陳懇，丁益宏，朱郁飛，魏群，李峰，張弘

(1.如皋市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 如皋　226500；2.南通大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 如皋　226000)

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肝細胞癌患者血清中循環(huán)無細胞DNA、甲胎蛋白及a-L-巖藻糖苷酶聯(lián)合檢測的意義

陳懇1，丁益宏1，朱郁飛1，魏群2，李峰2，張弘2

(1.如皋市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 如皋226500；2.南通大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 如皋226000)

目的探討循環(huán)無細胞DNA(cfDNA)在肝細胞癌(HCC)中檢測的價值及其與甲胎蛋白(AFP)、a-L-巖藻糖苷酶(AFU)聯(lián)合檢測的臨床診斷價值。方法收集39例HCC患者血清以及45例正常對照血清，采用分支DNA(branched DNA,bDNA)技術(shù)檢測血清中cfDNA的濃度，同時采用化學發(fā)光法檢測血清中AFP的濃度，比色法測定血清AFU的活性，并討論這三種生物標志物聯(lián)合檢測的意義。結(jié)果39例HCC患者血清中有 22例cfDNA含量增高，45例正常對照血清中有2例cfDNA含量增高，HCC患者血清cfDNA陽性表達率均顯著高于正常對照者(P<0.05)；cfDNA與AFP、AFU的一項或者兩項聯(lián)合檢測敏感性分別為71.8%、87.2%、89.7%，明顯高于單獨一項檢測敏感性分別為56.4%、53.8%、66.7%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)相關(guān)性分析，cfDNA、AFP與AFU這三種生物標志物均無相關(guān)性。結(jié)論定量分析cfDNA的方法用于HCC的檢測是一種敏感、有效的方法，與AFP、AFU 聯(lián)合檢測可以大大提高HCC的臨床診斷。

癌,肝細胞;無細胞系統(tǒng);α-L-巖藻糖苷酶;甲胎蛋白類;癌癥早期檢測

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占腫瘤發(fā)病率中的第3位，惡性腫瘤死亡率排在第2位。肝癌未能切除者1年生存率低于30%，即使行肝癌根治術(shù)，五年復發(fā)率達80%左右，小肝癌的復發(fā)率也高達40%～50%，可見其治療的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷[1]。目前臨床常用的診斷指標有甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)、GGT-Ⅱ、a-L-巖藻糖苷酶(a-L-fucosidase，AFU)、酸性同工鐵蛋白等[2-3]，迄今為止，AFP仍然是診斷HCC最特異的標志，其在診斷、判斷療效、估計預后、預防復發(fā)中有肯定的作用。但是單靠AFP不能診斷所有的HCC，有30%左右的HCC患者AFP呈陰性。AFU、GGT-Ⅱ等在AFP陰性HCC的診斷有輔助意義，但仍不能取代AFP在HCC診斷中的意義，故臨床上需要一種優(yōu)于或者類似于AFP的檢測指標來提高HCC的診斷率。本研究以分支DNA技術(shù)為基礎(chǔ)的Alu含量測定方法，用于在HCC患者血清中定量檢測循環(huán)無細胞DNA(circulating free cell DNA，cfDNA)的含量，并評估其臨床診斷價值。同時，采用化學發(fā)光法檢測同批患者血清中AFP的濃度，以及比色法測定血清中AFU的活性，探討這三種生物標志物對HCC診斷的相互關(guān)系，并討論這三種生物標志物聯(lián)合檢測的意義。

1　材料和方法

1.1材料選取如皋市人民醫(yī)院2011年5月至2011年10月病史資料完備，經(jīng)臨床和影像學診斷為肝細胞癌患者血清標本39例，男32例，女7例，年齡40～85歲;隨機選取如皋市人民醫(yī)院體檢各項指標均正常的人員血清標本45例，男36 例，女 9例，年齡 28～83歲。于清晨空腹條件下采集血液，離心后將血清吸入eppendorf管，分裝后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑QuantiGene 2.0 DNA Assay(美國Panomix 公司)；甲胎蛋白試劑盒 ARCHITECT AFP Reagent Kit(美國雅培制藥有限公司)；AFU檢測試劑盒購自上海海軍醫(yī)學研究所生物技術(shù)中心。

1.3cfDNA的定量檢測所有血清標本取5 μL，用雙蒸水稀釋到100 L。人類基因組DNA標準液用TE緩沖液進行倍比稀釋，濃度分別為0、50、100、200、400 μg·L-1。檢測樣本和標準品均稀釋后置于干鍋95℃ 5 min加熱，使DNA解鏈成單鏈，迅速放入冰上，保持單鏈狀態(tài)。96孔板上每孔加入含有50%溶菌混合液和1 g·L-1蛋白酶K的90 μL WPS和10 μL檢測樣本(均做三孔檢測)，用錫箔紙封閉，置于雜交箱55℃過夜，用洗滌緩沖液洗滌3遍96孔板后，依次加入前放大探針(preamplifer probe)、放大探針(amplifer probe)，每次55 ℃1 h，洗滌3次，然后加入標記探針(labeled probe)，50 ℃1 h，洗滌3次，最后一次洗滌后，加入堿性磷酸酶底物催化劑dioxetane，用錫箔紙封閉，室溫下靜置5～10 min，顯影發(fā)光標記，用一種微孔板發(fā)光計檢測出每孔光子讀數(shù)。以標準品的濃度為橫座標和檢測出的光子數(shù)為縱座標，繪制標準曲線，并得出濃度與光子數(shù)相關(guān)方程式。然后，按方程式計算每孔的cfDNA的濃度，再乘以20得出每孔稀釋前的cfDNA含量。

1.4AFP的定量檢測血清標本AFP的檢測采用化學發(fā)光免疫分析法，按雅培公司甲胎蛋白試劑盒(ARCHITECT AFP Reagent Kit)說明書操作，根據(jù)校準品劑量-反應曲線計算各標本的濃度值。

1.5AFU的定量檢測血清標本AFU的檢測采用比色法，按上海海軍醫(yī)學研究所生物技術(shù)中心試劑盒說明書操作，計算AFU活性。

1.6結(jié)果判讀

1.6.1cfDNA參考值

根據(jù)標準曲線求得方程式，計算每個樣本的cfDNA含量，做受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，選取靈敏度和特異度最高的約登指數(shù)[4](Youden's index = Sensitivity+Specificity-1)為最佳篩查陽性界值(cut-off值)。故大于等于此值為陽性，小于此值為陰性。

1.6.2AFP參考值

根據(jù)中國抗癌協(xié)會制定的肝癌的臨床診斷和分期標準，排除妊娠、生殖系統(tǒng)的胚胎腫瘤、活動性肝炎、轉(zhuǎn)移性肝癌，血清AFP含量大于等于400 μg·L-1為陽性，小于400 μg·L-1為陰性。

1.6.3AFU參考值

血清AFU活性(μmol·L-1·h-1)=(A測定管-A對照管)/平均A標準管×400。大于650 μmol·L-1·h-1為陽性，550～650 μmol·L-1·h-1為可疑，小于550 μmol·L-1·h-1為陰性。

2　結(jié)果

2.1標準曲線的繪制將人類基因組DNA標準液400 μg·L-1做倍比稀釋，濃度分別為0、50、100、200、400 μg·L-1。每個濃度去3孔光子數(shù)的平均值，以標準品的濃度和檢測出的光子數(shù)繪制標準曲線，得出方程式Y(jié)=610.01X，R2=0.961 3(圖1)。

圖1　循環(huán)無細胞DNA標準曲線

2.2cfDNA定量檢測的結(jié)果39例HCC患者血清cfDNA含量最高12 866.8 μg·L-1，最低0 μg·L-1，中位數(shù)557.59 μg·L-1。45例正常對照者血清cfDNA含量最高 569.2963 μg·L-1，最低0 μg·L-1，中位數(shù)240.07 μg·L-1。采用u檢驗，u=3,4963>u0.01=2.58，得P<0.01兩者比較差異有統(tǒng)計學意義，(圖2)。根據(jù)ROC曲線，cfDNA診斷HCC的ROC曲線下面積(AUC)為0.742±0.058，最佳分界值為509.9774 μg·L-1。當以cfDNA≥509.9774 μg·L-1來預測HCC，其診斷的敏感度為56.4%、特異度為95.6%、準確度為77.4%、陽性預測值為91.7%、陰性預測值為71.7%、陽性似然比為12.692、陰性似然比為0.048、Youden指數(shù)為0.520。cfDNA濃度為509.9774 μg·L-1時，Youden指數(shù)取最大值，故將509.9774 μg·L-1定為陽性界定值。

圖2　39例肝細胞癌患者血清和45例健康對照者血清循環(huán)無細胞DNA水平

2.3AFP和AFU定量檢測的結(jié)果39例HCC患者血清AFP含量最高>10 000 μg·L-1，最低3.92 μg·L-1，陽性率為53.8%(21/39)。45例正常人血清AFP含量最高526.10 μg·L-1,最低1.31 μg·L-1l，假陽性率為8.9%(4/45)。兩樣本均數(shù)的比較采用u檢驗，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

39例HCC患者血清AFU含量最高2366 μg·L-1，最低362 μg·L-1，陽性率為66.7%(26/39)。45例健康人血清AFU含量最高792 μg·L-1，最低121 μg·L-1，假陽性率為24.4%(11/45)。兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4cfDNA與AFP、AFU相關(guān)性的比較用SPSS13.0繪制散點圖，計算Person相關(guān)系數(shù)分析三個指標兩兩之間的相關(guān)性。經(jīng)Pearson相關(guān)系數(shù)分析，cfDNA與AFP相關(guān)系數(shù)r=0.243，t=1.524，P>0.05，故cfDNA與AFP沒有相關(guān)關(guān)系。經(jīng)Pearson相關(guān)系數(shù)分析，cfDNA與AFU相關(guān)系數(shù)r=-0.0735，t=0.448，P>0.05，故cfDNA與AFU沒有相關(guān)關(guān)系。經(jīng)Pearson相關(guān)系數(shù)分析，AFP與AFU相關(guān)系數(shù)r=-0.085，t=0.537，P>0.05，故AFP與AFU沒有相關(guān)關(guān)系。

2.5cfDNA聯(lián)合AFP和AFU對HCC聯(lián)合檢測其診斷效率與cfDNA 、AFP或AFU單獨檢測HCC比較，有不同程度的提高(表2)。

表1　循環(huán)無細胞DNA、AFP和AFU對肝細胞癌的診斷價值評價(%)

注：與cfDNA+AFP組比較,aP<0.05；與cfDNA+AFU組比較,bP<0.05；與cfDNA+AFP+AFU組比較,cP<0.05。

3　討論

循環(huán)無細胞DNA(cfDNA)是存在于體液中的碎裂的核酸片段，可以在健康人和患者的血清中檢測到，cfDNA在體液中處于一種動態(tài)平衡過程，與很多疾病密切相關(guān)，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、腦卒中、風濕性關(guān)節(jié)炎、心肌梗死、肺栓塞、先兆子癇、Whipple’s綜合征和各種惡性腫瘤[5]，研究發(fā)現(xiàn)嚴重損傷、器官衰竭和多器官功能障礙可導致釋放到血漿中的cfDNA的含量增加。器官移植的病人cfDNA水平也會升高[6]。胎兒的cfDNA可以在母體的血漿中檢測到，并且可以用于胎兒發(fā)育異常的產(chǎn)前診斷[7]。外傷和燒傷也可以導致cfDNA釋放到血液循環(huán)中[8]。多數(shù)研究報道，在各種惡性和良性疾病患者血清中cfDNA水平明顯高于健康對照者，在健康人中，可以推測循環(huán)DNA起源于淋巴細胞或其他有核細胞，但是在惡性腫瘤中的起源仍然未知。

關(guān)于HCC患者血清中cfDNA水平的研究，尚有一些報道。HBV攜帶者血清cfDNA水平顯著高于正常對照者血清水平[9]。Ren等發(fā)現(xiàn)血清cfDNA水平與HCC的預后呈負相關(guān),大多數(shù)病例與HBV感染有關(guān)，表明cfDNA可能是預測HBV相關(guān)HCC的前兆性標記物。cfDNA較易從循環(huán)中分離出來，因此cfDNA是一種潛在的非侵襲性的腫瘤標記物[10]。cfDNA水平高的HCV相關(guān)HCC患者經(jīng)肝切除術(shù)后生存時間明顯短于cfDNA水平較低患者,血清cfDNA水平與HCV相關(guān)HCC的遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),39例HCC患者血清中cfDNA含量明顯高于45例正常對照血清中含量，其中，HCC伴肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移者cfDNA含量大幅度增高，男性患者對cfDNA含量也有較大影響，可見，肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移和性別均與HCC密切相關(guān)。提示血清cfDNA含量的升高與腫瘤的分化程度和是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測可以在HCC的病情監(jiān)測中起到一定的作用。

現(xiàn)有的定量血清中cfDNA的方法主要為RT-PCR技術(shù)。由于血循環(huán)中的DNA是一種存在于體液中的細胞外游離狀態(tài)的DNA，與組織和細胞中的DNA不同，是游離于細胞之外的DNA，不含有細胞結(jié)構(gòu)，因此血清中的cfDNA含量極少，從中提取游離DNA受到限制，提取的濃度和純度不容易達到理想的效果。分支DNA雜交技術(shù)是本試驗采用新近發(fā)展起來的一項技術(shù)，即分支DNA信號放大系統(tǒng)，是一種人工合成的分支DNA，分支DNA的分支可結(jié)合多個酶標記物，從而將捕獲的靶標信號放大，以便進行檢測。此技術(shù)無需提取血清游離DNA，直接以血清為檢測樣本，檢測重復序列Alu，對兩組中的血清中cfDNA進行定量分析。Alu家族是短散在重復序列中最大的一個家族，每個元件長約300 bp，具有很高的同源性(70%～98%)[12]。在Alu元件第170位置左右有一段序列AGCT，能被限制性內(nèi)切酶Alu識別并切割(AG↓CT)，因此得名。目前的研究表明[13]，Alu序列具有獨特的結(jié)構(gòu)特征及生理功能，與多種惡性腫瘤相關(guān)。Alu序列之間發(fā)生的同源重組導致基因的缺失、重復，染色體異位導致的基因重排以及轉(zhuǎn)錄水平的改變均與人類的疾病相關(guān)。本試驗中，應用bDNA技術(shù)，只放大雜交信號，不擴增靶序列，操作簡便、經(jīng)濟、省時，有很好的可重復性，可以作為檢測HCC的一種很好的檢測方法。

在眾多的HCC標記物中，一般認為，AFP是HCC相對特異的腫瘤標志物，AFP持續(xù)升高是發(fā)生HCC的危險因素。AFP現(xiàn)已廣泛用于HCC的普查、診斷、判斷治療效果、預測復發(fā)[14]。AFP也可見于其他癌癥,如:睪丸癌、畸胎瘤以及胃癌，胰腺癌等。但是單靠AFP不能診斷所有HCC，因為尚有30%左右HCC病人AFP陰性。在某些非惡性腫瘤病變也可存在假陽性：如病毒性肝炎，肝硬化的也會升高，妊娠婦女的血和尿中的AFP也會持續(xù)升高，但升高不如HCC明顯，大多小于300 μg·L-1。AFU是一種廣泛存在于人體組織中的溶酶體酸性水解酶，以肝腎等組織活性較高。關(guān)于AFU在HCC患者血清中含量升高的機理，有研究認為是HCC時AFU合成增加，但也有研究認為是肝癌細胞產(chǎn)生了一種AFU抑制劑，使其對底物水解能力下降，引起底物堆積及AFU含量代償性增加。在肝細胞癌中，AFU可以作為一種有效的腫瘤標記物[15-16]。本實驗中，HCC患者血清AFP含量最高>10 000 μg·L-1，最低3.92 μg·L-1，中位數(shù)392.07 μg·L-1，正常人血清AFP含量最高526.10 μg·L-1,最低1.31 μg·L-1，中位數(shù)6.02 μg·L-1。兩者比較有顯著性差異。HCC患者血清AFU含量最高2 366 μg·L-1，最低362 μg·L-1，中位數(shù)744 μg·L-1，正常人血清AFU含量最高792 μg·L-1，最低121 μg·L-1，中位數(shù)431 μg·L-1。兩者比較亦有差異有統(tǒng)計學意義?？梢缘贸?，HCC患者血清中AFP含量、AFU含量較正常人血清中含量均明顯增高。

相關(guān)分析是對現(xiàn)象之間的相關(guān)關(guān)系的方向和程度進行分析。本實驗中，采用SPSS13.0繪制散點圖，cfDNA、AFP和AFU三個指標，兩兩作圖，得出相關(guān)點分布狀況的圖形。本實驗中，cfDNA與AFP相關(guān)系數(shù)r=0.243，P>0.05，故cfDNA與AFP沒有相關(guān)關(guān)系；cfDNA與AFU相關(guān)系數(shù)r=-0.0735，P>0.05，故cfDNA與AFU沒有相關(guān)關(guān)系；AFP與AFU相關(guān)系數(shù)r=-0.085，P>0.05，故AFP與AFU沒有相關(guān)關(guān)系?？梢缘贸?，cfDNA與AFP、AFU可以作為不相關(guān)的獨立的檢測指標，用于HCC的臨床診斷。

任何一個診斷指標，都具備三個最基本的特征，即敏感性、特異性和準確性。本實驗中，在敏感性方面AFU為66.7%最高，cfDNA與AFP分別為56.4%和53.8%，在特異性方面，AFU僅為75.6%，遠遠低于cfDNA為95.6%和AFP為91.1%，準確性cfDNA為77.4%，AFP為73.8%，AFU為71.4%。綜合評價，三者準確性相似，無明顯區(qū)別，AFU雖敏感性最高，但特異性很低，cfDNA和AFP敏感性較低，但特異性好。cfDNA聯(lián)合AFP或cfDNA聯(lián)合AFU兩項檢測檢測，檢測特異性下降，但敏感性顯著提高，準確性相似，cfDNA聯(lián)合AFP、AFU三項檢測，檢測敏感性稍有提高，特異性下降，準確性相似，綜合考慮病人經(jīng)濟負擔等因素，我們認為兩項檢測優(yōu)于三項檢測。因此，cfDNA與AFP、AFU聯(lián)合檢測可以大大提高HCC陽性檢出率，具有重要的臨床應用價值。

總之，cfDNA用于檢測HCC具有較高的敏感性和特異性，其臨床診斷價值可與AFP媲美，且與AFP、AFU沒有相關(guān)性，聯(lián)合其中一項或兩項檢測可大大提高HCC的診斷率。

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Significance of combined detection with CfDNA,AFP and AFU in the diagnosis of hepatocelluar carcinoma

CHEN Ken，DING Yihong，ZHU Yufei，et al

(DepartmentofGastroenterology，RenminHospital,Rugao,Jiangsu226500,China)

ObjectiveTo investigate the value of circulating free cell DNA(cfDNA)for the diagnosis of hepatocellular carcinoma(HCC),and to explore the value of combined detection of cfDNA,AFP and AFU for the clinical diagnosis.MethodsSerum samples from 39 HCC patients and 45 normal controls were collected.Branched DNA(bDNA) was used to detect the level of cfDNA,while AFP (a-fetoprotein)and AFU (a-L-fucosidase)were detected by chemiluminescence and colorimetry respectively.The significance of combined detection of the three biomarkers was discussed.ResultscfDNA level was increased in 22 of the 39 HCC samples and 2 of the 45 normal controls.cfDNA level in HCC samples was significantly higher than that in normal controls (P<0.05).The sensitivities of combined detection with one item(cfDNA and AFP，cfDNA and AFU),and with two items(cfDNA ,AFP and AFU) were 71.8%,87.2% and 89.7% versus 56.4%,53.8% and 66.7% for cfDNA and AFP,AFU alone respectively,the difference being statistically significant(P<0.05).By the correlation analysis,there was no significant correlation between cfDNA,AFP and AFU in the detection of HCC.ConclusionsQuantitative analysis of cfDNA is sensitive and feasible,and combined detection of cfDNA with AFP or AFU or both can improve the diagnostic sensitivity for HCC.

Carcinoma,hepatocellular;Cell-free system;alpha-L-Fucosidase;alpha-Fetoproteins;Early detection of cancer

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.029

2016-02-23，

2016-04-07)