孟繁興，李妍，盧芳，劉樹民*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所藥用資源開發(fā)組，遼寧 大連 116023)

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淫羊藿次苷Ⅱ葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的制備與表征

孟繁興1，李妍2，盧芳1，劉樹民1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所藥用資源開發(fā)組，遼寧 大連 116023)

目的：鑒定淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行制備與結(jié)構(gòu)表征。方法：應(yīng)用人肝微粒體孵育體系對(duì)淫羊藿次苷II葡糖醛酸結(jié)合代謝途徑進(jìn)行鑒定，并應(yīng)用重組UGT1A1高效制備葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，最后經(jīng)NMR對(duì)該產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果：淫羊藿次苷II在人肝微粒體中的主要代謝產(chǎn)物為淫羊藿次苷II-7-O-葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物。結(jié)論：采用體外孵育方法可以高效特異地制備淫羊藿次苷II的葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物。

淫羊藿次苷Ⅱ；人肝微粒體；葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物；核磁共振

具有8位異戊烯基的黃酮及其衍生物是淫羊藿化學(xué)成分的重要組成部分[1-3]。淫羊藿苷被認(rèn)為是淫羊藿最為主要的黃酮苷類化合物之一[4-7]，與朝藿定A、B、C均可在腸道菌的作用下轉(zhuǎn)化為淫羊藿次苷II，進(jìn)而被吸收入血后發(fā)揮藥效作用[8]。體外藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淫羊藿次苷Ⅱ具有抗腫瘤[9]、抗衰老[10-11]、抗骨質(zhì)酥松[12-13]及抗陰莖勃起功能障礙[14]等多種藥理活性。但是，淫羊藿次苷II經(jīng)口服吸收后受首過效應(yīng)影響顯著，大鼠體內(nèi)的生物利用度僅為4.1%[15]，葡萄糖醛酸化反應(yīng)是其在大鼠體內(nèi)最為重要的生物轉(zhuǎn)化途徑。但對(duì)淫羊藿次苷II在人體內(nèi)的代謝情況研究較少，本研究采用體外孵育方法鑒定淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，并對(duì)該代謝產(chǎn)物進(jìn)行高效特異地制備及結(jié)構(gòu)表征。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

淫羊藿次苷Ⅱ(批號(hào)150627，純度98.0%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA，批號(hào)069K7017V，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；聚乙二醇十六烷基醚(Brij 58，批號(hào)055K0045，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；氯化鎂(批號(hào)20100110，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；Tris堿(批號(hào)527K073，北京索萊寶科技有限公司)；甲酸(色譜純，批號(hào)A0326132，美國(guó)Acros organics公司)；鹽酸(分析純，批號(hào)20150818，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；人肝微粒體(批號(hào)LPS，上海瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司)；甲醇和乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司)；二甲基亞砜(批號(hào)14010920，美國(guó)TEDIA公司)；去離子水(自制)。

1.2 儀器

UFLC色譜儀，LC-30AD高壓泵，SPD-20A紫外/可見光檢測(cè)器，CBM-20A系統(tǒng)控制器，DGU-20A真空在線脫氣機(jī)，SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-30A柱溫箱，LabSolutions 5.81數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(日本SHIMADZU公司)；超導(dǎo)核磁共振儀(Avance III 400 MHz，瑞士Brucker 公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)；渦旋振蕩器(LAB DANCER S25，德國(guó)IKA公司)；低溫高速離心機(jī)(HERAEUS X1R，美國(guó)Thermo Scientific公司)；恒溫混勻儀(Thermo-Shaker MS-100，美國(guó)Thermo Scientific公司)；分析天平(BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；超純水制備系統(tǒng)(Milli-Q，美國(guó)MILLIPORE公司)；制冰機(jī)(IMS-20，江蘇省常熟市雪科電器有限公司)。

2 方法

2.1 分析條件

色譜柱：VP-ODS C18色譜柱(5 μm，150.0 mm×2.1 mm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A(乙腈) 和 B(0.2%甲酸水)，流速0.4 mL/min，梯度洗脫程序：0～7.0 min，90% B～10% B；7.0～8.0 min，10% B；8.0～9.0 min，10% B～90% B；9.0～12.0 min，90% B。檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸結(jié)合代謝途徑的鑒定

100 μM淫羊藿次苷Ⅱ，50 mM Tris-HCl緩沖液(pH值7.4)，5 mM MgCl2， 2 mM UDPGA，1 mg/mL Brij 58，0.5 mg/mL人肝微粒體蛋白，每個(gè)樣本體積為200 μL，雙樣本。37 ℃預(yù)孵育3 min，加入U(xiǎn)DPGA啟動(dòng)反應(yīng)，孵育60 min后加入200 μL冰乙腈終止反應(yīng)，立即渦旋混勻，14000 rpm，4 ℃離心20 min，取上清液置UFLC檢測(cè)。

2.3 淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物制備與表征

采用500 μM的淫羊藿次苷II與蛋白濃度為0.5 mg/mL的人重組酶UGT1A1進(jìn)行代謝產(chǎn)物制備，37 ℃孵育24 h，加入等體積乙腈終止反應(yīng)，離心移取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，采用減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑。殘留液通過SPE固相萃取柱(C18WAX，北京華譜新創(chuàng)科技有限公司)進(jìn)行富集和選擇性洗脫。富集前依次使用甲醇和蒸餾水活化，上樣同時(shí)檢測(cè)上樣流出液，上樣后依次用6 mL水，12 mL甲醇和12 mL含5%甲酸的甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫液采用UFLC進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物監(jiān)測(cè)。所得產(chǎn)物經(jīng)氘代DMSO溶解后采用1H-NMR、13C-NMR方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸結(jié)合代謝途徑的鑒定

淫羊藿次苷II在人肝微粒體反應(yīng)體系中出現(xiàn)一個(gè)保留時(shí)間為4.6 min的色譜峰，見圖1。該色譜峰在不加UDPGA對(duì)照組中沒有出現(xiàn)。經(jīng)推測(cè)，該色譜峰為淫羊藿次苷Ⅱ-7-O-葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。

Figure 1 UFLC chromatograms of icariside Ⅱ and its glucuronide in human liver microsomes

3.2 淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

淫羊藿次苷Ⅱ與其葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物核磁結(jié)構(gòu)表征結(jié)果見表1。經(jīng)鑒定，并與文獻(xiàn)對(duì)照[16]，該代謝產(chǎn)物為7-O-葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

Table.1 1H and 13C NMR data for icarisideⅡ and its glucuronide

4 討論

葡萄糖醛酸化反應(yīng)是由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的代謝反應(yīng)，肝臟是最為重要的葡萄糖醛酸化反應(yīng)器官，運(yùn)用肝微粒體可以進(jìn)行藥物體外代謝途徑研究，還可以預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的清除速率[17]。體外代謝酶歸屬研究中發(fā)現(xiàn)，UGT1A1是肝臟中參與淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝的主要UGT酶，所以采用實(shí)驗(yàn)室重組表達(dá)的UGT1A1高效轉(zhuǎn)化淫羊藿次苷Ⅱ，在37 ℃條件下孵育24 h后底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)81%。在產(chǎn)物制備過程中，未轉(zhuǎn)化的淫羊藿次苷II可以被甲醇溶液選擇性洗脫，代謝產(chǎn)物可以被5%甲酸甲醇溶液選擇性洗脫，同樣達(dá)到了高效特異制備淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的目的。

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Preparation and Characterization of the Glucuronide of IcarisideⅡMENG

Fan-xing1,LI Yan2,LU Fang1,LIU Shu-min1*

(1.DrugSafetyEvaluationCenter,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,,Harbin150040,China; 2.LaboratoryofPharmaceuticalResourceDiscovery,DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China)

Objective：To prepare and characterize the glucuronide of icarisideⅡ. Methods：The incubation system in human liver microsomes was used to identify the glucuronidation of icarisideⅡ. The recombinant UGT1A1 was applied to prepare the glucuronide. The structure of the glucuronide was characterized by NMR spectrometry. Results：The major metabolite of icarisideⅡ was 7-O-glucuronide in human liver microsomes. Conclusion：The method of in vitro incubation can be used to prepare the glucuronide of icarisideⅡ efficiently and specificly.

IcarisideⅡ; Human liver microsomes; Glucuronide; Nuclear magnetic resonance

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(No.2013CB531800)

孟繁興(1981-)，男，博士研究生，主要研究方向：藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥物代謝動(dòng)力學(xué)。

劉樹民*(1963-)，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥性理論及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

2016-02-10

R28

A

1002-2406(2016)05-0004-03

修回日期：2016-03-25