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慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者外周血Th17細(xì)胞的表達(dá)及臨床意義

2016-11-07 06:32余皓月封明霞陳照俊胡佳勇
標(biāo)記免疫分析與臨床 2016年8期
關(guān)鍵詞:穩(wěn)定期外周血阻塞性

羅 成,余皓月,封明霞,陳照俊,胡佳勇

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所呼吸內(nèi)科,重慶400042;2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管內(nèi)科,重慶400042)

慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者外周血Th17細(xì)胞的表達(dá)及臨床意義

羅 成1,余皓月1,封明霞1,陳照俊1,胡佳勇2

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所呼吸內(nèi)科,重慶400042;2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管內(nèi)科,重慶400042)

目的 探討外周血Th17細(xì)胞在慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者中的表達(dá)及臨床意義。方法 以260例慢性阻塞性肺疾?。–OPD)患者為研究對(duì)象,按臨床表現(xiàn)分為COPD穩(wěn)定期組(130例)和AECOPD組(130例),同時(shí)選取50例健康體檢者為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th17細(xì)胞水平,酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)外周血細(xì)胞因子IL-17水平,同時(shí)檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白(CRP)及白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)水平,記錄COPD評(píng)估測(cè)試(CAT)評(píng)分。結(jié)果 AECOPD組患者外周血Th17細(xì)胞、IL-17、CRP及WBC水平顯著高于COPD穩(wěn)定期組和正常對(duì)照組(P<0.05);經(jīng)過相應(yīng)治療后,AECOPD組患者外周血Th17細(xì)胞、IL-17、CRP、WBC水平及CAT評(píng)分均較治療前明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示,AECOPD組患者外周血Th17細(xì)胞水平與CAT評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.91,P<0.01)。外周血Th17細(xì)胞水平與炎性因子IL-17也呈正相關(guān)(r=0.89,P<0.01),而AECOPD組患者外周血Th17細(xì)胞水平與CRP(r=0.084,P> 0.05)、WBC(r=0.063,P>0.05)水平無顯著相關(guān)性。ROC曲線分析顯示,外周血Th17細(xì)胞水平的曲線下面積(AUC)為0.868(95%CI0.774~0.918),以外周血Th17細(xì)胞水平3.72作為臨界值時(shí),其診斷AECOPD的敏感性為88.6%,特異性為86.4%,其顯著優(yōu)于CRP和WBC指標(biāo)。結(jié)論 外周血Th17細(xì)胞在AECOPD患者中高表達(dá),其可作為預(yù)測(cè)COPD急性加重期的有效指標(biāo),具有一定的臨床運(yùn)用價(jià)值。

慢性阻塞性肺疾??; 急性加重期; Th17細(xì)胞; 白細(xì)胞介素-17; 慢性阻塞性肺疾病評(píng)估測(cè)試評(píng)分

慢性阻塞性肺疾?。╟hronicobstructive pulmonary disease,COPD)是各種炎性細(xì)胞參與的全身異常炎癥反應(yīng)性疾病,主要以不完全可逆的氣流受限為主要特點(diǎn)[1]。其頻繁的急性加重期COPD(AECOPD)常導(dǎo)致患者肺功能迅速惡化,如何早期預(yù)測(cè)其急性加重是COPD防治的目標(biāo)之一。相關(guān)研究證實(shí),COPD的發(fā)病機(jī)制與有害氣體、顆粒等在肺組織產(chǎn)生異常炎癥,促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向肺部募集與活化有關(guān)[2]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)是近些年發(fā)現(xiàn)的一類淋巴細(xì)胞亞群,在慢性炎癥和自身免疫學(xué)疾病中起著重要的作用,其特異性分泌的細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-17)可促進(jìn)機(jī)體炎癥細(xì)胞釋放大量趨化因子,進(jìn)而引起中性粒細(xì)胞向炎癥組織聚集[3]。Th17細(xì)胞是否與COPD急性加重期有關(guān),目前,相關(guān)研究尚未闡明。因此,本研究通過檢測(cè)AECOPD及COPD穩(wěn)定期患者外周血Th17細(xì)胞、IL-17、CRP、WBC水平,并分析Th17細(xì)胞與COPD評(píng)估測(cè)試(CAT)評(píng)分的相關(guān)性,以期探討外周血Th17細(xì)胞水平在預(yù)測(cè)COPD急性加重中的臨床價(jià)值。

資料與方法

1 研究對(duì)象

收集2013年1月至2015年6月到我院呼吸內(nèi)科住院及門診就診的COPD患者260例為研究對(duì)象,其中男150例,女110例,年齡40~75歲,中位年齡59歲,所有患者均滿足COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。根據(jù)患者癥狀及肺功能分為AECOPD(130例)和COPD穩(wěn)定期(130例)。AECOPD診斷標(biāo)準(zhǔn)還需滿足:近期內(nèi)患者的呼吸系統(tǒng)癥狀有急性加重表現(xiàn):氣促、呼吸困難加重,痰量增加等。入院后痰細(xì)菌培養(yǎng)為陽性且予以抗感染治療后癥狀明顯緩解。COPD穩(wěn)定期組和AECOPD組均需排除:①合并有其他肺部疾病或其他系統(tǒng)感染者;②存在免疫缺陷的患者;③合并有其他系統(tǒng)疾病如心、肝、腦、腎等嚴(yán)重功能障礙;④近一個(gè)月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的患者;⑤不愿意配合及不能交流的患者。同時(shí)選取我院門診的健康體檢者50例為正常對(duì)照組,其中男性28例,女性22例,年齡41~74歲,中位年齡58歲。各組間在性別、年齡等方面,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。本研究得到了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),并且所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

2 主要儀器與試劑

流式細(xì)胞分析儀(美國Backman Coulter公司);RPMI1640培養(yǎng)液及胎牛血清(美國Gibco公司);高速離心機(jī)(美國Beckman公司);肺功能儀(美國SensorMedics公司);佛波酯、離子霉素及莫能菌素(美國Sigma公司);異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人CD4單克隆抗體及藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗人IL-17單克隆抗體(美國BD公司);人細(xì)胞因子IL-17酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)(美國R&D公司)。

3 研究方法

3.1 COPD評(píng)估測(cè)試(CAT)評(píng)分 記錄所有COPD患者臨床資料,在進(jìn)行肺功能檢測(cè)當(dāng)天采用CAT問卷對(duì)其進(jìn)行生活質(zhì)量評(píng)分。CAT問卷主要包括8個(gè)問題(咳嗽、咳痰、胸悶、爬坡或上一層樓梯的感覺、家務(wù)活動(dòng)、離家外出信心程度、睡眠和精力)?;颊邞?yīng)根據(jù)自身情況,對(duì)上述各個(gè)項(xiàng)目做出相應(yīng)評(píng)分,每個(gè)問題應(yīng)根據(jù)其病情從輕到重依次為0~5分。計(jì)算總分,CAT分值范圍是0~40分。

3.2 外周血采集與處理 COPD穩(wěn)定期組和AECOPD組患者均在就診或入院24 h內(nèi),健康對(duì)照組在體檢時(shí),采集各組空腹靜脈血送檢。同時(shí)對(duì)AECOPD組患者在經(jīng)過相應(yīng)治療后1周,即給予50μg沙美特羅、500μg丙酸氟替卡松,一日2次,及18μg噻托溴銨治療,一日1次。再次采集空腹靜脈血送檢。分別檢測(cè)外周血Th17細(xì)胞水平、IL-17、C反應(yīng)蛋白(CRP)及白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)。

3.3 外周血Th17細(xì)胞檢測(cè) 對(duì)收集的各組空腹靜脈血,經(jīng)抗凝、離心及洗滌后,得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)懸液,采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算PBMC數(shù)量,調(diào)整 PBMC密度。取 PBMC 1mL,加入RPMI-1640培養(yǎng)基 1 mL,佛波酯(50 ng/mL)、離子霉素(1μg/mL)及莫能菌素(0.7μg/mL)吹打混勻,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。取出細(xì)胞懸液,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,加入抗人CD4單抗20μL,震蕩混勻后,室溫避光孵育30min。再通過加入染色緩沖液2 mL及抗IL-17單抗20μL,室溫孵育15min,此后PBS洗滌后,棄上清,加入染色固定液0.5mL, 4℃保存,等待上機(jī)檢測(cè)。

3.4 外周血IL-17、WBC、CRP的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)各組患者外周血IL-17水平,整個(gè)操作按試劑盒說明步驟進(jìn)行。對(duì)各組同時(shí)采用血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)、超敏免疫比濁法檢測(cè)CRP水平,進(jìn)一步檢測(cè)AECOPD組經(jīng)相應(yīng)治療后WBC、CRP等變化情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),相關(guān)性分析運(yùn)用Pearson相關(guān)分析,P<0.05,表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用Graphpad軟件做ROC曲線分析,計(jì)算ROC曲線下面積(AUC)、最佳工作點(diǎn)(OOP)、敏感性及特異性。

結(jié) 果

1 各組外周血Th17細(xì)胞及炎性因子水平

AECOPD組患者外周血Th17細(xì)胞、IL-17、CRP及WBC水平顯著高于COPD穩(wěn)定期組和正常對(duì)照組(P<0.05);COPD穩(wěn)定期組外周血Th17細(xì)胞、IL-17水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05),而CRP及WBC水平與正常對(duì)照組比較,無明顯差異,見表1及圖1。

表1 各組外周血Th17細(xì)胞及炎性因子水平(±s)

表1 各組外周血Th17細(xì)胞及炎性因子水平(±s)

注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與COPD穩(wěn)定期組比較,#P<0.05

組別例數(shù)Th17(%)IL-7(ng/L)CRP(mg/L)WBC(×109/L)500.9±0.26.2±2.25.2±1.65.1±0.3 COPD穩(wěn)定期1302.1±0.5*14.7±3.6*6.3±2.15.6±0.5 AECOPD1304.9±0.7*#37.7±8.2*#16.2±3.8*#7.9±0.8*#正常對(duì)照組

2 AECOPD組患者治療前后臨床指標(biāo)比較

經(jīng)過有效的治療后,AECOPD組患者外周血Th17細(xì)胞、IL-17、CRP及WBC水平均較治療前明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時(shí)治療后AECOPD組CAT評(píng)分也顯著低于治療前,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 AECOPD組患者治療前后外周血Th17、IL-17、CRP、WBC及CAT評(píng)分比較(±s)

表2 AECOPD組患者治療前后外周血Th17、IL-17、CRP、WBC及CAT評(píng)分比較(±s)

注:與治療前比較,*P<0.05

組別例數(shù)Th17(%)IL-17(ng/L)CRP(mg/L)WBC(×109/L)CAT(分)治療前1304.9±0.737.7±8.216.2±3.87.9±0.818.8±3.2治療后1301.6±0.4*12.7±4.2*6.1±1.8*5.4±0.5*6.9±1.6*

3 外周血Th17細(xì)胞水平與CAT評(píng)分、炎性因子(IL-17、CRP及WBC)的相關(guān)性分析

AECOPD組患者外周血Th17細(xì)胞水平與CAT評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.91,P<0.01),見圖2,即AECOPD患者外周血Th17細(xì)胞水平越高,CAT評(píng)分也相應(yīng)升高,病情越危重,生活質(zhì)量越差。外周血Th17細(xì)胞水平與炎性因子IL-17也呈正相關(guān)(r= 0.89,P<0.01),而AECOPD組患者外周血Th17細(xì)胞水平與CRP(r=0.084,P>0.05)、WBC(r= 0.063,P>0.05)水平無顯著相關(guān)性。

4 外周血Th17細(xì)胞水平在診斷AECOPD中的ROC曲線分析

通過ROC曲線分析顯示外周血Th17細(xì)胞水平的曲線下面積(AUC)為 0.868(95%CI 0.774~0.918),以外周血Th17細(xì)胞水平3.72作為臨界值時(shí),其診斷AECOPD的敏感性為88.6%,特異性為86.4%(圖3)。以CRP值13.5mg/L作為臨界值時(shí),其診斷AECOPD的敏感性為79.6%,特異性為75.3%,ROC曲線下面積為0.753(95%CI 0.692~0.789)。以WBC值6.94×109/L作為臨界值時(shí),其診斷AECOPD的敏感性為76.4%,特異性為74.5%,ROC曲線下面積為0.731(95%CI 0.672~0.764)。外周血Th17細(xì)胞水平對(duì)AECOPD診斷的精確率顯著高于CRP和WBC指標(biāo)。

討 論

大量的研究證實(shí),反復(fù)的氣道炎癥在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)著重要的作用[5]。AECOPD主要由細(xì)菌感染引起,中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的異?;罨荂OPD急性加重的關(guān)鍵因素[6]。細(xì)菌培養(yǎng)雖是診斷感染的金標(biāo)準(zhǔn),但陽性率低,同時(shí)病原菌分離耗時(shí)長,細(xì)菌與病毒等非典型病原體感染也難以區(qū)分。而WBC、CRP等指標(biāo),在AECOPD發(fā)生后出現(xiàn)的時(shí)間相對(duì)較晚,并且敏感性或特異性相對(duì)不佳,并不適合對(duì)其早期診斷[7]。因此,尋找快速、準(zhǔn)確的診斷AECOPD的生物學(xué)指標(biāo)已成為目前臨床研究的重點(diǎn)。

相關(guān)研究顯示,AECOPD患者小氣道壁及肺泡灌洗液中,中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯增加,并且其與AECOPD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[8]。隨著中性粒細(xì)胞的增加,氣道炎癥越顯著,相應(yīng)肺功能越差。是什么因素導(dǎo)致AECOPD患者中性粒細(xì)胞的大量活化與聚集,其具體的機(jī)制尚不完全清楚,但目前研究顯示可能與T淋巴細(xì)胞釋放的炎性趨化因子的作用有關(guān)。CD4+T是機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,根據(jù)CD4+T細(xì)胞分化功能可分為Th1、Th2、Th17及Treg等亞群[9]。Th17細(xì)胞可通過特異性分泌IL-17來募集中性粒細(xì)胞,從而進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。相關(guān)研究證實(shí),在自身免疫性疾病及炎癥性疾病中,其外周血中Th17細(xì)胞比例及IL-17明顯高于健康對(duì)照者,并且隨著疾病嚴(yán)重程度的加重,Th17細(xì)胞數(shù)量及IL-17水平也明顯增加[10]。IL-17作為重要的炎性細(xì)胞因子,其水平的增加可引起氣道上皮細(xì)胞釋放IL-6及IL-8等致炎因子及趨化因子的增加,從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集到肺部組織,引起炎癥的進(jìn)一步加重[11]。是否外周血Th17細(xì)胞水平可作為COPD急性加重的早期診斷標(biāo)志物,相關(guān)研究尚未闡明。本研究結(jié)果顯示,AECOPD患者外周血 Th17細(xì)胞水平較COPD穩(wěn)定期患者明顯升高,同時(shí)在經(jīng)過相應(yīng)治療后,外周血Th17細(xì)胞水平隨著病情的好轉(zhuǎn)明顯降低,表明外周血Th17細(xì)胞水平可能與 AECOPD的發(fā)生有關(guān),并在一定程度上可反映AECOPD的臨床治療效果。CAT評(píng)分可有效地反映COPD患者病情嚴(yán)重程度,是預(yù)測(cè)COPD急性加重的重要指標(biāo)[12]。通過相關(guān)性分析顯示,AECOPD外周血Th17細(xì)胞水平與CAT評(píng)分呈正相關(guān),即AECOPD患者外周血Th17細(xì)胞水平越高,CAT評(píng)分也越高,患者病情越危重,生活質(zhì)量也越差。AECOPD是何種機(jī)制導(dǎo)致外周血Th17細(xì)胞水平增加,目前并不完全清楚,但已有相關(guān)研究表明,外周血Th17細(xì)胞水平的升高與轉(zhuǎn)錄因子STAT3與IL-21啟動(dòng)子結(jié)合的增加有一定的關(guān)系[13]。相關(guān)研究表明,外周血Th17細(xì)胞水平較其他感染標(biāo)志物如CRP、WBC等更能準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)感染和炎癥水平[14]。本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果一致,AECOPD患者外周血Th17細(xì)胞水平ROC曲線下面積明顯高于傳統(tǒng)感染標(biāo)志物(CRP、WBC),同時(shí)敏感性為88.6%,特異性為86.4%,提示外周血Th17細(xì)胞水平可作為早期預(yù)測(cè)AECOPD的有效指標(biāo)。相關(guān)研究顯示,通過抑制感染性疾病患者外周血Th17細(xì)胞水平,可以顯著降低機(jī)體炎癥反應(yīng),改善患者臨床預(yù)后[15]。針對(duì)COPD患者,通過檢測(cè)其外周血Th17細(xì)胞水平,其不僅可作為早期預(yù)測(cè)COPD急性加重的有效指標(biāo),還可能為其治療提供新的靶點(diǎn)。

綜上所述,外周血 Th17細(xì)胞水平在 AECOPD患者中明顯升高,其可作為預(yù)測(cè)COPD急性加重的有效指標(biāo),從而為其早期防治提供臨床依據(jù)。但由于本研究COPD患者樣本量偏少,其預(yù)測(cè)和診斷效果還有待進(jìn)一步證實(shí)。下一步需要擴(kuò)大樣本量,采取多中心聯(lián)合的方式對(duì)外周血Th17細(xì)胞水平在預(yù)測(cè)COPD急性加重中的臨床價(jià)值方面做進(jìn)一步的研究。

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(李 凌編輯)

The Expression Levels and Clinical Value of Th17 Cells in Peripheral Blood in Patients w ith Acute Exacerbation of Chronic

Obstructive Pulmonary Disease LUO Cheng,YU Hao-yue,F(xiàn)ENG M ing-xia,CHEN Zhao-jun,HU Jia-yong
(Department of Respiratory,Daping Hospital&Institute of Surgery Research,The Third M ilitary Medical University,Chongqing,400042,China)

Objective To investigate the expression levels and clinical value of Th17 cells in peripheral blood in patients w ith acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease(AECOPD).M ethods We enrolled 260 chronic obstructive pulmonary disease(COPD)patients and 50 healthy subjects in the study.According to clinicalmanifestations,these patients were divided stable COPD group(130 cases)and AECOPD group(130 cases).The Th17 cells levels in peripheral blood were measured by flow cytometry.The levels of cytokines(IL-17)weremeasured by enzyme linked immunosorbentassay(ELISA),the levels of C-reactive protein(CRP)and white blood cell count(WBC)were detected,and COPD assessment test(CAT)score was analyzed.Results The Th17 cells levels,IL-17,CRP,WBC levels in AECOPD group were significantly higher than stable COPD groups and control groups(P<0.05).After appropriate treatment,the Th17 cellslevels,IL-17,CRP,WBC levels and CAT score were significant lower than before treatment(P<0.05). The correlation analysis showed that the Th17 cells levels in peripheral blood and CAT score(r=0.91,P<0.01)and IL-17(r=0.89,P<0.01)was positively correlated.However,the Th17 cells levels in peripheral blood and CRP(r=0.084,P>0.05)and WBC(r=0.063,P>0.05)had no significant correlation.The ROC curve analysis showed thatwhen Th17 cells levels(3.72)considered as the boundary for diagnosis of AECOPD,the sensitivity and specificity of diagnosis for AECOPD were 88.6%and 86.4%,the area under the ROC curve(AUC)was 0.868(95%CI 0.774-0.918),which was significantly greater than CRP and WBC index.Conclusion The expression of Th17 cells is higher in patients w ith AECOPD,which can be used as an effective indicator for predicting acute exacerbation of COPD.Therefore detection of Th-17 might have an important clinical application value.

Chronic obstructive pulmonary disease; Acute exacerbation; Th17 cells; Interleukin-17;Chronic obstructive pulmonary disease assessment test score

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.08.002

2016-02-22;

2016-03-21

胡佳勇。Email:hujiayongcq01@163.com

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