張雯珂，陳亞瓊

川芎嗪對宮頸癌HeLa細胞免疫抑制作用的影響

張雯珂，陳亞瓊

目的：研究川芎嗪（LHC）對宮頸癌HeLa細胞免疫抑制的影響。方法：以LHC作用HeLa細胞后，培養(yǎng)48 h，離心后收集上清（LHC-S1），重懸，再次培養(yǎng)48 h，離心后收集上清（LHC-S2），重懸，再次培養(yǎng)48 h，離心后收集上清（LHC-S3）。以與LHC組相同條件培養(yǎng)未經(jīng)藥物作用的HeLa細胞作為對照，同樣連續(xù)收集3次的培養(yǎng)上清（Control-S1、Control-S2、Control-S3）。用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測上清中轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、白細胞介素10（IL-10）的含量，紫外分光光度法檢測前列腺素E2（PGE2）含量，噻唑藍（MTT）法檢測對植物血凝素（PHA）誘導(dǎo)的外周血單核細胞（PBMC）增殖及對細胞毒性T淋巴細胞（CTL）細胞毒作用的影響，以流式細胞術(shù)（FCM）分析經(jīng)及不經(jīng)藥物作用的HeLa上清對外周血淋巴細胞亞群表型的影響。結(jié)果：（1）對照組3次培養(yǎng)上清中TGF-β1、IL-10和PGE2A278 nm值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；LHC組3次培養(yǎng)上清中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），TGF-β1逐漸降低，IL-10前2次相似，均低于第3次，PGE2A278 nm在第2次最低；除第2次的IL-10外，LHC組IL-10均低于相應(yīng)對照組。（2）3次培養(yǎng)上清對PBMC增殖的抑制率和對CTL的殺傷率在對照組，以及對CTL的殺傷率在LHC組和LHC組與相應(yīng)對照組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；LHC組第1次培養(yǎng)上清對PBMC增殖的抑制率最低。（3）對照組3次培養(yǎng)上清、LHC組3次培養(yǎng)上清外周血淋巴細胞亞群表型之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；與對照組相比，相應(yīng)LHC組的前2次培養(yǎng)上清CD3+、CD4+、CD25+、CD4+CD25-升高（P＜0.05），CD4+CD25+降低，第3次之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：LHC可下調(diào)HeLa細胞分泌免疫抑制分子，減少免疫抑制分子對PHA誘導(dǎo)的PBMC增殖的抑制，降低CD4+CD25+表達，上調(diào)CD3+、CD4+、CD25+、CD4+CD25-，可在一定程度上逆轉(zhuǎn)HeLa細胞的腫瘤免疫抑制。

川芎嗪；HeLa細胞；免疫耐受

（J Int Obstet Gynecol，2016，43:348-352）

腫瘤細胞通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、白細胞介素10（IL-10）及前列腺素E2（PGE2）等免疫抑制分子，逃避免疫監(jiān)視是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制。已有實驗證明HeLa細胞可分泌上述免疫抑制分子［1-3］。因此，尋找可下調(diào)宮頸癌免疫抑制分子分泌的藥物，是宮頸癌免疫治療的重要研究方向。川芎嗪是我國的傳統(tǒng)中藥，具有抗腫瘤作用［4］，對于其下調(diào)HeLa細胞免疫抑制分子分泌的研究，國內(nèi)外報道較少，現(xiàn)將筆者的研究報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司生產(chǎn)，每升完全培養(yǎng)液（complete medium，CM）中含小牛血清0.1 L，青霉素1×105U、鏈霉素100 mg；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清為天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司產(chǎn)品；青霉素及鏈霉素為華北制藥集團產(chǎn)品；胰蛋白酶、植物血凝素（PHA）、噻唑藍（MTT）、TGFβ1及IL-10定量酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均為Sigma公司產(chǎn)品；分析純二甲基亞砜（DMSO）、氫氧化鉀（KOH）及甲醇為天津市永大化學(xué)制劑開發(fā)中心產(chǎn)品；鹽酸川芎嗪（Ligustrazine Hydrochloride，LHC）注射液為北京市永康藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，國藥準(zhǔn)字H11020960，每支2 mL，40 mg/支，4℃避光保存，實驗前用DMEM稀釋至所需濃度；抗人CD25-FITC，CD-PE 及CD3-ECD抗體為BECKMAN COULTER公司產(chǎn)品；MK353型酶聯(lián)免疫儀為芬蘭Thermolabsystems產(chǎn)品；TU-1901型紫外分光光度儀為北京浦西通用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

PBMC濃度調(diào)整至2×106/mL，取250 μL接種于培養(yǎng)瓶，加入2 μg/mL PHA 250 μL，同時各瓶分別加入500 μL LHC-S1、LHC-S2、LHC-S3及Control-S1、Control-S2、Control-S3，37℃5%CO2飽和濕度中培養(yǎng)48 h后收集洗滌，重懸細胞后加入抗人CD3-ECD、CD25-FITC及CD4-PE單克隆抗體，各10 μL，室溫下混勻孵育30 min，洗滌細胞。FCM檢測陽性細胞百分率。陽性細胞抑制率=（對照組陽性細胞百分率-實驗組陽性細胞百分率）/對照組陽性細胞百分率×100%。對照組為熒光標(biāo)記相同的人PBMC無關(guān)同型IgG1為對照，設(shè)淋巴細胞門。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0軟件處理，定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，結(jié)果進行方差齊性檢驗后，用成組設(shè)計兩樣本均數(shù)比較的單側(cè)t或t′檢驗，以直線回歸方程表示免疫抑制分子的含量。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫抑制分子TGF-β1、IL-10及PGE2含量及LHC作用與免疫抑制功能的關(guān)系以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以ELISA法檢測的A值為縱坐標(biāo)，繪制TGF-β1、IL-10的標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線回歸分析顯示，檢測2種免疫抑制分子的直線回歸曲線方程分別為：TGF-β1=0.081+0.099X（t=3.608，P＜0.05）；IL-10=-0.068+0.265X（t=4.583，P＜0.05）。PGE2A值見表1，3個對照組的TGFβ1、IL-10的含量及PGE2的A278值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3個LHC組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），3組的TGF-β1逐漸下降，除第2次的IL-10外，LHC組IL-10均低于相應(yīng)對照組，PGE2A278 nm值在第2次培養(yǎng)后降低，而第3次培養(yǎng)后又升至第1次培養(yǎng)后水平。除LHC-S2組與Control-S2組的IL-10比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余的LHC組均低于相應(yīng)的對照組。

2.2 培養(yǎng)上清對PBMC增殖及對CTL殺傷活性的影響Control-S1和LHC-S1均對PHA誘導(dǎo)的PBMC增殖有抑制作用。LHC-S1對PBMC增殖的抑制率低于Control-S1（P＜0.05）；LHC-S2及LHC-S3 對PBMC增殖的抑制率與相應(yīng)對照組相似（P＞0.05）。人外周血單核細胞正常殺傷對照組（無上清作用）的殺傷率為（68.74±4.67）%，與正常殺傷對照相比，Control組和LHC組均可顯著抑制CTL的殺傷活性（P＜0.01）；與Control相應(yīng)對照組相比，LHC各組對CTL殺傷活性的抑制作用無明顯變化（P＞0.05）。見表2。

2.3 培養(yǎng)上清對PHA誘導(dǎo)的T淋巴細胞亞群的影響與PHA轉(zhuǎn)化正常組（Control不含上清）CD3+、CD4+、CD25+、CD4+CD25-細胞百分率相比，Control-S1相應(yīng)各組細胞百分率明顯降低（P＜0.05），CD4+CD25+升高。LHC組3次培養(yǎng)上清外周血淋巴細胞亞群表型之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組相比，相應(yīng)LHC組的前2次培養(yǎng)上清CD3+、CD4+、CD25+、CD4+CD25-升高（P＜0.05），CD4+CD25+降低，第3次之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表1 LHC作用后的HeLa細胞培養(yǎng)上清中免疫抑制因子的濃度（±s）

表1 LHC作用后的HeLa細胞培養(yǎng)上清中免疫抑制因子的濃度（±s）

注：Control 3組及LHC 3組單因素方差分析的結(jié)果，多重比較見字母a，b，c標(biāo)示，字母一致的組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，字母不一致的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；PS1～PS3為LHC組與相對應(yīng)的Control組比較結(jié)果。

組別nTGF-β1（ng/mL）IL-10（pg/mL）PGE2A278 nm值Control-S1組3989.23±34.84a3.39±0.16a0.26±0.01aControl-S2組3976.96±68.32a3.43±0.16a0.26±0.04aControl-S3組3963.57±16.35a3.77±0.15a0.25±0.04aP 0.0760.0830.065 LHC-S1組318.79±2.37a2.98±0.12a0.15±0.04aLHC-S2組32.40±0.46b2.87±0.11a0.09±0.01bLHC-S3組30.60±0.03c3.23±0.12b0.14±0.04aP 0.0430.0380.049 PS10.0060.0430.049 PS20.0090.0670.008 PS30.0050.0390.034

表2 LHC作用后的HeLa細胞培養(yǎng)上清對PBMC增殖及對CTL殺傷活性的影響（%，±s）

表2 LHC作用后的HeLa細胞培養(yǎng)上清對PBMC增殖及對CTL殺傷活性的影響（%，±s）

注：Control 3組及LHC 3組單因素方差分析的結(jié)果，多重比較見字母a，b，c標(biāo)示，字母一致的組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，字母不一致的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；PS1～PS3為LHC組與相對應(yīng)的Control組比較結(jié)果。

組別n對PBMC抑制率對CTL殺傷率Control-S1組346.78±4.12a51.37±3.78aControl-S2組350.76±4.98a56.48±6.25aControl-S3組349.33±5.57a55.37±4.48aP 0.0630.073 LHC-S1組320.36±1.34a58.76±6.30aLHC-S2組348.48±3.57b54.73±4.21aLHC-S3組350.46±4.76b53.76±3.78aP 0.0080.061 PS10.0340.069 PS20.0760.077 PS30.0840.074

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，在中國婦女中發(fā)病率居第2位，世界每年新發(fā)宮頸癌病例中，我國占1/3。臨床治療主要包括手術(shù)治療、放療及化療。后兩種治療手段會對機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持久而顯著的影響。目前，宮頸癌的免疫治療逐漸成為研究的熱點。已有研究表明，宮頸癌像其他大多數(shù)腫瘤一樣，可以通過分泌免疫抑制分子抑制免疫活性細胞的增殖、分化及活化，封閉細胞傳導(dǎo)通路，影響機體免疫應(yīng)答。TGF-β1［1］、IL-10［2］及PGE2［3］是其中發(fā)揮主要作用的免疫抑制分子。

注：Control 3組及LHC 3組單因素方差分析的結(jié)果，多重比較見字母a，b，c標(biāo)示，字母一致的組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，字母不一致的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；PS1～PS3為LHC組與相對應(yīng)的Control組比較結(jié)果。

本研究表明，宮頸癌HeLa細胞可以穩(wěn)定分泌上述免疫抑制分子，以TGF-β1量最大，濃度2×105/mL 的HeLa細胞，37℃5%CO2飽和濕度中培養(yǎng)48 h TGF-β1濃度可達989.23 ng/mL，經(jīng)LHC作用后，HeLa細胞所分泌的免疫抑制分子濃度呈下降趨勢，以TGF-β1最為明顯，因而所測試的3種免疫抑制分子中，TGF-β1為優(yōu)勢分泌的免疫抑制分子。研究表明，TGF-β1為目前已知的最主要的免疫抑制分子。而經(jīng)再培養(yǎng)后，隨著藥物作用被洗脫，上清中免疫抑制分子呈逐漸上升趨勢。可證明，經(jīng)LHC作用后的培養(yǎng)上清可下調(diào)HeLa細胞免疫抑制分子的分泌。

本研究表明，經(jīng)LHC作用后的HeLa細胞第1次培養(yǎng)上清，可以部分逆轉(zhuǎn)抑制分子對PBMC增殖的抑制作用，但是隨著LHC作用被洗脫，LHC-S2 及LHC-S3的培養(yǎng)上清這種作用明顯減弱。PHA可誘導(dǎo)具有活性的T細胞進行轉(zhuǎn)化，CD3+是淋巴細胞的主要成分，CD4+為輔助性T淋巴細胞，而CD25+是T細胞活化的標(biāo)志，其表達率反應(yīng)T細胞活化水平。CD4+CD25+Treg為免疫抑制細胞［5-7］。將HeLa細胞培養(yǎng)上清作用于上述淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)其有免疫抑制作用，促使CD4+CD25-向CD4+CD25+Treg轉(zhuǎn)化，抑制CD4+CD8+T細胞功能。經(jīng)LHC作用后的上清可部分逆轉(zhuǎn)這種免疫抑制現(xiàn)象，進一步說明LHC可下調(diào)導(dǎo)致免疫抑制分子的分泌。CTL細胞是腫瘤免疫的主要效應(yīng)細胞。本研究以腫瘤細胞作為抗原，經(jīng)含有IL-2的培養(yǎng)基反復(fù)刺激誘導(dǎo)獲得特異性的CTL。本研究表明，HeLa細胞培養(yǎng)上清具有降低CTL細胞殺傷率的作用，但經(jīng)LHC作用后的HeLa細胞培養(yǎng)上清對CTL細胞殺傷及誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的抑制無明顯改變，說明目前實驗中所采用的LHC濃度不能逆轉(zhuǎn)免疫抑制分子對CTL細胞殺傷及誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的抑制。

LHC作為我國傳統(tǒng)中藥，具有促進一氧化氮生成、減少氧自由基及抗細胞凋亡的作用［8-10］，常被應(yīng)用于心腦血管疾病的治療，在腫瘤治療中多用于輔助治療，用于降調(diào)節(jié)免疫抑制因子少見報道。本研究表明LHC作用后，所培養(yǎng)的HeLa細胞培養(yǎng)上清可逆轉(zhuǎn)PHA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖抑制及上調(diào)CD4+CD25-T細胞的百分率，這有可能為LHC抗瘤作用機制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)LHC的抗瘤機制可能為：下調(diào)上清中TGF-β1、IL-10及PGE2的含量，即LHC下調(diào)了HeLa細胞分泌的免疫抑制分子，減少對PBMC增殖的抑制，同時通過某種機制降低CD4+CD25+表達，上調(diào)CD3+、CD4+、CD25+、CD4+CD25-，可在一定程度上逆轉(zhuǎn)HeLa細胞的腫瘤免疫抑制。提示可在宮頸癌患者術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后加用LHC，可能部分逆轉(zhuǎn)宮頸癌免疫抑制，增強療效，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。但免疫抑制分子如何引起免疫細胞表達的變化，這種機制目前尚未明確，有待進一步研究。

［1］Cheng YX，Qi XY，Huang JL，et al.Toll-like receptor 4 signaling promotes the immunosuppressive cytokine production of human cervical cancer［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2012，33（3）：291-294.

［2］Chaqas BS，Gurgel AP，da Cruz HL，et al.An interleukin-10 gene polymorphism associated with the development of cervical lesions in womeninfectedwithhumanPapillomavirusandusingoral contraceptives［J］.Infect Genet Evol，2013，10（19）：32-37.

［3］Zhang LX，LiuZN，Ye J，etal.Artesunate exerts anantiimmunosuppressive effect on cervical cancer by inhibiting PGE2production and FOXP3 expression［J］.Cell Boil Int，2014，38（5）：639-646.

［4］萬慧芳，余波，涂碩，等.川芎嗪對人結(jié)腸癌LoVo細胞增殖與凋亡的影響［J］.中成藥，2014，3（7）：1367-1370.

［5］Chen Z，Ding J，Pang N，et al.The Th17/Treg balance and the expression of related cytokines in Uygur cervical cancer patients［J］. Diagn Pathol，2013，15（8）：61-64.

［6］Chen ZY，Xu Q，Ding JB，et al.CD4+CD25+FOX3+Treg and TGF-beta play important roles in pathogenesis of Uygur cervical carcinoma［J］. Eur J Gynaecol Oncol，2012，33（5）：502-507.

［7］Adurth S，Mukherjee G，Krishnamurthy H，et al.Functional tumor infiltrating TH1 and TH2 effectors in large early-stage cervical cancer are suppressed by regulatory T cells［J］.Int J Gynecol Cancer，2012，22（7）：1130-1137.

［8］Yu K，Chen Z，Pan X，et al.Tetramethylpyrazine-mediated suppression of C6 gliomas involves inhibition of chemokine receptor CXCR4 expression［J］.Oncol Rep，2012，28（3）:955-960.

［9］楊華.川芎嗪注射液對慢性肺源性心臟病患者生命質(zhì)量及氧化應(yīng)激的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2014，23（2）：351-352.

［10］劉延梅，馬少群，苗青，等.川芎嗪聯(lián)合胚胎干細胞治療大鼠肺纖維化的機制研究［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014，43（1）：10-14.

The Immunosuppression of Cervical Carcinoma Cell Line HeLa after Inoculating by LHC

ZHANG Wen-ke，CHEN Ya-qiong.Department of Obstetrics and Gynecology，The Affiliated Hospital of the Chinese People's Armed Police Force Logistics College，Tianjin 300162，China

Objective:To study the variation of immunosuppression of HeLa inoculated by LHC.Methods: HeLa was inoculated by LHC，for 48 h，the supernatants were collected（LHC-S1），after centrifuging the cells，and then adjusted the concentration of HeLa，inoculated for 48 h，centrifuged cells，collect the supernatants（LHC-S2），adjusted the concentration of HeLa，inoculated for 48 h，after centrifuging the cells collected the supernatants （LHC-S3）.Compared with the HeLa′s supernatant without LHC，which was inoculated in the same condition，collected the supernatant for 3 times（Control-S1，Control-S2，Control-S3），test the TGF-β1 and IL-10 by ELISA，PGE2by ultraviolet spectrophotometry，by means of MTT to detect the proliferation of PHA induce PBMC and antibody-dependent cellular cytotoxicity of CTL.Flow cytometry（FCM）to analyze the subpopulation of peripheral blood lymphocytes，which was inoculated by the supernatants.Results:（1）The TGF-β1，IL-10 and PGE2A278 nm of control group had no significant difference in statistics（P＞0.05）；in LHC-group the difference were statically significant（P＜0.05）；TGF-β1 gradually decreased，IL-10 was similarity in LHC-S1 and LHC-S2，less than that in LHC-S3，PGE2A278 nm was the minimum in LHC-S2；except in LHC-S2，IL-10 was less than the control group.（2）All the supernatants of the control group could inhibit the proliferation of PHA induced PBMC and cytotoxicity of CTL，had no significant statistic difference（P＞0.05），the inhibition to CTL in LHC group and corresponding control group had no significant statistic difference（P＞0.05）；in LHC group，the inhibition ratio in LHC-S1 was the lest.（3）All the supernatants could influence the expression of the subpopulation of lymphocyte，it had statistic difference（P＜0.05）；Compared with control group，the percentage of CD3+，CD4+，CD25+and CD4+CD25-increased in LHC-S1 and LHC-S2 group，the percentage of CD4+CD25+decreased（P＜0.05），in the LHC-S3 group，the difference was not significant（P＞0.05）.Conclusions:The immunosuppressive molecules of HeLa could be reduced by LHC；LHC could decrease the inhibition of the proliferation of PHA induce PBMC；LHC also could increase the percentage of CD3+，CD4+，CD25+and CD4+CD25-，reduce CD4+CD25+；LHC could reverse the immunosuppression of HeLa to a certain degree.

Tetramethylpyrazine；HeLa cells；Immune tolerance

2015-10-13）

［本文編輯 王琳］

300162天津，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科