趙秀娟，陳萬標(biāo)，張沛濤，張娜，楚曉文，白向陽，楊冰，吳旭東，王璽△

應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在G401細(xì)胞株中敲除p21基因

趙秀娟1，陳萬標(biāo)2，張沛濤1，張娜2，楚曉文3，白向陽4，楊冰1，吳旭東1，王璽1△

目的運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在人惡性橫紋肌樣瘤細(xì)胞株G401中敲除p21基因。方法通過反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）及Western blot檢測(cè)各瘤細(xì)胞株中p21的表達(dá)，針對(duì)p21基因作用的功能域，設(shè)計(jì)了靶向人p21基因第3個(gè)外顯子的向?qū)NA（sgRNA），克隆入lentiCRISPR v2載體。將測(cè)序及酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒在293T工具細(xì)胞中制備慢病毒顆粒并感染G401細(xì)胞，使用嘌呤霉素進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選，顯微鏡下挑取單克隆細(xì)胞團(tuán)并繼續(xù)培養(yǎng)獲得G401單克隆細(xì)胞株。提取單克隆細(xì)胞株RNA及蛋白，利用RT-qPCR及Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞株中p21的敲除效果。結(jié)果p21在人橫紋肌樣瘤細(xì)胞中高表達(dá)。成功構(gòu)建靶向p21基因的lentiCRISPR v2-sgRNA重組慢病毒質(zhì)粒。與對(duì)照組相比，篩選得到的G401亞克隆細(xì)胞系中p21蛋白表達(dá)缺失。結(jié)論針對(duì)難轉(zhuǎn)染的G401細(xì)胞，應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建了p21基因敲除的穩(wěn)定株，為后續(xù)深入研究p21在人惡性橫紋肌樣瘤中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

橫紋肌瘤；p21；基因敲除；CRISPR/Cas9；慢病毒

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由多基因共同參與的復(fù)雜過程，涉及多條信號(hào)通路。p21蛋白作為熟知的抑癌因子，通常以p53調(diào)控依賴的方式使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子［1］。但后續(xù)有研究表明p21也可促進(jìn)細(xì)胞增殖，發(fā)揮癌基因作用［2］。因此，p21在腫瘤中的作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。CRISPR/Cas9（Clustered Regularly InterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-associated 9）是基于細(xì)菌保護(hù)自身免受病毒感染的系統(tǒng)衍生而來，在細(xì)菌［3］、斑馬魚［4］、大鼠［5］以及人類細(xì)胞［6］中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的基因組編輯活性。本實(shí)驗(yàn)是基于在人惡性橫紋肌樣瘤（malignant rhabdoid tumor，MRT）細(xì)胞中觀察到的p21的表達(dá)，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中適用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的慢病毒載體質(zhì)粒，在感染靶細(xì)胞的同時(shí)產(chǎn)生向?qū)NA（sgRNA）靶向p21基因，并表達(dá)招募Cas9核酸酶對(duì)其進(jìn)行切割，導(dǎo)致p21基因的敲除。G401細(xì)胞p21基因敲除穩(wěn)定株的構(gòu)建，為更加深入地研究p21在相關(guān)腫瘤中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞質(zhì)粒lentiCRISPR v2購自addgene公司。質(zhì)粒圖譜可于http://www.addgene.org網(wǎng)站查詢。感受態(tài)細(xì)菌Stbl3購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。人胚腎細(xì)胞株293T及人惡性橫紋肌樣瘤細(xì)胞株A204、G401、TTC642及BT16為本實(shí)驗(yàn)室存留。

1.1.2 酶類及主要試劑Fast Digest BsmBI、FastAP、10× FastDigest Buffer（Green）購自Fermentas公司；T4 PNK、T4 ligase、10×T4 Ligation Buffer、10 mmol/L ATP購自NEB公司；Plasmid Safe exonuclease、10×Plasmid Safe Buffer購自Epicentre公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒購自QIAGEN公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、血清及雙抗購自Gibco公司；兔源p21抗體，鼠源β-actin抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)抗鼠IgG、抗兔IgG購自CST公司；2xSYBR Green qPCR Mix購自Roche公司。

1.1.3 其他基因測(cè)序工作由華大科技公司完成。sgRNA寡鏈核苷酸（oligo）DNA序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA oligo序列的設(shè)計(jì)利用http://www.ncbi.nlm. nih.gov/網(wǎng)站確定針對(duì)p21 CDs區(qū)基因序列，sgRNA序列設(shè)計(jì)參考http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站。設(shè)計(jì)原則如下:（1）首選第1個(gè)外顯子進(jìn)行序列分析設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，若exon1＜100 bp，則順延選擇合適大小的外顯子。（2）根據(jù)網(wǎng)站分析反饋的結(jié)果，選擇分?jǐn)?shù)較高的一對(duì)序列，去掉PAM序列堿基。（3）sgRNA的5′端第1個(gè)堿基若不是G，則需要在前面補(bǔ)G。（4）以sgRNA序列為模版，設(shè)計(jì)出其互補(bǔ)鏈，在其兩端加上酶切位點(diǎn)。即在每條sgRNA序列F鏈的5′端添加CACC，R鏈的5′端添加AAAC。以下將lentiCRISPRv2重組質(zhì)粒簡稱為v2-p21。

1.2.2 lentiCRISPR v2-p21的構(gòu)建與鑒定lentiCRISPR v2為含U6啟動(dòng)子的sgRNA骨架慢病毒表達(dá)載體，既表達(dá)具有Cas9切口酶，又帶有氨芐青霉素和嘌呤霉素抗性。（1）lentiCRISPR v2載體線性化:用Fast Digest BsmBI對(duì)v2進(jìn)行酶切，DNA凝膠電泳后回收線性化的載體。（2）sgRNA的合成及形成二聚體:用T4 PNK對(duì)oligo進(jìn)行磷酸化并使用梯度退火形成二聚體。（3）sgRNA二聚體與v2線性載體連接:v2載體和退火產(chǎn)物比例為1∶3，室溫（25℃）反應(yīng)60 min。（4）重組質(zhì)粒純化:使用質(zhì)粒保護(hù)的核酸外切酶去除非特異連接。（5）轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌Stbl3，在氨芐抗性的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆搖菌，送測(cè)序。（6）酶切驗(yàn)證:使用Fast Digest BsmBI對(duì)v2質(zhì)粒載體、v2-p21進(jìn)行酶切。酶切后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。測(cè)序正確的克隆提取重組質(zhì)粒v2-p21。

1.2.3 病毒包裝、細(xì)胞感染及單克隆細(xì)胞的獲得培養(yǎng)293T工具細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%左右進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h換新鮮的含10%滅活血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，配置磷酸鈣轉(zhuǎn)染復(fù)合物:管A中為CaCl2和DNA的混合液，其中vector∶VSVG∶psPAX2為10∶3.5∶6.5，余體積用水補(bǔ)足；管B中為2×HBS，與管A體積相等。將B中液體逐滴加入A中并不斷混勻，室溫放置10 min后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢均勻加入293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染16 h內(nèi)給293T細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)基，48 h后開始收集含病毒的培養(yǎng)基，連續(xù)收集2次。感染前24 h將G401細(xì)胞接種至6 cm培養(yǎng)皿中，感染時(shí)將收集的病毒上清（含polybrene 8 mg/L）加入到靶細(xì)胞中，感染8～12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，感染48 h后加入嘌呤霉素篩選（2 mg/L）。篩選48 h后消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)400個(gè)單細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待生長1周左右獲得單細(xì)胞集落，在顯微鏡下挑取細(xì)胞團(tuán)接種至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 Western blot及反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)p21的表達(dá)培養(yǎng)人MRT細(xì)胞株及對(duì)照細(xì)胞293T，收集各株細(xì)胞，一部分用RIPA裂解細(xì)胞獲得全細(xì)胞裂解液，離心取上清作為樣品。測(cè)定樣品蛋白濃度，取等量蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)印至NC膜后，5%脫脂牛奶封閉，一抗、二抗孵育，加入曝光底物進(jìn)行曝光，以β-actin為內(nèi)參。收集的另一部分細(xì)胞用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，去除基因組DNA，再逆轉(zhuǎn)成cDNA。設(shè)計(jì)擴(kuò)增p21基因的qPCR引物，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增檢測(cè)p21在細(xì)胞中的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參，內(nèi)參與目的基因的退火溫度均為60℃。同樣，野生型G401細(xì)胞和測(cè)序正確的單克隆細(xì)胞被收集用于Western blot及RT-qPCR擴(kuò)增，進(jìn)而檢測(cè)p21在細(xì)胞中的表達(dá)情況，比較野生型和p21基因敲除細(xì)胞中p21的表達(dá)差異。具體操作同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，兩個(gè)樣本的組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p21在人MRT細(xì)胞中的表達(dá)RT-qPCR結(jié)果顯示，p21的mRNA表達(dá)水平在對(duì)照及瘤細(xì)胞株中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=747.367，P＜0.01）。4株人惡性橫紋肌樣瘤細(xì)胞中p21的mRNA表達(dá)水平（分別為2.776±0.135、5.153±0.126、4.866±0.150、5.966±0.330）均高于對(duì)照細(xì)胞（0.993±0.015，均P＜0.01），見圖1A。Western blot結(jié)果顯示，p21蛋白在對(duì)照細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)變化與mRNA水平一致，見圖1B。

Fig.1The expression of p21 in MRT cell lines圖1 p21在MRT細(xì)胞株中的表達(dá)

2.2 sgRNA靶點(diǎn)的選擇及寡核苷酸序列人p21基因前2個(gè)外顯子區(qū)太短，因此選取此基因的第3個(gè)外顯子區(qū)進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)，挑選脫靶效應(yīng)最低的sgRNA合成，單鏈DNA模板序列見表1。

Tab.1The sequences of hp21 sgRNA oligo and RT-qPCR primer表1 hp21 sgRNA及RT-qPCR引物序列

2.3 重組質(zhì)粒lentiCRISPR v2-p21的測(cè)序及酶切酶切鑒定結(jié)果見圖2A，成功構(gòu)建的質(zhì)粒不含有BsmBI酶切位點(diǎn)，因此不能被切割為線性。測(cè)序結(jié)果見圖2B，插入序列的位置、方向均正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 Western blot及RT-qPCR檢測(cè)p21基因敲除的效果同G401野生型細(xì)胞相比，G401-p21-KO單克隆細(xì)胞中未檢測(cè)到p21蛋白表達(dá)，表明G401細(xì)胞p21基因敲除穩(wěn)定株構(gòu)建成功，見圖3A。相比于野生型G401細(xì)胞，G401-p21-KO單克隆細(xì)胞中p21 mRNA表達(dá)降低（n=6，1.000±0.020 vs.0.157± 0.010，t=63.234，P＜0.01），見圖3B。

Fig.2The enzyme digestion and sequencing of recombinant eukaryotic expressional plasmid圖2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切和測(cè)序結(jié)果

Fig.3Protein and mRNA expression analysis of p21 KO圖3 p21敲除后蛋白及mRNA表達(dá)水平結(jié)果

3 討論

3.1 p21在腫瘤中的雙重作用自從1993年首次發(fā)現(xiàn)p21作為抑癌基因p53的抑癌活性的介導(dǎo)者以來［7］，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道了p21在腫瘤中的相關(guān)作用。首先利用Cdkn1a敲除致瘤的小鼠模型，Martin-Caballero等［8］研究表明細(xì)胞周期調(diào)控子p21發(fā)揮抑癌作用，隨后系列研究報(bào)道了多種腫瘤包括結(jié)腸癌［9］、宮頸癌［10］、肺癌［11］等均與p21的低表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在ras基因突變或暴露于致癌物的小鼠聯(lián)合p21基因突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［12］，表明p21可能不是經(jīng)典的抑癌基因。與之相反，p21被發(fā)現(xiàn)在多種情況下還具有癌基因的作用。研究發(fā)現(xiàn)p21不僅過表達(dá)于各種人類腫瘤如膀胱癌、乳腺癌等，還隨腫瘤的發(fā)生發(fā)展表達(dá)上調(diào)，與患者的預(yù)后密切相關(guān)［13］。具有雙重角色的p21蛋白在腫瘤進(jìn)展的研究中可能作為新范本，即其作用不是永恒的，而是由其所處的特殊細(xì)胞內(nèi)環(huán)境決定的。近年來，有研究者發(fā)現(xiàn)p21的這種功能多樣性與其在細(xì)胞中的定位相關(guān)，即p21表達(dá)在胞漿具有抗凋亡作用，而抑制細(xì)胞增殖與促進(jìn)凋亡與其核定位有關(guān)［14］。MRT是一種好發(fā)于嬰幼兒和兒童的比較少見但高度惡性的腫瘤，大多發(fā)生于腎、軟組織及中樞神經(jīng)系統(tǒng)［15］。本研究顯示p21高表達(dá)于MRT多種細(xì)胞株中，提示p21在其中可能發(fā)揮重要的作用。目前關(guān)于p21在MRT中的作用及機(jī)制仍不清楚，需進(jìn)一步研究。

3.2 CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來完成對(duì)G401細(xì)胞中p21基因的靶向性敲除，包括選擇一個(gè)靶區(qū)域、構(gòu)建慢病毒載體、優(yōu)化轉(zhuǎn)染等。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是新一代的基因定向編輯技術(shù)，相比于鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger endonuclease，ZFN）［16］和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）［17］等經(jīng)典的基因打靶技術(shù)，具有操作簡單、制備周期短、成本低、可同時(shí)沉默任意數(shù)量的單個(gè)基因等優(yōu)點(diǎn)［18］。此外，CRISPR/Cas9技術(shù)與TALEN和ZFN技術(shù)相比在降低脫靶效應(yīng)方面也具有一定的優(yōu)越性。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，通過設(shè)計(jì)及預(yù)測(cè)出具有最小脫靶率的特異sgRNA，將其導(dǎo)入細(xì)胞，對(duì)目的基因進(jìn)行靶標(biāo)并招募Cas9蛋白進(jìn)行切割，導(dǎo)致細(xì)胞通過非同源性末端接合（nonhomologousendjoining，NHEJ）和同源重組（homology directedrepair，HDR）機(jī)制進(jìn)行DNA修復(fù)。在修復(fù)過程中斷裂的位點(diǎn)處會(huì)發(fā)生插入或缺失部分片段，產(chǎn)生框移突變，從而達(dá)到敲除目的基因的作用［19］。由于CRISPR/Cas9技術(shù)的高效實(shí)用性，其在各種細(xì)胞模型中被廣泛應(yīng)用。將目的序列連接到載體并轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞是獲得長期穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的首要步驟。目前，轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞常用的基因?qū)胼d體主要包括質(zhì)粒載體和病毒載體。對(duì)于轉(zhuǎn)染效率較高的細(xì)胞通常選擇質(zhì)粒載體便可達(dá)到理想效果［20］。與質(zhì)粒載體相比，病毒載體具有轉(zhuǎn)染率高、目的基因長期穩(wěn)定表達(dá)及適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)。其中慢病毒載體系統(tǒng)是目前基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究中使用最廣泛的一類載體，尤其適用于干細(xì)胞、原代細(xì)胞及難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)使用lentiCRISPR v2質(zhì)粒作為載體，該質(zhì)粒不僅可以同時(shí)表達(dá)Cas9和插入的sgRNA，簡化了表達(dá)Cas9質(zhì)粒和sgRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的步驟，而且還含有嘌呤霉素（puromysin）抗性篩選標(biāo)記，轉(zhuǎn)染后通過藥物篩選得到陽性克隆。最重要的是其具有慢病毒載體骨架，能夠通過病毒包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒導(dǎo)入低轉(zhuǎn)染率的目的細(xì)胞。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)是目前成功廣泛應(yīng)用的熱門技術(shù)，其在簡易克隆和多重基因組編輯方面有著很大優(yōu)勢(shì)，為利用基因療法治療疾病提供了新方法，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

本研究構(gòu)建的p21基因穩(wěn)定敲除細(xì)胞株，為后續(xù)研究p21在人MRT發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制提供了工具，也為制定相應(yīng)的治療策略、提高患者預(yù)后奠定了基礎(chǔ)。

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（2016-08-02收稿2016-08-24修回）

（本文編輯李鵬）

Study on p21 gene knock out in G401 cell line by using CRISPR/Cas9 system

ZHAO Xiujuan1，CHEN Wanbiao2，ZHANG Peitao1，ZHANG Na2，CHU Xiaowen3，
BAI Xiangyang4，YANG Bing1，WU Xudong1，WANG Xi1△1 Department of Cell Biology，School of Basic Medical Sciences，2 School of Biomedical Engineering，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；3 The 66350 Military Medical Team，Lingyun Street，Lianchi District，Baoding City，Hebei Province；4 Dealiner Bioelectronics LLC，Jiangyin△

ObjectiveTo knock out p21 gene in human malignant rhabdoid tumor（MRT）cell line G401 by using CRISPR/Cas9 genome engineering technology.MethodsThe expression of p21 was detected by reverse transcription quantitative PCR（RT-qPCR）and Western blot assay in several MRT cell lines.The guide RNA was designed by targeting the third exon of p21 gene，which encoded its home domains，and then subcloned into lentiCRISPR v2 vector and validated sequencing.The validated plasmids were further used to package and produce the lentivirus in 293T cells，and the G401 cells were infected，then puromycin was used to screen positive cells，and the clusters of G401 monoclonal cells，were obtained by selecting monoclonal cells and culturing under the microscope.The RNA and protein of new clonal cell line were extracted，and RT-qPCR and Western blot assay were applied to confirm whether p21 was successfully knocked out. ResultsThe p21 was highly expressed in MRT tumor cells.The CRISPR/Cas9 lentivirus plasmids，targeted p21 gene were successfully constructed.Compared with negative control group，the expression of p21 was not detected in G401 monoclonal cells，which were successfully screened.ConclusionIn view of the difficult transfection of cells such as G401，p21 knockout stable cell line has been successfully constructed by using CRISPR/Cas9 system，which lays the foundation for further study of the mechanism of p21 in MRT tumors.

rhabdomyoma；p21；gene knockout；CRISPR/Cas9；lentivirus

R73，R349.64

A

10.11958/20160731

天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（093-201301）；天津市自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（16JCQNJC10300，16JCQNJC12100）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81500170）

1天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系（郵編300070），2生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院；3河北省保定市蓮池區(qū)凌云街66350部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)；4江陰迪林生物電子技術(shù)有限公司

趙秀娟（1983），女，博士，講師，主要從事腫瘤的表觀遺傳學(xué)研究

△通訊作者E-mail:wangxi@tmu.edu.cn