曹 文 博，　鄭 秋 月，　張 公 亮，　侯 紅 漫

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連　116034；2.遼寧出入境檢驗檢疫局， 遼寧 大連　116001 )

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凍干奶粉樣品中大腸桿菌O157和O111的檢測方法

曹 文 博1，鄭 秋 月2，張 公 亮1，侯 紅 漫1

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連116034；2.遼寧出入境檢驗檢疫局， 遼寧 大連116001 )

應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)建立一種檢測凍干奶粉樣品中大腸桿菌的方法。通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法將大腸桿菌O157和O111分離純化，根據(jù)大腸桿菌O157和O111的兩對特異性基因rfbE和wbdl設(shè)計引物和探針，進(jìn)行RT-PCR檢測；由于該大腸桿菌可能是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌，對STEC的特異性毒力基因stx1、stx2b、eae設(shè)計引物和探針并檢測。結(jié)果表明,該凍干奶粉樣品中含有大腸桿菌O157和O111，且致病菌O157檢出毒力基因stx1、stx2b、eae，即產(chǎn)志賀毒素與黏附素，致病菌O111檢出毒力基因eae，不產(chǎn)志賀毒素而產(chǎn)黏附素。該方法能準(zhǔn)確分離大腸桿菌O157和O111，利用實時熒光PCR的高靈敏度和特異性快速檢驗致病菌及其特異性毒力基因。

大腸桿菌O157；大腸桿菌O111；實時熒光PCR；凍干奶粉

0　引　言

腸出血性大腸桿菌(EHEC) O157能產(chǎn)生致死性志賀毒素(Shiga toxin, Stx)，1982年被確認(rèn)為嚴(yán)重致病菌。O157型是STEC中致病力最強、流行趨勢最廣及發(fā)病率最高的血清型，感染100 CFU O157 STEC就能致病，病患接觸者也能引起繼發(fā)感染，可引起人類腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis, HC)，溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome, HUS)，甚至死亡[1]。近年來，非O157型STEC中一些高致病力菌株對人類的健康也存在嚴(yán)重威脅，多達(dá)200多種的非O157菌株與人類疾病相關(guān)，如O111、O26、O45、O103等[2]。目前世界范圍內(nèi)對STEC仍缺乏有效的控制手段[3-4]。

對食源性致病菌大腸桿菌的檢測未達(dá)到分型，檢測后對致病菌的產(chǎn)毒情況缺乏了解，這給公共食品衛(wèi)生和人類生命安全帶來了極大的威脅。本研究將傳統(tǒng)培養(yǎng)法與實時熒光PCR結(jié)合，利用3M紙片法初步判斷樣品中含有大腸桿菌，經(jīng)分離純化，以特異基因rfbE、wbdl[5]和STEC特異性毒力基因stx1、stx2b、eae作為大腸桿菌O157和O111檢測的靶基因[6]，應(yīng)用RT-PCR建立一種檢測凍干奶粉樣品中的大腸桿菌及其毒力因子的方法。

1　材料與方法

1.1材料

NB營養(yǎng)肉湯、TSB胰蛋白胨大豆肉湯、EMB瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、TSI三糖鐵瓊脂，英國OXOID 公司；3M PetrifilmTME.coli紙片，美國3M公司；O157顯色培養(yǎng)基，上海欣中生物工程有限公司；O157、O111診斷血清，丹麥國家血清研究公司；TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0(Code：DV810A)、引物、Taqman探針，大連寶生物公司。熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.2方法

1.2.1菌種的分離

挑取藍(lán)色帶有氣泡的單菌落進(jìn)行血清鑒定，經(jīng)鑒定后的單菌落劃線接種于EMB、O157顯色培養(yǎng)基，于(36±1) ℃下過夜培養(yǎng)，觀察菌落特征，挑取O157顯色培養(yǎng)基上的單菌落接種于普通肉湯過夜培養(yǎng)，待提取DNA。

1.2.2細(xì)菌DNA的提取

取4 mL單菌落的肉湯培養(yǎng)基于100 ℃下煮沸15 min滅活，用試劑盒提取細(xì)菌DNA。

1.2.3引物與Taqman探針

根據(jù)大腸桿菌O157和O111的特異性基因rfbE和wbdl，以及STEC的特異性毒力基因stx1、stx2b、eae為靶基因設(shè)計引物探針，如表1、2所示。

1.2.4熒光PCR的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系為25 μL，含Premix Ex TaqTM12.5 μL， Rox Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，上下游引物、探針各1 μL，ddH2O 8 μL，模板2 μL。采用兩步法PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共運行40個循環(huán)，并于60 ℃ 收集熒光進(jìn)行檢測，設(shè)陰性菌及水對照檢驗特異性[7-8]。

表1　大腸桿菌O157和O111的特異性基因rfbE、wbdl引物和探針序列

表2　產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的毒力基因stx1、stx2b、eae引物和探針序列

2　結(jié)果與討論

2.1菌種的培養(yǎng)、分離與純化

奶粉樣品在TSB肉湯混濁生長；3M PetrifilmTME.coli紙片出現(xiàn)藍(lán)色帶有氣泡單菌落，為大腸桿菌，結(jié)果如圖1所示。O157與O111血清試驗?zāi)?；EMB瓊脂培養(yǎng)出典型的具有金屬光澤的深紫色菌落；O157顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)出圓形、較小、淡紫色菌落為大腸桿菌O157，培養(yǎng)出圓形、藍(lán)色單菌落為大腸桿菌O111，結(jié)果見圖2、3。

(a) 稀釋度10-7　(b) 稀釋度10-8

(a) 瓊脂培養(yǎng)基　(b) 顯色培養(yǎng)基

圖2大腸桿菌O157在EMB瓊脂和顯色培養(yǎng)基上的生長情況

Fig.2GrowthofE.coliO157onEMBagarandchromogenicagar

2.2熒光PCR鑒定結(jié)果

E.coliO157中rfbE基因檢測結(jié)果為陽性，stx1、stx2b、eae基因檢測結(jié)果均為陽性，Ct均小于35，表明凍干奶粉樣品中含有產(chǎn)志賀毒素且產(chǎn)黏附素的大腸桿菌O157型；E.coliO111中wbdl 基因檢測結(jié)果為陽性，eae基因檢測結(jié)果為陽性，Ct均小于35，其余為陰性，無擴(kuò)增曲線，表明奶粉樣品中含有不產(chǎn)志賀毒素、產(chǎn)黏附素的大腸桿菌O111型[9-10]，結(jié)果如表3所示。

(a) 瓊脂培養(yǎng)基　(b) 顯色培養(yǎng)基

圖3大腸桿菌O111在EMB瓊脂和顯色培養(yǎng)基上的生長情況

Fig.3GrowthofE.coliO111onEMBagarandchromogenicagar

表3凍干奶粉中大腸桿菌O157與O111的熒光PCR鑒定結(jié)果

Tab.3RT-PCRidentificationresultofE.coliO157andO111

基因CtO157O111O157rfbE17.8O111wbdl19.3志賀毒素stx126.7—stx2b19.7—黏附素eae19.218.1注:Ct≥40,可判定樣品結(jié)果為陰性,未檢出致病菌;Ct≤35.0,可判定該樣品結(jié)果為陽性?！啊贝砦礄z測出。

熒光PCR擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，峰值較高，陰性菌及空白對照的檢測結(jié)果均為陰性，結(jié)果如圖4、5所示。

圖4　大腸桿菌O157熒光PCR擴(kuò)增曲線

圖5　大腸桿菌O111熒光PCR擴(kuò)增曲線

3　結(jié)　論

本實驗將傳統(tǒng)培養(yǎng)法與實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合，利用3M EC紙片法初步判斷樣品中含有大腸桿菌，通過血清學(xué)鑒定以及菌落特征的差異將兩種致病菌分離純化，以特異基因rfbE和wbdl及STEC特異性毒力基因stx1、stx2b、eae作為大腸桿菌O157和O111檢測的靶基因，設(shè)計引物、探針，檢測凍干奶粉樣品中的大腸桿菌，并研究致病菌的產(chǎn)毒情況。結(jié)果表明，實時熒光PCR擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，Ct均小于35，凍干奶粉樣品中含有E.coliO157和O111，E.coliO157產(chǎn)志賀毒素與黏附素，E.coliO111不產(chǎn)志賀毒素而產(chǎn)黏附素。

僅依靠傳統(tǒng)培養(yǎng)方法可以檢測出大腸桿菌，卻無法進(jìn)一步對該致病菌的攜帶毒素情況以及危害能力進(jìn)行檢測。目前世界范圍內(nèi)對STEC仍缺乏有效的控制手段，STEC致病能力很強，是一類危害嚴(yán)重的食源性病原菌，攜帶志賀毒素(stx1、stx2)基因是其共有的一個特征，該基因是疾病最終發(fā)展成為溶血性尿毒綜合征HUS的關(guān)鍵因素，緊密黏附素eae可與stx1/stx2相互作用導(dǎo)致腎臟損傷。本實驗所設(shè)計的引物、探針用于實時熒光PCR，Ct平均值為20，較其他相比敏感性有較大提高，具有廣闊的應(yīng)用前景和較強的實際應(yīng)用價值，為STEC的檢測和攜帶毒素情況及其致病情況的研究提供了一種有效的檢測方法[9,11]。產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌的流行情況及各個毒力因子的致病作用，對食品衛(wèi)生公共安全有著重要的意義，STEC對人類的危害不容忽視。

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Detection method forEscherichiacoliO157 and O111 in lyophilized milk powder

CAOWenbo1,ZHENGQiuyue2,ZHANGGongliang1,HOUHongman1

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116001, China )

TherealtimefluorescencePCRwasappliedtoestablishadetectionmethodforEscherichia coliO157andO111inlyophilizedmilkpowder. E. coliO157andO111wereisolatedandpurifiedthroughtraditionalculturemethod,andtheprimersandprobesweredesignedbasedontherfbEgeneandwbdlgeneofE. coliO157andO111.ConsideringthepossibilityofSTEC,theprimersandprobesweredesignedbasedonthetoxingenesstx1, stx2b, eaeandthegenesweredetectedbyRT-PCR.TheresultsshowedthatlyophilizedmilkpowderwascontaminatedbyE. coliO157andO111. Stx1andstx2bgenesweredetectedinE. coliO157whichcouldproduceShigatoxinandadhesin,whiletheeaegenewasdetectedinE. coliO111whichcouldproduceadhesin. E. coliO157andO111couldbeseparatedaccuratelybyRT-PCRmethod,indicatingthemethodcouldbeusedinquicklydetectingforthepathogensandtoxingenesinhighsensitivityandspecificity.

EscherichiacoliO157;EscherichiacoliO111; real-time PCR; lyophilized milk powder

2015-03-06.

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(201210043).

曹文博(1991-)，女，碩士研究生；通信作者：張公亮(1978-)，男，副教授.

TS207.4

A

1674-1404(2016)05-0317-04

曹文博,鄭秋月,張公亮,侯紅漫.凍干奶粉樣品中大腸桿菌O157和O111的檢測方法[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,35(5):317-320.

CAO Wenbo, ZHENG Qiuyue, ZHANG Gongliang, HOU Hongman. Detection method forEscherichiacoliO157 and O111 in lyophilized milk powder[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(5): 317-320.