湛雯，徐進(jìn)，孫芳，景霞,許靜

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京　210008)

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高效液相色譜法測(cè)定自制苯海拉明乳膏中羥苯乙酯的含量

湛雯，徐進(jìn)，孫芳，景霞,許靜

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京210008)

目的建立測(cè)定醫(yī)院自制制劑苯海拉明乳膏中羥苯乙酯的含量測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法(HPLC)。色譜柱：Agilent Eclipse Plus-C18(4.6 mm× 250 mm,5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(含0.1%三乙胺，用50%磷酸調(diào)pH 3.0±0.03)=60∶40；檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm；柱溫：25℃；流速：0.9 mL·min-1；進(jìn)樣體積：20 μL。結(jié)果羥苯乙酯測(cè)定質(zhì)量濃度在0.02～0.10 g·L-1范圍內(nèi)與其相應(yīng)峰面積積分值呈良好線性關(guān)系(r=0.999 5)；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.6%、1.9%、2.0 %；平均絕對(duì)回收率為92.7 %，RSD為4.3%(n=9)；平均相對(duì)回收率為102.5 %，RSD為3.6 %(n=9)。結(jié)論該方法專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性較好，可用于苯海拉明乳膏中羥苯乙酯的含量測(cè)定。

防腐劑,藥物;色譜法,高壓液相;苯海拉明;藥物調(diào)劑;羥苯乙酯/分析

抑菌劑是能有效防止或抑制微生物的生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)。藥物制劑中抑菌劑用量不足，達(dá)不到有效抑菌濃度；用量過大，具有一定毒性，易引起不良反應(yīng)[1]。人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)議(ICH)明確提出應(yīng)制訂抑菌劑含量測(cè)定方法。但目前在我國，較少藥品對(duì)抑菌劑進(jìn)行了質(zhì)量控制或含量測(cè)定研究[2-4]。中國藥典制劑通則中規(guī)定了制劑須進(jìn)行微生物限度的檢測(cè)，雖然它能確定藥品中抑菌劑的最低有效殺菌或抑菌濃度是否合理，但不能保證制劑中所含抑菌劑的上限是否合理，故它不能替代抑菌劑的含量測(cè)定。因此，從臨床用藥的安全性來說，制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制訂抑菌劑含量測(cè)定具有重要意義[5]。

羥苯乙酯為一種優(yōu)良的抑菌劑，化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，被廣泛用于軟膏及乳膏制劑的防腐。我院自制制劑苯海拉明乳膏中加入0.1%的羥苯乙酯作為抑菌劑。目前有部分文獻(xiàn)對(duì)苯海拉明乳膏中的鹽酸苯海拉明含量測(cè)定有一定研究[6-8]，但尚無對(duì)此乳膏中的羥苯乙酯含量進(jìn)行檢測(cè)分析。為了對(duì)苯海拉明乳膏進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，保證藥品質(zhì)量，本試驗(yàn)通過高效液相色譜法對(duì)自制乳膏中的羥苯乙酯進(jìn)行含量測(cè)定，保障醫(yī)院自制制劑的質(zhì)量與安全。

1　儀器與材料

Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀(G1312B二元泵，G1316A柱溫箱，G4212B 二極管陣列檢測(cè)器)，十萬分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo，MS205DU)。

羥苯乙酯對(duì)照品購于中國食品藥品檢定研究院(批號(hào)：100847-201203)，苯海拉明乳膏為我院自制(批號(hào)：141230，150225，150227，150317，150601，150602，150721，150722)，甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(含0.1%三乙胺，用50%磷酸調(diào)pH 3.0±0.03)=60∶40；檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm；柱溫：室溫(25℃)；流速：0.9 mL·min-1；進(jìn)樣體積：20 μL。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液

取干燥至恒重的羥苯乙酯對(duì)照品200 mg，精密稱定，至10 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液制備

取苯海拉明乳膏5 g，精密稱定。加0.01 mol·L-1鹽酸溶液適量，80 ℃水浴加熱至油相完全融化析出，冷藏，待油層凝固，過濾；重復(fù)上述操作兩次，至上層油相無胭脂紅紅色。將三次濾液并入100 mL量瓶中，以0.01 mol·L-1鹽酸溶液定容至刻度，搖勻，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液得供試品溶液。

2.2.3對(duì)照品溶液

精密移取2.2.1項(xiàng)羥苯乙酯儲(chǔ)備液0.25 mL于100 mL容量瓶中，攪拌均勻，按2.2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，即得對(duì)照品溶液。

2.2.4陰性對(duì)照品溶液

按苯海拉明乳膏處方工藝制備不含羥苯乙酯的空白制劑，按2.2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.2.5質(zhì)控品溶液的制備

按苯海拉明乳膏處方工藝制備含羥苯乙酯處方量80%、100%及120%的制劑，按2.2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，即得質(zhì)控品溶液。

2.3專屬性試驗(yàn)按2.1項(xiàng)下色譜條件分別對(duì)對(duì)照品溶液，供試品溶液，陰性對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖(見圖1)。結(jié)果表明，供試品溶液中羥苯乙酯色譜峰與對(duì)照品溶液中羥苯乙酯色譜峰保留時(shí)間一致，且與相鄰色譜峰分離度良好；陰性對(duì)照品溶液在羥苯乙酯色譜峰位置無吸收峰，該測(cè)定方法專屬性良好。

2.4線性關(guān)系考察精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，配制成濃度分別為0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 g·L-1的羥苯乙酯溶液。分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜峰面積。以各色譜峰面積積分值(Y)對(duì)樣品中羥苯乙酯濃度(X，g·L-1)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=142 169X-353.46，r=0.999 5。

稱取5 g按苯海拉明乳膏處方工藝制備的不含羥苯乙酯的空白制劑，精密移取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于上述空白制劑中，攪拌均勻。按2.2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行處理。分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜峰面積。以各色譜峰面積積分值(Y)對(duì)樣品中羥苯乙酯濃度(X， g·L-1)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=131 796X-590.8，r=0.9964。

結(jié)果表明，羥苯乙酯測(cè)試濃度在0.02～0.10 g·L-1范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。在苯海拉明乳膏基質(zhì)中，羥苯乙酯測(cè)試濃度與其峰面積積分值亦呈較好線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)取2.2.3項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，羥苯乙酯色譜峰面積的RSD為1.6%，表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取苯海拉明乳膏5 g(批號(hào)：150721)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別于放置0，2，4，8，12，24 h時(shí)，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。記錄羥苯乙酯色譜峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果為1.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

對(duì)照品溶液　　　　　　　　　　　　　　　供試品溶液　　　　　　　　　　　　　陰性對(duì)照品溶液

2.7重復(fù)性試驗(yàn)取苯海拉明乳膏一盒(批號(hào)：150721)。按2.2.2項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定5份供試品溶液中羥苯乙酯的峰面積。結(jié)果羥苯乙酯的峰面積的RSD為2.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8回收率試驗(yàn)

2.8.1絕對(duì)回收率試驗(yàn)

稱取5 g按苯海拉明乳膏處方工藝制備的不含羥苯乙酯的空白制劑。分別加入適量鹽酸苯海拉明對(duì)照品，按2.2.2下方法分別制備供試品溶液。以2.1下條件測(cè)定各樣品中羥苯乙酯的含量。結(jié)果見表1。計(jì)算得樣品平均絕對(duì)回收率為92.7%，RSD為4.3%。

表1　絕對(duì)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.8.2相對(duì)回收率試驗(yàn)

以2.8.1項(xiàng)下制備的供試品按2.4項(xiàng)中的含基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=131 796X-590.8，計(jì)算所得的濃度，與配制濃度相比計(jì)算相對(duì)回收率。結(jié)果見表2。計(jì)算得樣品平均相對(duì)回收率為102.5%，RSD為3.6%。

2.9樣品含量檢測(cè)取苯海拉明乳膏(批號(hào)：141230、150225、150227、150601、150602、150722)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液；按照2.2.5項(xiàng)下制備質(zhì)控品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別取質(zhì)控品溶液和供試品溶液進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中羥苯乙酯的含量。結(jié)果見表3。

表2　相對(duì)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表3　苯海拉明乳膏中羥苯乙酯的含量測(cè)定

3　討論

3.1試驗(yàn)方法因羥苯乙酯水中溶解度低，醇中溶解度高，故先摸索了用甲醇、乙醇提取苯海拉明乳膏中的羥苯乙酯[9]，但乳膏中的油性基質(zhì)亦溶于醇溶液，醇提取液在流動(dòng)性中有油性基質(zhì)析出，易堵塞色譜柱并吸附羥苯乙酯影響其定量，試驗(yàn)精密度及回收率均不合格。

摸索使用0.01 mol·L-1鹽酸溶液自制苯海拉明乳膏中的羥苯乙酯，苯海拉明乳膏能良好的破乳，得油層和澄清的水溶液，取濾過水溶液進(jìn)行色譜分析[10]。由于苯海拉明乳膏的基質(zhì)復(fù)雜，羥苯乙酯在水中溶解度不佳，因此使用上述方法提取的苯海拉明乳膏中的羥苯乙酯的平均絕對(duì)回收率為92.7%，但平均相對(duì)回收率達(dá)到102.5%，符合2015版中國藥典中藥品待測(cè)成分定量分析要求。

3.2樣品質(zhì)量控制按2.2.5項(xiàng)下制備質(zhì)控品溶液。檢測(cè)樣品時(shí)同時(shí)檢測(cè)質(zhì)控品，如果相對(duì)回收率落在90%～110%之間，即可認(rèn)為樣品制備過程符合實(shí)驗(yàn)要求，儀器檢測(cè)正常，否則須檢查整個(gè)操作過程。

3.3試驗(yàn)總結(jié)參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]和試驗(yàn)研究，本試驗(yàn)中采用甲醇-0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相，建立苯海拉明乳膏中羥苯乙酯HPLC含量測(cè)定方法。在本色譜條件下，羥苯乙酯理論塔板數(shù)大于8 000，出峰時(shí)間在10 min內(nèi)完成，保留時(shí)間適宜。在該色譜條件下，亦能對(duì)鹽酸苯海拉明進(jìn)行分離和檢測(cè)。

該方法線性關(guān)系良好，重現(xiàn)性高，可用于醫(yī)院自制制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制，為患者用藥的安全性提供保障。

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Determination of ethyl hydroxybenzoate in diphenhydramine cream by HPLC

ZHAN Wen，XU Jin，SUN Fang，et al

(PharmaceuticalDepartment,NanjingChildren’sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210008,China)

ObjectiveTo establish a method of quantitative determination of ethyl hydroxybenzoate in diphenhydramine cream.MethodsThe HPLC method was adopted with the Agilent Eclipse Plus-C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm) at room temperature(25 ℃) and methanol-0.03 mol·L-1phosphoric acid solution(pH adjusted to 3.0 ± 0.03)(60∶40) as the mobile phase at the flow rate of 0.9 mL·min-1.The detection wavelength for ethyl hydroxybenzoate was 258 nm,and the injection volume was 20 μL.ResultsThe good linear relationship for ethyl hydroxybenzoate was in the range of 0.02～0.10 g·L-1(r=0.999 5).RSDs of ethyl hydroxybenzoate for precision,stability and reproducibility tests were 1.6 %,1.9% and 2.0 %,respectively.The average absolute recovery of ethyl hydroxybenzoate was 92.7%(RSD=4.3 %,n=9),while the average relative recovery was 102.5 %(RSD=3.6 %,n=9).ConclusionsThis established method was specific,accurate and reproducible for the quantitative determination of ethyl hydroxybenzoate in diphenhydramine cream.

Preservatives,pharmaceutical;Chromatography,high pressure liquid;Diphenhydramine;Drug compounding;Ethyl hydroxybenzoate/analysis

許靜，女，副主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail:njxujing@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.011

2016-04-14，

2016-07-10)