照品(B)空白對(duì)照色譜圖(C)注：1.綠原酸(Chlorogenic acid);2.蘆丁(Rutin);3.金絲桃苷(Hyperoside);4.異槲皮苷(Isoquercitrin)。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取上述2.1制備的儲(chǔ)備液配制成不同濃度的對(duì)照品溶液，按照2.2色譜條件項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣體積為5 μL。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果線性關(guān)系良好，見(jiàn)表1。

表1 Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.4 精密度試驗(yàn)

日內(nèi)精密度：分別精密吸取三個(gè)不同濃度的含有綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的混合對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次測(cè)定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度，計(jì)算濃度的RSD值。

日間精密度：分別精密吸取三個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣3天測(cè)定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度，計(jì)算濃度的RSD值。結(jié)果綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷濃度的 RSD均小于5%，表明精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批刺五加葉藥材9份，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，包括高、中、低三個(gè)不同的濃度并且每個(gè)濃度一式三份，進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷濃度的RSD均小于5%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液5 μL，分別于0、2、4、6、8、12和24 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，分別按樣品含量測(cè)定法測(cè)定。結(jié)果顯示綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD均小于5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的樣品，分別加入綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，包括高、中、低三個(gè)不同的濃度并且每個(gè)濃度一式三份，測(cè)定并計(jì)算各成分的加樣回收率以及RSD。(測(cè)得值-樣品中含量)/加入量×100%。結(jié)果顯示綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的加樣回收率RSD均小于5%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.8 樣品含量測(cè)定

結(jié)果表明該方法可用于刺五加葉中四種成分的含量測(cè)定，并對(duì)9批產(chǎn)地的刺五加葉藥材進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果(見(jiàn)表2)發(fā)現(xiàn)9批產(chǎn)地中，綠原酸最高的是虎林(1.287 mg/g)；蘆丁含量最高的是雞東(0.122 mg/g)；金絲桃苷含量最高的是賓縣(0.528 mg/g)；異槲皮苷含量最高的是五常(0.337 mg/g)；綜合考慮，質(zhì)量最優(yōu)的產(chǎn)地是五常，是為進(jìn)一步的藥理研究及中藥藥效物質(zhì)研究提供依據(jù)。

表2 9批產(chǎn)地的刺五加葉中四種成分的含量測(cè)定

3 討論與小結(jié)

3.1 供試品溶液的制備方法的選擇

用超聲提取法提取，考察了提取溶劑甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、60%乙醇，結(jié)果以50%乙醇提取率最高，故提取溶劑選擇50%乙醇。對(duì)提取時(shí)間(30 min，60 min，90 min)，提取次數(shù)(1次，2次)因素進(jìn)行考察，用50%乙醇50 mL提取時(shí)間90 min，提取2次的提取率最高。

3.2 色譜條件的選擇

考察了甲醇-水，乙腈-水系統(tǒng)在不同的梯度下并向其中加入不同比率的甲酸，乙酸及甲酸銨。發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)并分別向其中加入0.1%甲酸為最優(yōu)條件。此條件下峰形較好，分析時(shí)間短，高分離度，柱壓低。選擇合適的梯度是分離的關(guān)鍵，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中金絲桃苷和異槲皮苷是同分異構(gòu)體，極性非常相似，比較難分離。曾有文獻(xiàn)研究通過(guò)高效液相色譜法分離這兩種化合物，但分離的時(shí)間較長(zhǎng)，條件繁瑣。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜，簡(jiǎn)單、快速地將其基線分離并準(zhǔn)確測(cè)量出其含量。

3.3 小結(jié)

本章建立了一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、簡(jiǎn)單快速的UPLC-DAD的含量檢測(cè)方法。主要是對(duì)刺五加葉中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的含量測(cè)定方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)考察，結(jié)果表明該方法可用于刺五加葉中四種成分的含量測(cè)定，為進(jìn)一步闡明開(kāi)發(fā)刺五加葉提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 睢大筼,呂忠智,李淑慧,等.刺五加葉皂甙降血糖作用[J].中國(guó)中藥雜志,1994,19(11):683-6851.

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UPLC-DAD Method for Quantification on Chlorogenic Acid, Rutin,Hyperoside and Isoquercitrin in Extract of E.Senticosus Leaf

ZHAI Chun-mei1,2,SHI Lian-hong1,2,CHEN Zhong-xin1,2,WANG Zhi-bin1,2,MENG Yong-hai1,2*

(1.KeyLaboratoryofChineseMateriaMedica(MinistryofEducation)HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineandNaturalMedicinePharmacodynamicMaterialBasesResearchinHeilongjiangProvince,Harbin150040,China)

Objective:To establish the UPLC-DAD method for quantification on Chlorogenic acid, Rutin, Hyperoside and Isoquercitrin in extract of E. senticosus leaf. Methods:Column: HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μm, Waters); Column temperature: 40℃; Flow rate: 0.4 mL/min; Injection volume: 5 μL; Mobile phase A: 0.1% aqueous formic acid, Mobile phase B: acetonitrile; Gradient elution conditions: 0-8 min: 88%-75%A,8-9 min: 75%-88%A,9-10 min: 88%-88%A. Detection wavelength: 360 nm. Results：Totally 55 compounds including triterpenoid saponins, flavonoid glycosides, organic acids and other compounds were identified by Scifinder database and reference literatures in the optimized LC-MS conditions. Conclusion：It is a fast, accurate and comprehensive method to identify the chemical ingredients of E. senticosus leaf by UPLC/Q-TOF-MS/MS.

E.senticosus leaf; UPLC-DAD;Chlorogenic acid;Rutin;Hyperoside;Isoquercitrin

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.QC2012C064)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年教師支持計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012RCQ16)

翟春梅(1978-)，女，中藥學(xué)博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

孟永海*(1978-)，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

2016-04-11

R28

A

1002-2406(2016)05-0052-03

修回日期：2016-05-04