多麗娜 汪慧君 林志淼 楊勇

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科

·論著·

長(zhǎng)島型掌跖角化病二例SERPINB7基因突變研究

多麗娜 汪慧君 林志淼 楊勇

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科

目的 報(bào)告2例長(zhǎng)島型掌跖角化病，確定其致病基因突變。方法 收集患者及其父母外周血和臨床資料，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增SERPINB7基因8個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序以查找基因突變位點(diǎn)，并以200例無(wú)關(guān)健康人DNA作為對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。結(jié)果 2例患者均存在SERPINB7基因c.796C>T純合突變，導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)第266位氨基酸出現(xiàn)終止改變（p.R266*），其父母均為c.796C>T雜合突變，而無(wú)關(guān)健康對(duì)照未發(fā)現(xiàn)上述突變。結(jié)論 SERPINB7基因的c.796C>T突變可能是引起2例患者長(zhǎng)島型掌跖角化病的原因。

皮膚角化病，掌跖；皮膚表現(xiàn)；DNA突變分析；基因，SERPINB7；長(zhǎng)島型掌跖角化病

掌跖角化病（palmoplantar keratoderma,PPK）是一組復(fù)雜的以掌跖皮膚肥厚和過(guò)度角化為主要特征的先天性遺傳病，包括數(shù)十種不同亞型［1］。長(zhǎng)島型掌跖角化?。∟agashima-type palmoplantar keratosis,NPPK,OMIM 615598）屬于彌漫性非殘毀性掌跖角化病，是一種常染色體隱性遺傳病。最近，Kubo等［2］確定NPPK的致病基因?yàn)榫幋a絲氨酸蛋白酶抑制因子B亞型7的SERPINB7基因。目前已報(bào)道的NPPK患者主要來(lái)自日本，我們?cè)谂R床上收集到2例中國(guó)NPPK患者，并檢測(cè)其SERPINB7基因突變情況。

對(duì)象與方法

一、臨床資料

2例患者均為散發(fā)病例。例1女，24歲，出生時(shí)即出現(xiàn)掌跖部紅斑、脫屑，并逐漸加重?cái)U(kuò)展，累及手、足背部，伴輕度手、足多汗，反復(fù)出現(xiàn)趾間真菌感染。例2女，25歲，出生時(shí)出現(xiàn)掌跖部皮膚潮紅、角化，后出現(xiàn)皮膚增厚、脫屑，逐漸加重并進(jìn)展至手、足背部，伴有輕度手、足多汗及反復(fù)足癬、甲癬病史。體檢：2例患者均可見雙手掌、足底、指趾背部、手足背邊緣、指趾背側(cè)面、手腕內(nèi)側(cè)、踝及跟腱處有彌漫性紅斑伴角化及脫屑，角化處皮膚呈輕度增厚，角質(zhì)層略呈淡黃色，部分區(qū)域因多汗出現(xiàn)浸漬發(fā)白。例2肘部及膝部可見輕度紅斑及角化，足部數(shù)個(gè)趾甲遠(yuǎn)端變脆、分離，真菌鏡檢呈陽(yáng)性。2例患者手、足浸水?dāng)?shù)分鐘后角質(zhì)層均發(fā)生明顯變白伴輕度腫脹（圖1）。2例患者均未見毛發(fā)或牙齒異常。否認(rèn)家族史及父母近親婚育史。2例患者采用10%尿素和5%水楊酸軟膏外用，皮疹輕度緩解，停藥后很快復(fù)發(fā)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.外周血基因組DNA提?。罕狙芯拷?jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，患者及其家屬簽署知情同意書。取患者、父母和200例健康對(duì)照者的外周血4 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，用試劑盒提取基因組DNA（產(chǎn)自北京天根生化科技有限公司）。

2.PCR引物設(shè)計(jì)和合成：根據(jù)SERPINB7基因序列（來(lái)源于Ensembl網(wǎng)站，網(wǎng)址：http://www.ensembl.org/index.html），利用 Primer-BLAST 在線版（網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)8對(duì)特異性引物，覆蓋SERPINB7基因8個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列，引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

3.PCR反應(yīng)體系及條件：PCR反應(yīng)體系25μl，含基因組 DNA50ng，dNTPs0.4mmol/L，MgCl22.0mmol/L，上下游引物各10 μmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min后，94℃變性30 s，62℃退火30 s（每個(gè)循環(huán)依次降0.5℃），72℃延伸 45 s，10個(gè)循環(huán)；94℃變性 30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸9min，4℃保存。取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

4.PCR產(chǎn)物測(cè)序分析：所有PCR產(chǎn)物純化后送至北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序方法為Sanger雙脫氧鏈終止法（Sanger法）。測(cè)序結(jié)果采用Bioedit軟件與SERPINB7基因組序列進(jìn)行比對(duì)。

結(jié) 果

以患者的基因組DNA為模板，所有引物的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳均可見目標(biāo)條帶，產(chǎn)物切膠純化后測(cè)序，結(jié)果清晰無(wú)雜峰干擾。將所測(cè)得的序列與 Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ensembl.org/index.html）公布的正常序列進(jìn)行對(duì)比，得到如下結(jié)果：2例患者SERPINB7基因第8外顯子中第796位核苷酸（從cDNA編碼起始位點(diǎn)ATG算起）發(fā)生C→T純合突變（c.796C>T）（dbSNP:rs142859678），導(dǎo)致其編碼蛋白質(zhì)在第266位氨基酸出現(xiàn)終止改變（p.R266*），其父母均為c.796C>T突變攜帶者（圖2），無(wú)關(guān)正常對(duì)照未發(fā)現(xiàn)此突變。所有突變均由反向測(cè)序得到驗(yàn)證。

圖1 患者皮損表現(xiàn) 1A：例1手背與手掌交界處紅斑角化；1B：例2足背、足踝、跟腱處彌漫性紅斑及角化，部分趾甲變脆、增厚及遠(yuǎn)端分離；1C：例2肘部輕度紅斑及角化；1D：例2雙手掌彌漫性紅斑及角化，略呈淡黃色，遇水后角質(zhì)層發(fā)白，輕度腫脹（右手）

圖2 SERPINB7基因突變測(cè)序圖（箭頭指示突變位點(diǎn)） 2A：患者SERPINB7基因c.796C>T純合突變；2B：患者父母攜帶c.796C>T雜合突變；2C：無(wú)關(guān)正常對(duì)照測(cè)序結(jié)果

討 論

NPPK通常表現(xiàn)為出生時(shí)至3歲以內(nèi)出現(xiàn)掌跖部位彌漫性紅斑及角化，可累及手足背部、腕內(nèi)側(cè)、踝和跟腱部位，遇水后角化皮膚可出現(xiàn)發(fā)白改變［3-4］。皮疹穩(wěn)定，不隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)明顯進(jìn)展或加重?；颊叱０橛惺终坪妥愕锥嗪?，易伴發(fā)皮膚淺表真菌感染［3］。NPPK需要與Mal de Meleda掌跖角化病、Bothnia型掌跖角化病鑒別。Mal de Meleda同樣為常染色體隱性遺傳，但其掌跖角化為進(jìn)展性，隨年齡增長(zhǎng)逐漸加重，且角化通常更為嚴(yán)重，多伴有甲受累及口周、肛周的紅斑角化［4］；而Bothnia型掌跖角化病為常染色體顯性遺傳，盡管臨床表現(xiàn)與NPPK較為類似，但是Bothnia掌跖角化通常多汗更為嚴(yán)重，可伴有輕度甲改變，而且遇水后角質(zhì)發(fā)白及腫脹更迅速且更明顯［5-6］。

最近，Kubo等［2］對(duì)3例無(wú)關(guān)日本NPPK患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序分析，確定NPPK的致病基因?yàn)镾ERPINB7基因。通過(guò)Sanger測(cè)序，進(jìn)一步分析另外10例無(wú)關(guān)NPPK患者的SERPINB7基因外顯子序列，最終發(fā)現(xiàn)這13例患者中6例患者存在SERPINB7的c.796C＞T純合突變，另外7例患者為c.796C＞T雜合突變伴其他功能缺失性雜合突變。該作者通過(guò)千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（1 000 Genomes Project）中SERPINB7基因突變位點(diǎn)的分布情況分析，發(fā)現(xiàn)c.796C＞T（rs142859678）雜合突變?cè)谌毡竞椭袊?guó)的正常人群中攜帶頻率分別為2/89和6/197，然而該突變位點(diǎn)未見于千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中歐洲及其他非洲裔的正常人群。因此推斷，NPPK可能主要流行于亞洲，特別是日本和中國(guó)。SERPINB7基因編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子B亞型7，具有抑制絲氨酸蛋白酶的作用，可保護(hù)細(xì)胞免于蛋白酶介導(dǎo)的損傷［7］。SERPINB7分布于全身表皮，表達(dá)于顆粒層及角質(zhì)層［8］。SERPINB7的酶觸反應(yīng)中心位于第331～352位氨基酸，保持核心功能區(qū)的完整性是維持酶活性的基本條件［9］，因此發(fā)生于該催化區(qū)域之前的截短突變可以導(dǎo)致NPPK患者表皮內(nèi)顆粒層和角質(zhì)層SERPINB7蛋白酶活性抑制作用喪失，表皮內(nèi)SERPINB7的減少可使絲氨酸蛋白酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白降解合并角質(zhì)層結(jié)構(gòu)破壞，加速水分滲透到角質(zhì)層，從而引發(fā)一系列臨床表現(xiàn)［2］。

本研究組近期檢測(cè)了7例中國(guó)漢族NPPK患者的SERPINB7基因突變情況，發(fā)現(xiàn)4例患者帶有c.796C＞T純合突變，2例患者為c.796C＞T雜合突變同時(shí)伴其他功能缺失性雜合突變，1例患者為c.522-523insT純合突變，提示SERPINB7基因的c.796C＞T突變很可能是中國(guó)漢族NPPK患者最常見的致病性突變位點(diǎn)［10］。本研究中2例NPPK散發(fā)患者均為SERPINB7基因c.796C＞T純合突變所致，確定該突變位點(diǎn)可能是中國(guó)人NPPK最常見的突變位點(diǎn)。先前的研究證實(shí)，c.796C＞T突變存在祖先效應(yīng)（founder effect），即該位點(diǎn)很可能來(lái)源于中國(guó)漢族的某一共同祖先［10］，這對(duì)該病的快速診斷有非常重要的意義。由于正常漢族人群攜帶該雜合突變位點(diǎn)的比例高達(dá)3%，因此，在中國(guó)NPPK很可能是最常見的常染色體隱性遺傳性掌跖角化病之一。臨床上散發(fā)的、非殘毀性、彌漫性掌跖角化病患者需考慮NPPK的診斷，在進(jìn)行基因檢測(cè)確診時(shí)，可以優(yōu)先檢測(cè)SERPINB7基因c.796C＞T突變位點(diǎn)。此外，由于正常人群中攜帶SERPINB7基因致病性突變位點(diǎn)比率較高，因此進(jìn)行遺傳咨詢時(shí)，應(yīng)建議患者配偶也進(jìn)行相應(yīng)基因攜帶情況的排查。

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Mutation analysis of the SERPINB7 gene in two patients with Nagashima-type palmoplantar keratoderma

Duo Lina,Wang Huijun,Lin Zhimiao,Yang Yong

Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China

Objective To report two cases of Nagashima-type palmoplantar keratoderma（NPPK）,and to identify mutations in the SERPINB7 gene.Methods Clinical data were collected from two patients with NPPK and their parents,and peripheral blood samples were obtained from the two patients,their parents and 200 unrelated healthy controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples.PCR was performed to amplify 8 exons and their flanking sequences of the SERPINB7 gene followed by DNA sequencing.Results A homozygous mutation （c.796C>T）,which led to the formation of a premature termination codon at amino acid position 266 （p.R266*）,was identified in both of the two patients.However,the patients′healthy parents were heterozygous carriers of the mutation（c.796C>T）.No mutation was found in the unrelated healthy controls.Conclusion The mutation c.796C>T in the SERPINB7 gene may be responsible for NPPK in the two patients.

Keratoderma,palmoplantar;Skin manifestations；DNA mutational analysis;Genes,SERPINB7;Nagashima-type palmoplantar keratosis

Lin Zhimiao,Email:zhimiaolin@bjmu.edu.cn

林志淼，Email：zhimiaolin@bjmu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.007

北京市高等學(xué)校青年英才計(jì)劃項(xiàng)目（YETP0069）

Fund program:Beijing Higher Education Young Elite Teacher Project（YETP0069）

2015-05-04）

（本文編輯：尚淑賢）