昌睿杰 ，姚雪芹 ，蒙臣 ，陸江 ，李清

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰　442000；2.湖北醫(yī)藥學院麻醉學研究所，湖北 十堰　442000)

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不同濃度瑞芬太尼對新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞內(nèi)鈣濃度及細胞凋亡的影響

昌睿杰1,2，姚雪芹1,2，蒙臣1,2，陸江2，李清1,2

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學院麻醉學研究所，湖北 十堰442000)

目的探討不同濃度瑞芬太尼對新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞凋亡及細胞內(nèi)鈣濃度的影響。方法采用已建立的新生SD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞單細胞克隆系細胞株，將5×108個·L-1活細胞的密度均勻地接種到的12孔培養(yǎng)板中，每孔加入1 mL含有10%胎牛血清的DMEM/F12的培養(yǎng)基，放入溫度37℃、5%濃度CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，鏡下觀察細胞球貼壁后，每孔分別加入生理鹽水或不同濃度的瑞芬太尼(R)，分為以下4組：(1)對照組，每孔加入生理鹽水；(2)低濃度組，每孔加入瑞芬太尼5 μg·L-1，即R5組；(3)中濃度組，每孔加入瑞芬太尼10 μg·L-1，即R10組；(4)高濃度組，每孔加入瑞芬太尼20 μg·L-1，即R20組。每組重復4次。加藥后培養(yǎng)300、600、900 s用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測各組神經(jīng)干細胞內(nèi)游離鈣濃度的動態(tài)變化，24 h后流式細胞儀檢測各組神經(jīng)干細胞的凋亡情況。結果(1)各組細胞內(nèi)鈣濃度變化情況：與對照組比較，R5組細胞內(nèi)鈣濃度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；R10、R20組細胞內(nèi)鈣濃度明顯升高(其中R10組P<0.05 ，R20組P<0.01)。(2)各組神經(jīng)干細胞凋亡變化情況：與對照組比較，R5組神經(jīng)干細胞凋亡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；R10、R20組神經(jīng)干細胞凋亡明顯升高(其中R10組P<0.05 ，R20組P<0.01)。結論低濃度的臨床有效血藥濃度的瑞芬太尼對新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞內(nèi)鈣濃度、細胞凋亡沒有影響，中高濃度的臨床有效血藥濃度的瑞芬太尼應用使細胞內(nèi)鈣濃度顯著升高，從而誘發(fā)細胞大量凋亡。

瑞芬太尼;海馬;神經(jīng)干細胞;細胞凋亡;鈣;大鼠,Sprague-Dawley

隨著現(xiàn)在小兒(新生兒和嬰幼兒)手術的開展越來越廣泛，全麻藥物瑞芬太尼在小兒手術的應用日益普遍，“瑞芬太尼是否影響小兒腦發(fā)育”逐漸成為麻醉關注的熱點[1]。神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其與腦發(fā)育密切相關。瑞芬太尼的鎮(zhèn)痛作用主要集中在中樞的邊緣系統(tǒng)，其臨床推薦使用劑量范圍廣[2]，其有效血藥濃度為1～20 μg·L-1，瑞芬太尼對小兒神經(jīng)發(fā)育的影響目前尚不清楚。本實驗擬觀察不同臨床有效血藥濃度的瑞芬太尼對新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化及其存活、凋亡的影響,探討小兒臨床麻醉用藥的安全性、合理性。

1　材料與方法

1.1細胞株接種(1)采用湖北醫(yī)藥學院麻醉學研究所提供的新生SD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞單細胞克隆系細胞株的細胞球懸液吸入30 mL滅菌離心管中加蓋直立靜放10 min。(2)待細胞球完全下沉至管底后(必要時離心)，輕輕吸去4/5上清液，加入神經(jīng)干培養(yǎng)液定容至10 mL，用毛細吸管輕輕吹打神經(jīng)球機械分離克隆，相差顯微鏡下觀察制備成單細胞或多細胞球懸液。(3)用臺盼藍染色后進行細胞計數(shù)， 5×108個·L-1活細胞的密度接種于不放蓋玻片多聚賴氨酸包被的12孔培養(yǎng)板中，每孔加1.0 mL含 10%胎牛血清+DMEM/F12誘導分化的培養(yǎng)基，放入5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育使細胞貼壁。

1.2藥物處理與分組(1)上述細胞孵育6～8 h鏡下觀察完全貼壁后，分隨機組后每孔加入不同藥物處理(對照組記為C，低濃度瑞芬太尼記為R5，低濃度瑞芬太尼記為R10，低濃度瑞芬太尼記為R20)。(2)分為4組(每組3孔細胞)：C組：加入生理鹽水；R1組:加入瑞芬太尼5 μg·L-1;R2組:加入瑞芬太尼10 μg·L-1;R3組:加入瑞芬太尼20 μg·L-1。

1.3指標檢測

1.3.1激光掃描共聚焦技術(LSCM) 檢測神經(jīng)細胞內(nèi)內(nèi)Ca2+濃度的動態(tài)變化

(1) NSCs于室溫下培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，用Lock’s 液洗二遍，加入100 μL Lock’s 液(含5 μmol ·L-1的Fluo-3 /AM 存儲液，F(xiàn)luo-3 /AM 為可以穿透細胞膜的高親鈣熒光染料)。(2)NSCs置于細胞培養(yǎng)箱中孵育45 min后吸去熒光染料，用Lock’s液洗2遍，每孔加入100 μL的Lock’s液后使用激光掃描共聚焦顯微鏡對細胞進行掃描。掃描開始3 min后，分別使用10 μL的生理鹽水和5、10、20 μg·L-1的瑞芬太尼處理NSCs。每隔10 s掃描一次，持續(xù)15 min。(3)將所得熒光圖像用Leica SP2 Confocal 軟件進行分析。掃描30個未經(jīng)處理NSCs，統(tǒng)計其細胞內(nèi)Ca2+熒光信號強度平均值作為基礎值并設置為1，將藥物處理后300、600、900 s的細胞內(nèi)Ca2+熒光信號強度與基礎值進行比較。

1.3.2流式細胞技術檢測細胞凋亡[3]

細胞按上述分組加藥，培養(yǎng)30 min后按以下步驟進行：(1)吸去培養(yǎng)孔培養(yǎng)液，先用PBS緩沖液清洗2次，用0.125%胰酶消化細胞5 min；(2)鏡下觀察細胞松動收縮或懸浮變圓后，用無鈣PBS緩沖液終止消化，輕輕吹打成細胞懸液；(3)500 r·min-1低速離心5 min后吸除上清液，再無鈣PBS緩沖液清洗2次；(4)收集上述處理各組細胞于無鈣PBS中重懸，并將調(diào)整細胞密度為5×108個·L-1；(5)分別取上述各組細胞懸液1ml于對應編號的小試管中，在避光環(huán)境里分別加入終濃度Fluo2-AM 10 μmol·L-1，在CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h(避光，37 ℃)并間斷輕輕振蕩幾次；(6)取出上述染色后各組細胞懸液再離心，用無鈣PBS緩沖液清洗3次以去除多余的染料；(7)再用無鈣PBS緩沖液重懸上述各組細胞至1 mL，按分組于流式細胞儀上進行檢測，設置發(fā)射波長為526 nm，激發(fā)波長為506 nm；隨機取1萬個細胞測定每個細胞熒光強度值，其各組測定值為熒光強度值的平均值。

表1　不同濃度瑞芬太尼對NSCs內(nèi)Ca2+水平的影響

注：a表示與Ca2+基礎水平比較；b表示與相同時間點的對照組比較。

2　 結果

2.1各組細胞內(nèi)鈣濃度變化情況由表1可見：與C組比較，R5組細胞內(nèi)鈣濃度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；R10、R20組細胞內(nèi)鈣濃度明顯升高(其中R10組P<0.05 ，R20組P<0.01)。

2.2各組神經(jīng)干細胞凋亡變化情況見圖1，與C組比較，R5組神經(jīng)干細胞凋亡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；R10、R20組神經(jīng)干細胞凋亡明顯升高(其中R10組P<0.05 ，R20組P<0.01)。

NSCs經(jīng)生理鹽水(A，Control)及5 μg·L-1(B，R5)、10 μg·L-1(C，R10)、20 μg·L-1(D，R20)的瑞芬太尼處理24 h,使用Annexin-Ⅴ和PI標記細胞并用流式細胞技術檢測。(E)流式細胞技術結果統(tǒng)計。

圖1　不同濃度瑞芬太尼對NSCs凋亡的影響

3　討論

在本實驗中，我們通過使用不同濃度的瑞芬太尼處理新生大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)干細胞，發(fā)現(xiàn)低濃度的瑞芬太尼對新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞內(nèi)鈣濃度、細胞凋亡沒有影響，而中高濃度的瑞芬太尼使細胞內(nèi)鈣濃度顯著升高，且細胞大量凋亡。

麻醉藥物如氟烷、N2O、異氟醚、丙泊酚等對實驗動物快速發(fā)育期的大腦都有敏感的神經(jīng)毒性，可誘發(fā)未成熟大腦神經(jīng)細胞死亡及發(fā)育后學習認知功能受損，且損害程度與劑量成正相關[4-5]。瑞芬太尼是新型超短效型的阿片受體激動藥，其對發(fā)育期大腦的影響目前還不十分清楚。目前，臨床上已普遍使用瑞芬太尼作為小兒麻醉鎮(zhèn)痛，且推薦使用的有效血藥濃度橫跨1～20 μg·L-1的廣泛區(qū)間[2]，因此，該實驗選取了該區(qū)間范圍內(nèi)的低(5 μg·L-1)、中(10 μg·L-1)、高(20 μg·L-1)三種不同劑量進行干預。瑞芬太尼主要作用于中樞神經(jīng)的邊緣系統(tǒng)[2]，而海馬組織是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，其結構特殊，是調(diào)控大腦學習認知功能的關鍵區(qū)域，而且在腦內(nèi)對損傷也最為敏感[6]。因此，本實驗選取新生海馬區(qū)域的細胞作為研究靶點。

研究已證實，海馬中的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞與學習記憶和認知功能有極密切的關系[7]。神經(jīng)干細胞是神經(jīng)元的前體細胞，在發(fā)育期，海馬中有大量的神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元細胞，這些新生的神經(jīng)元細胞直接影響認知功能(包括學習和記憶)的構建。而當神經(jīng)干細胞受損如發(fā)生凋亡壞死時，大腦的認知功能發(fā)育也會明顯受限[7]。因此，為了探討瑞芬太尼對發(fā)育期大腦認知功能的潛在影響，我們選取海馬齒狀回的神經(jīng)干細胞作為研究對象。

在本實驗中，我們觀察到，低濃度的瑞芬太尼對神經(jīng)干細胞的凋亡沒有明顯影響，而經(jīng)中高臨床濃度的瑞芬太尼處理后，神經(jīng)干細胞發(fā)生了明顯凋亡。這說明，在使用的臨床對應劑量中，中高濃度的瑞芬太尼會對體外培養(yǎng)的海馬區(qū)神經(jīng)干細胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。這提示我們，在臨床小兒麻醉中，使用較低有效濃度的瑞芬太尼對神經(jīng)發(fā)育是比較安全的，而使用高濃度的瑞芬太尼除了導致痛覺敏化等副作用外，還使小兒面臨著學習認知功能發(fā)育受損的風險，這將指導我們設計嚴密的臨床實驗作詳細證實。

在進一步的實驗檢測中，我們發(fā)現(xiàn)中高臨床濃度的瑞芬太尼能夠引起海馬區(qū)神經(jīng)干細胞內(nèi)的Ca2+濃度顯著升高，而低濃度瑞芬太尼對細胞內(nèi)Ca2+水平?jīng)]有影響，這很可能是中高濃度瑞芬太尼誘導神經(jīng)干細胞凋亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)Ca2+濃度與凋亡反應密切相關[8-9]。游離鈣離子作為細胞內(nèi)外信號轉導通路的信使，廣泛參與了神經(jīng)干細胞的生理過程。正常情況下，細胞內(nèi)Ca2+維持在較低水平，其濃度在生理范圍內(nèi)的升高可以促進細胞增殖分化與合成分解代謝等正常生理過程[10-11]；而細胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高至鈣超載時將觸發(fā)一系列病理生理變化，其典型表現(xiàn)為誘導細胞凋亡[12]。研究已證實，阿片類藥物可以刺激神經(jīng)細胞的鈣內(nèi)流，細胞內(nèi)Ca2+濃度越高，細胞凋亡越明顯[13]，本實驗結果與完全吻合。

綜上所述中高濃度的瑞芬太尼使新生大鼠神經(jīng)干細胞細胞內(nèi)鈣濃度顯著升高，細胞大量凋亡；低濃度的瑞芬太尼對神經(jīng)干細胞內(nèi)鈣濃度、細胞凋亡沒有影響。因此在小兒圍手術期推薦使用低濃度的瑞芬太尼是安全合理的。

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Effect of different clinical doses of remifentanil on the intracellular Ca2+concentration and apoptosis in newborn rat hippocampal neural stem cells

CHANG Ruijie1,2,YAO Xueqin1,2,MENG Chen1,2,et al

(1.TaiheHospital,Shiyan,Hubei442000,China;2.AnesthesiologyResearchInstituteofHubeiUniversityofMedicine,Shiyan,Hubei442000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of different clinical doses of remifentanil on the apoptosis and the related intracellular Ca2+concentration([Ca2+]i) in newborn rat hippocampal neural stem cells(NSCs).MethodsThe hippocampal monoclonal NSCs strains of newborn SD rat were seeded into 12-well plates at the density of 5×105cells/well,and cultured with 1 mL of DMEM/F12 medium containing 10% fetal bovine serum.NSCs were incubated in humidified incubator at 37 °C with 5% CO2for 24 hours.Cells were assigned into four groups by different treatments as follows:(1) control group:NSCs were treated by saline;(2) low dose group(R5group):NSCs were stimulated with 5 μg·L-1of remifentanil;(3) middle dose group(R10group):NSCs were incubated in 10 μg·L-1of remifentanil;(4) high dose group(R20group):NSCs were stimulated with 20 μg·L-1of remifentanil.In every group the treatment was repeated for four times.Laser scanning confocal microscope(LSCM) scanning was used after 300 s,600 s and 900 s of remifentanil treatment for detection of [Ca2+]i.NSCs apoptosis was assayed by flow cytometry 24 hours after the treatment of remifentanil.ResultsCompared with control group,R5group showed no significant changes in [Ca2+]i(P>0.05) and the concentrations of [Ca2+]iof NSCs in R10and R20group were increased markedly (P<0.05 andP<0.01,respectively).Compared with control group,NSCs in R5group were almost not impaired,while the apoptosis of NSCs was significantly increased in R10and R20group(P<0.05 andP<0.01,respectively).ConclusionsLow clinical dose of remifentanil has little effect on NSC apoptosis and the related [Ca2+]i,while the middle and high doses of clinical remifentanil notably increase the level of [Ca2+]i,resulting in significant apoptosis in NSCs.

Remifentanil;Hippocampus;Neural stem cells;Apoptosis;Calcium;Rats,sprague-dawley

湖北省自然科學基金項目(2012FFC060)；湖北省省級重點學科項目(2014XKJSSJ04)

李清，教授，碩士研究生導師，研究方向：麻醉學，E-mail:liqing8801@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.006

2016-03-09，

2016-06-20)