閆 　 瑞，　周 廣 麒

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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添加前體物對蟲草素產(chǎn)量的影響及動力學(xué)特征

閆 瑞，周 廣 麒

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

研究腺苷等8種物質(zhì)對CordycepsmilitarisFFCC 5111液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素的影響，并考察了其發(fā)酵動力學(xué)特征。結(jié)果表明,添加腺苷、苯丙氨酸、腺嘌呤、甘氨酸和L-谷氨酰胺均可提高蟲草素產(chǎn)量，其中添加腺苷1.5 g/L的發(fā)酵液中蟲草素產(chǎn)量最大，為772.5 mg/L，是對照組的9.39倍。在50 L發(fā)酵罐中，添加1.5 g/L腺苷的麥芽汁培養(yǎng)基進行分批發(fā)酵，建立動力學(xué)模型，其擬合值與實驗值的相對誤差小于8%，能良好地反映C.militarisFFCC 5111在補加腺苷的麥芽汁培養(yǎng)基中的發(fā)酵動力學(xué)特征。

蛹蟲草；蟲草素；腺苷；動力學(xué)

0　引　言

蟲草素是蛹蟲草產(chǎn)生的一種重要次級代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗癌和提高人體免疫力等藥理功能[1]。采用液體深層發(fā)酵方法培養(yǎng)蛹蟲草具有生產(chǎn)周期短、蟲草素含量高等特點，是工業(yè)化生產(chǎn)蟲草素的有效手段[2]。目前在液體深層培養(yǎng)過程中，許多研究者通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件[3]、添加前體物質(zhì)[4]、菌株誘變[5]等方法以提高蟲草素產(chǎn)量，但使用的培養(yǎng)基多以化學(xué)試劑為主[6]，不利于食品加工中的應(yīng)用。目前國內(nèi)尚無利用天然培養(yǎng)基通過優(yōu)化補料方式提高蟲草素產(chǎn)量方面的文獻報道。本研究以蛹蟲草菌株為研究對象，利用谷物原料發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素，保證了發(fā)酵產(chǎn)物在食品開發(fā)中的安全性[7]。通過液體發(fā)酵篩選生長因子，建立蟲草素分批發(fā)酵動力學(xué)模型，對蛹蟲草發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素的條件進行優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

CordycepsmilitarisFFCC 5111，由大連工業(yè)大學(xué)食品和發(fā)酵菌種培養(yǎng)中心提供。

1.1.2培養(yǎng)基及配方

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

基本培養(yǎng)基：12°麥芽汁培養(yǎng)基；制作方法：干燥麥芽→粉碎→加4倍體積水→52 ℃保溫80 min→65 ℃保溫糖化，至碘色反應(yīng)不變色→煮沸→過濾→調(diào)糖度至12 °Bx。

1.2方法

1.2.1不同添加物對蟲草素生成的影響

分別向裝有100 mL基本培養(yǎng)基的三角瓶中添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L的腺嘌呤、腺苷、次黃嘌呤、苯丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸及L-谷氨酰胺，并將蛹蟲草種子液分別接種到不同添加物的基本培養(yǎng)基中，于25 ℃下培養(yǎng)20 d，測定蟲草素含量。

1.2.2動力學(xué)實驗

在50 L通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐中，將種子液接種到含有腺苷1.5 g/L的基本培養(yǎng)基中，裝液量為60%，培養(yǎng)溫度為25 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min，通氣量為0.6 m3/h，培養(yǎng)20 d，每2 d 取樣檢測。

1.3檢測方法

1.3.1菌體質(zhì)量濃度

取一定量發(fā)酵液，4 500 r/min離心20 min，棄上清液，再加去離子水洗滌，離心2次，獲沉淀放入干燥潔凈已知質(zhì)量的培養(yǎng)皿中，80 ℃烘干至恒重。

式中：ρ為菌體質(zhì)量濃度，g/L；m為菌體干重，g；V為發(fā)酵液體積，mL。

1.3.2蟲草素及腺苷含量

樣品前處理：取一定量發(fā)酵液，4 500 r/min離心20 min，收集上清液，濃縮，并加入3倍體積95%乙醇，4 ℃靜置10 h，再經(jīng)11 000 r/min、4 ℃下離心15 min，取上清液，濃縮后定容。0.22 μm濾膜過濾，按設(shè)置好的色譜條件進樣。

高效液相色譜條件：流動相A，磷酸鹽溶液(20 mmol/L NaH2PO4和Na2HPO4，pH=6.89)；流動相B，色譜純-甲醇溶液；梯度洗脫。體積流量，0.8 mL/min；進樣量，10 μL；柱溫，30 ℃；檢測波長，260 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1添加物對蟲草素生成的影響

陳長蘭等[8]在液體搖瓶培養(yǎng)中分別添加20種不同的氨基酸，證明所有氨基酸都有增加蟲草素含量的作用，且不同菌株間存在差異。荊留萍等[9]和文庭池等[10]分別比較了不同核苷、堿基及氨基酸對蟲草素產(chǎn)量的影響，分別發(fā)現(xiàn)腺苷或腺嘌呤為最佳添加物，最適添加量為4或8 g/L?？梢娨蛴枷x草菌株的不同，添加物的種類和添加量對蟲草素產(chǎn)量表現(xiàn)出不同的影響。本實驗根據(jù)添加物化學(xué)組分，比較了8種化合物對生成蟲草素的影響，結(jié)果見表1。

表1不同營養(yǎng)物及質(zhì)量濃度對培養(yǎng)基中蟲草素產(chǎn)量的影響

Tab.1Effectsofdifferentadditivesandconcentrationsoncordycepinproduction

添加物ρ/(g·L-1)00.51.01.52.02.53.0腺嘌呤82.392.799.8103.5100.990.686.2腺苷82.3465.8669.8772.5768.6731.3745.8次黃嘌呤82.349.952.559.364.158.444.4苯丙氨酸82.3443.0481.1501.3612.5661.7626.2天冬氨酸82.323.319.821.114.711.79.2甘氨酸82.3100.5121.0128.6143.1149.6132.4甲硫氨酸82.324.627.122.313.610.512.3L-谷氨酰胺82.382.1107.4151.2167.3174.0172.4

由表1可見，添加苯丙氨酸、腺苷、腺嘌呤、甘氨酸和L-谷氨酰胺對蟲草素產(chǎn)量均有促進作用，其中苯丙氨酸和腺苷效果最為明顯。在各組中，添加苯丙氨酸和腺苷的實驗組蟲草素產(chǎn)量均高于其他組，其中腺苷添加量為1.5 g/L時，蟲草素產(chǎn)量達到最大，是對照組的9.39倍。添加次黃嘌呤、天冬氨酸及甲硫氨酸的實驗組結(jié)果低于對照組。除天冬氨酸外，均表現(xiàn)出隨添加物質(zhì)量濃度的增大，蟲草素產(chǎn)量先升后降的趨勢。腺嘌呤在各個質(zhì)量濃度范圍對蟲草素產(chǎn)量均無顯著影響。

2.2蟲草素分批發(fā)酵過程動力學(xué)特征

2.2.1動力學(xué)特征

添加1.5 g/L腺苷的12 °Bx麥芽汁為培養(yǎng)基，在50 L發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵。根據(jù)分批發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)繪制發(fā)酵過程曲線，并得到每個時間間隔的菌體平均比生長速率、蟲草素平均比生成速率和腺苷平均比消耗速率及它們的擬合曲線，分別如圖1～3所示。比速率曲線擬合的結(jié)果均在95%置信區(qū)間內(nèi)。

從圖1可知，延滯期為0～2 d，對數(shù)生長期為2～12 d，穩(wěn)定期在14 d之后；菌體比生長速率在2 d時達到最大，為0.542 d-1，之后隨時間逐漸減小，當(dāng)發(fā)酵進行到14 d時，比生長速率出現(xiàn)負值，基本保持不變，表示菌體量呈現(xiàn)負增長。

圖1菌體生長動力學(xué)擬合曲線及比生長速率曲線

Fig.1ComparisonofkineticmodelwithbiomassandchangingofthegrowthrateduringsubmergedfermentationofC. militaris

由圖2可以看出，在延滯期和對數(shù)生長中前期，蟲草素生成很少，隨著發(fā)酵時間的延長，生成速率迅速增大；蟲草素比生成速率從發(fā)酵開始隨時間上升，在10～20d達到穩(wěn)定，比生成速率在1.75～2.02mg/(g·d)；蟲草素產(chǎn)量在20d時達到最大值625.1mg/L，但與搖瓶實驗結(jié)果相比，下降了19.1%。

圖2蟲草素生成動力學(xué)擬合曲線及蟲草素比生成速率曲線

Fig.2ComparisonofkineticmodelwithcordycepinproductionandchangingofthecordycepinproductionrateduringsubmergedfermentationofC. militaris

由圖3可以看出，發(fā)酵液中腺苷質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時間逐漸降低；腺苷比消耗速率在6d達到最大，之后隨發(fā)酵時間不斷下降，在14d趨于穩(wěn)定，此時腺苷的產(chǎn)生和消耗達到動態(tài)平衡。

圖3　腺苷質(zhì)量濃度及腺苷比消耗速率曲線

Fig.3Changing of the adenosine concentration and consumption rate during submerged fermentation ofC.militaris

2.2.2菌體生長動力學(xué)模型

采用Logistic方程描述C. militarisFFCC5111菌體生長動力學(xué)模型[11]，它是典型的S形曲線，能真實反映分批發(fā)酵過程中因菌體增加而抑制自身生長的作用，對擬合菌體生長過程具有廣泛的適用性。Logistic方程為

(1)

對Logistic方程進行積分得，

(2)

式中：cx為菌體濃度；初始條件t=0時，cx=cx,0；cx,max為菌體的最大濃度；μmax為最大比生長速率；t為發(fā)酵時間。

以lncx-t作圖，確定對數(shù)生長期為t=2～10 d。在對數(shù)生長期，以ln (cx/(cx,max-cx))-t作圖，進行線性擬合，所得直線斜率即為μmax，得μmax=0.590 1，作為模型擬合的初始值。

2.2.3產(chǎn)物生成動力學(xué)模型

根據(jù)Luedeking-Piret方程

(3)

并由圖1、2可知，C.militarisFFCC 5111蟲草素的生成與菌體的生長無直接相關(guān)性，屬于非生長偶聯(lián)型[12]。因此，蟲草素生成動力學(xué)模型可簡化為

(4)

式中：cp為產(chǎn)物濃度；當(dāng)t=0時，cp=cp,0；β為產(chǎn)物動力學(xué)模型參數(shù)，隨發(fā)酵條件的變化而不同。

2.2.4動力學(xué)模型擬合及適用性

應(yīng)用MATLAB軟件的模型擬合工具包對實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合。微分方程組采用四階Runge-Kutta法求解，模型參數(shù)優(yōu)化采用全局性收斂的經(jīng)Levenberg-Marquart修正的高斯-牛頓法，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)和模型參數(shù)的初估值，以誤差平方和最小為目標(biāo)，獲得全局性收斂的最優(yōu)化參數(shù)估計值。求得分批發(fā)酵動力學(xué)模型參數(shù)μmax=0.574 4，β=1.863 4，擬合曲線見圖1、2。

為驗證模型的可靠性，根據(jù)所建立發(fā)酵動力學(xué)模型，可得分批發(fā)酵過程中菌體質(zhì)量濃度及蟲草素質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時間變化的擬合值，進而計算出實測值與擬合值之間的相對誤差，結(jié)果如表2所示。

表2菌體及蟲草素質(zhì)量濃度模型的擬合值與實驗值對比

Tab.2Comparisonbetweenexperimentalandcalculateddataofcellandcordycepinconcentration

t/d菌體質(zhì)量濃度/(g·L-1)蟲草素質(zhì)量濃度/(mg·L-1)擬合值實驗值R/%擬合值實驗值R/%00.150.1500.010.01020.470.507.370.210.205.0041.431.536.541.511.605.6364.104.314.997.287.072.97810.0510.514.4231.4230.104.391018.6419.614.9592.1789.013.551225.6127.015.19175.71177.851.211429.0731.016.27278.53279.490.351630.3729.871.68389.67395.691.521830.8029.633.96503.83516.062.372030.9429.275.72618.94625.100.99

由表2可知，除發(fā)酵初期各模型的誤差值較高外，其他時期擬合值與實驗值的誤差相對較小，均在8%以內(nèi)，說明所建數(shù)學(xué)模型能較好地反映C.militarisFFCC 5111在補加腺苷的天然培養(yǎng)基中的發(fā)酵動力學(xué)特征。

3　結(jié)　論

通過對8種供試前體及營養(yǎng)物的篩選，確定可有效提高C.militarisFFCC 5111胞外蟲草素產(chǎn)量的5種物質(zhì)，分別是苯丙氨酸、腺苷、腺嘌呤、甘氨酸和L-谷氨酰胺，其中添加1.5 g/L腺苷，蟲草素產(chǎn)量達到最大，為772.5 mg/L。根據(jù)對實驗結(jié)果及腺苷化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析，可以看出腺苷與蟲草素化學(xué)結(jié)構(gòu)十分相似，能迅速被蛹蟲草吸收和轉(zhuǎn)化。

對C.militarisFFCC 5111分批發(fā)酵動力學(xué)特征進行分析，確定蟲草素生成與菌體生長呈非偶聯(lián)型，并采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程建立蟲草素分批發(fā)酵動力學(xué)模型，所建模型能較好地映分批發(fā)酵過程中菌體生長及產(chǎn)物生成隨時間變化的關(guān)系。

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Effects of additives on cordycepin production and kinetics models of batch fermentation byCordycepsmilitaris

YANRui,ZHOUGuangqi

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

TheeffectsofdifferentadditivesoncordycepinproductionbysubmergedcultureofCordyceps militarisFFCC5111wereinvestigated.Theresultindicatedthattheadditivesofadenosine,phenylalanine,adenine,glycineandL-glutaminecouldresultinalargeimprovementincordycepinproductionbysubmergedfermentationofC. militaris,especiallyadding1.5g/Ladenosine,whichcouldresultinthehighestcordycepinproductionof772.5mg/L,exhibitinga9.39-foldincreasethanthatobtainedinthebasalmediumculture.Adding1.5g/Ladenosineasamediumina50Lbatchsystem,thekineticmodelforC. militarisFFCC5111wasbasedontheLogisticandLuedeking-Piretequationsforcellgrowthandproductformation.Therelativeerrorbetweentheexperimentalvalueandfittedvaluewaslessthan8%,indicatingthatthemodelcouldreflectthekineticsfeatureofbatchfermentationofC. militarisFFCC5111inmaltosemediumsupplementedwithadenosine.

Cordycepmilitaris; cordycepin; adenosine; kinetics

2015-03-04.

遼寧省高校創(chuàng)新團隊支持計劃項目(LN2012011).

閆 瑞(1989-)，男，碩士研究生；通信作者：周廣麒(1957-)，男，教授.

TS218；Q939.97

A

1674-1404(2016)05-0321-04

閆瑞,周廣麒.添加前體物對蟲草素產(chǎn)量的影響及動力學(xué)特征[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,35(5):321-324.

YAN Rui, ZHOU Guangqi. Effects of additives on cordycepin production and kinetics models of batch fermentation byCordycepsmilitaris[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(5): 321-324.