王之學(xué)，肖繼州，趙振霞，于強(qiáng)

(聊城市第二人民醫(yī)院燒傷科，山東 聊城　252600)

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納米微囊介導(dǎo)的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合低氧誘導(dǎo)因子-1提高隨意型皮瓣缺氧耐受的實(shí)驗(yàn)研究

王之學(xué)，肖繼州，趙振霞，于強(qiáng)

(聊城市第二人民醫(yī)院燒傷科，山東 聊城252600)

目的探討以納米微囊為載介導(dǎo)的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)聯(lián)合低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)對(duì)大鼠隨意性皮瓣缺氧耐受的作用。方法SD大鼠40只，背部設(shè)計(jì)6 cm×2 cm的隨意性皮瓣。采用隨機(jī)方法分為4組：A組為聯(lián)合應(yīng)用含bFGF和HIF-1的試驗(yàn)組；B組為單純應(yīng)用bFGF的基因?qū)φ战M1；C組為單純應(yīng)用HIF-1的基因?qū)φ战M2；D組為應(yīng)用生理鹽水的空白對(duì)照組。采用皮瓣下注射的方式，術(shù)后測(cè)量皮瓣成活面積，病理切片HE染色，皮瓣組織的bFGF和HIF-1免疫組化檢測(cè)及皮瓣下毛細(xì)血管的數(shù)目密度統(tǒng)計(jì)。結(jié)果納米微囊介導(dǎo)的試驗(yàn)組與其他對(duì)照組相比，皮瓣成活率更高，目的蛋白表達(dá)和皮瓣新生血管密度計(jì)數(shù)與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論以納米微囊為載體，聯(lián)合應(yīng)用bFGF和HIF-1的基因治療能促進(jìn)皮瓣血管的增生，顯著提高大鼠隨意性皮瓣的缺氧耐受，增加其成活率。

外科皮瓣；納米囊；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子；新生血管化,生理性；大鼠

皮瓣存活是保證皮瓣移植手術(shù)成功與否的最重要因素，其中皮瓣術(shù)后缺血性壞死是困擾外科學(xué)的一個(gè)難題。近年來(lái)，研究表明堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor，HIF-1)可直接或間接的促進(jìn)血管的形成[1]，提高皮瓣遠(yuǎn)端缺血部分的成活率。已有學(xué)者將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子成功的運(yùn)用于皮瓣成活的研究中，結(jié)果表明堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能顯著的促進(jìn)新生血管的形成[2-3]。低氧誘導(dǎo)因子1是在機(jī)體缺血狀態(tài)下表達(dá)的一類蛋白質(zhì)，通過(guò)調(diào)控其他生長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管的再生，對(duì)缺血性皮瓣的存活具有重要的作用。師永紅等[4]報(bào)道堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可通過(guò)信號(hào)通路PI3K/Akt和MEK1/ERK活化低氧誘導(dǎo)因子，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性從而促進(jìn)新血管的生成。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和低氧誘導(dǎo)因子在新血管的生成中有著密切的關(guān)系。由于bFGF和HIF-1在體內(nèi)易被蛋白酶分解，半衰期短，局部使用時(shí)不能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，而采用微囊系統(tǒng)可將控制其局部釋放的問(wèn)題。故本實(shí)驗(yàn)將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和低氧誘導(dǎo)因子有機(jī)的結(jié)合在一起，以殼聚糖納米微囊為載體觀察提高大鼠隨意型皮瓣缺氧耐受的情況。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備Bio-RADModel酶標(biāo)分析儀(美國(guó))，S-2700掃描電鏡(日本)，F(xiàn)J-2300型計(jì)數(shù)儀，HJ-4磁力攪拌器，TH2-82型恒溫振蕩儀，真空干燥箱(上海)，Span-80為Sigma公司分析純，殼聚糖為Sigma公司，pTagRFP-Cl-Hu-bFGF和pEGFP-N2-Hu-HIF-1購(gòu)自重慶碧基生物科技有限公司，ABC免疫組化試劑盒購(gòu)組武漢博士德生物制品公司，鼠抗人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及鼠抗人低氧誘導(dǎo)因子1購(gòu)自武漢博士德生物制品公司，內(nèi)參物甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)購(gòu)自康成生物工程有限公司，分子量為146 kDa。其他試劑如無(wú)水乙醚、異丙醇、丙酮、戊二醇等均為國(guó)藥分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。健康的SD大鼠40只(由濟(jì)南市金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，SCXK(魯)2014-0006)，體重200～250 g，雌雄不限，隨機(jī)分為A組為聯(lián)合應(yīng)用bFGF和HIF-1納米微囊的實(shí)驗(yàn)組，B組為應(yīng)用bFGF納米微囊的對(duì)照組1，C組為應(yīng)用HIF-1納米微囊的對(duì)照組2，D組為應(yīng)用生理鹽水的空白對(duì)照組。

1.2納米微囊的制備及鑒定

1.2.1bFGF和HIF-1雙基因納米微囊的制備

根據(jù)文獻(xiàn)提供的方法制備殼聚糖納米微囊[5]。稱取50 mg殼聚糖，加入360 μL乙酸，加超純水至2.5 mL，置37℃恒溫箱內(nèi)過(guò)夜，再加超純水至245 mL，調(diào)節(jié)pH至5.5，加超純水定容至250 mL容量瓶中，過(guò)濾除菌得殼聚糖溶液，濃度為0.2 g·L-1；各取pTagRFP-Cl-Hu-bFGF和pEGFP-N2-Hu-HIF-1 10 mg，溶解于100 mL 5 mmol·L-1的硫酸鈉溶液中，配制成0.2 g·L-1的質(zhì)粒溶液；將質(zhì)粒溶液和殼聚糖溶液分別置于水浴上于55 ℃加熱15 min，將兩種溶液等體積混合，3 000 r·min-1速攪拌1 min，即得濃度為100 μg·L-1的雙基因殼聚糖納米微囊溶液，于4 ℃保存，備用。將制備好的納米微囊直接放于原子力顯微鏡(SPI3800N)下觀察見殼聚糖納米微囊呈不規(guī)則球形，結(jié)構(gòu)緊密，粒徑約為100～200 nm，大小較均勻。再將納米微囊用硫酸鈉溶液(濃度為30 mmol·L-1)按1∶15稀釋，取稀釋液5 μL置云母片上，用氮?dú)獯蹈?，于原子力顯微鏡下觀察納米形態(tài)并測(cè)量直徑。

1.2.2bFGF納米微囊的制備

稱取50 mg殼聚糖，加入360 μL乙酸，加超純水至2.5 mL，置37 ℃恒溫箱內(nèi)過(guò)夜，再加超純水至245 mL，調(diào)節(jié)pH至5.5，加超純水定容至250 mL容量瓶中，過(guò)濾除菌得殼聚糖溶液，濃度為0.2 g·L-1；稱取pTagRFP-Cl-Hu-bFGF 10 mg，溶解于100 mL 5 mmol·L-1的硫酸鈉溶液中，配制成0.2 g·L-1的質(zhì)粒溶液；將質(zhì)粒溶液和殼聚糖溶液分別置于水浴上于55 ℃加熱15 min，將兩種溶液等體積混合，3 000 r·min-1速攪拌1 min，即得濃度為100 μg·L-1的雙基因殼聚糖納米微囊溶液，于4 ℃保存，備用。

1.2.3HIF-1納米微囊的制備

稱取50 mg殼聚糖，加入360 μL乙酸，加超純水至2.5 mL，置37 ℃恒溫箱內(nèi)過(guò)夜，再加超純水至245 mL，調(diào)節(jié)pH至5.5，加超純水定容至250 mL容量瓶中，過(guò)濾除菌得殼聚糖溶液，濃度為0.2 g·L-1；取pEGFP-N2-Hu-HIF-1 10 mg，溶解于100 mL 55 mmol·L-1的硫酸鈉溶液中，配制成0.2 g·L-1的質(zhì)粒溶液；將質(zhì)粒溶液和殼聚糖溶液分別置于水浴上于55 ℃加熱15 min，將兩種溶液等體積混合，3 000轉(zhuǎn)速攪拌1 min，即得濃度為100 μg·L-1的雙基因殼聚糖納米微囊溶液，于4 ℃保存，備用。

1.3動(dòng)物模型的制備及觀察指標(biāo)

1.3.1動(dòng)物模型的制備

術(shù)前大鼠背部用8%硫化鈉溶液脫毛處理，溫水洗凈。戊巴比妥鈉按30 g·L-1腹腔注射麻醉大鼠，麻醉平穩(wěn)后，將其放于手術(shù)平臺(tái)上，四肢固定，取俯臥位，聚維酮碘溶液消毒，鋪巾。于鼠背正中設(shè)計(jì)6 cm×2 cm的隨意皮瓣(含脂膜肌層)，縱軸與脊柱平行，在分別距離蒂部2、4 cm 處，做與蒂部平行的兩條直線，此直線分別與皮瓣的邊緣相交于四點(diǎn)，以此四點(diǎn)作為注射位點(diǎn)。A組皮瓣下每個(gè)注射位點(diǎn)注射100 μg·L-1的bFGF和HIF-1雙基因納米微囊(含bFGF和HIF-1)，B組注射100 μg·L-1的bFGF納米微囊(含bFGF)，C組注射100 μg·L-1的HIF-1納米微囊(含HIF-1)，D組注射生理鹽水1 mL。用3-0絲線原位間斷縫合，切口邊緣涂紅霉素藥膏。所有傷口均隔日換藥，肌肉注射青霉素20萬(wàn)單位，1次/d，連續(xù)3 d。單籠喂養(yǎng)。

1.3.2大體外觀察

在術(shù)后7 d內(nèi)對(duì)大鼠皮瓣進(jìn)行觀察，主要觀察3個(gè)部位，分別距離蒂部4～6 cm(遠(yuǎn)端)，2～4 cm(中端)，0～2 cm(蒂部)。分別從皮瓣的質(zhì)地、顏色、組織彈性及毛發(fā)生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。皮瓣壞死的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：顏色變黑、質(zhì)地堅(jiān)硬、組織回縮及彈性差、無(wú)毛細(xì)管反應(yīng)。

1.3.3皮瓣存活率的檢測(cè)

皮瓣手術(shù)7 d后，存活區(qū)與壞死區(qū)已經(jīng)很明顯。首先用透明紙準(zhǔn)確描繪各組皮瓣的形態(tài)，壞死區(qū)域用記號(hào)筆標(biāo)記，對(duì)其進(jìn)行照相，利用圖像分析軟件計(jì)算壞死面積與存活面積。計(jì)算公式為：皮瓣存活率=皮瓣存活面積/皮瓣總面積×100%。

1.3.4組織學(xué)檢測(cè)

術(shù)后7 d將大鼠處死，取皮瓣組織(含筋膜層)，用10%的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，冰凍切片，HE染色，在光鏡下觀察肉芽組織層厚度，壞死、組織水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況，并進(jìn)行新生毛細(xì)管和成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.5免疫印跡檢測(cè)

術(shù)后取存活皮瓣組織(0.5 cm×0.5 cm)，加細(xì)胞裂解液，蛋白酶抑制劑，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，免疫雜交和顯色后觀察細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)情況。以恒定含量的GAPDH作為內(nèi)參照物，標(biāo)定各實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)情況。

2　結(jié)果

2.1大體觀察實(shí)驗(yàn)所用所有大鼠均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。術(shù)后2～3 d，所有組的皮瓣全部存活，遠(yuǎn)端皮瓣經(jīng)毛細(xì)管充盈實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)陽(yáng)性，邊緣組織有少量滲血；4～5 d時(shí)，所有組大鼠隨意皮瓣的遠(yuǎn)端色澤均有變暗，推測(cè)可能出現(xiàn)組織壞死。實(shí)驗(yàn)組皮瓣遠(yuǎn)端色澤較所有對(duì)照組顏色淺；實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組1中大鼠皮瓣的中段膚色正常及毛細(xì)血管充盈實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，對(duì)照組2與實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組1有輕微差異，空白對(duì)照組中段皮瓣顏色及充盈實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他組有差異，且個(gè)別部位出現(xiàn)青紫。6～7 d時(shí)，所有組大鼠遠(yuǎn)端皮瓣的顏色均有加深、變暗；實(shí)驗(yàn)組中段及近端的皮瓣都存活，且膚色正常，毛細(xì)管充盈實(shí)驗(yàn)顯陽(yáng)性，對(duì)照組1中皮瓣顏色較實(shí)驗(yàn)組顏色稍深，中段及近端的毛細(xì)管充盈實(shí)驗(yàn)均顯示陽(yáng)性，對(duì)照組2中皮瓣中段顏色較對(duì)照組1更深，毛細(xì)管充盈實(shí)驗(yàn)顯示弱陽(yáng)性，空白對(duì)照組遠(yuǎn)端皮瓣有輕度腫脹，皮紋變淺，中段也較其他組顏色深，毛細(xì)管充盈實(shí)驗(yàn)顯若陰性，近端皮瓣存活良好。

2.2皮瓣存活按照1.3.3項(xiàng)中檢測(cè)皮瓣存活率的方法檢測(cè)，利用S-2700掃描電鏡計(jì)算各組小鼠壞死面積和存活面積，計(jì)算皮瓣存活率。匯總四組大鼠皮瓣成活率結(jié)果:A組為(85.663±2.34)%，B組為(69.113±3.55)%，C組為(63.224±2.78) %，D組為(42.886±3.01) %。經(jīng)過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算得出，組間秩和檢驗(yàn)的P=0.006，說(shuō)明四組間皮瓣存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組與各對(duì)照組的兩兩比較結(jié)果顯示：A組與B組組間比較P=0.004，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可以認(rèn)為A組的皮瓣存活率優(yōu)于B組；A組與C組間比較P=0.009，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可以認(rèn)為A組的皮瓣存活率優(yōu)于C組；A組與D組間比較P=0.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可以認(rèn)為A組的皮瓣存活率優(yōu)于D組。

2.3組織學(xué)觀察及新生血管計(jì)數(shù)A組近端皮瓣下無(wú)明顯炎性浸潤(rùn)，無(wú)組織水腫，皮下纖維增生明顯；中段皮瓣下有輕度水腫，皮下纖維組織有增生，炎性細(xì)胞有部分浸潤(rùn)；遠(yuǎn)端皮下有明顯水腫，皮下纖維增生明顯，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。B、C組組織學(xué)差異不明顯，皮瓣近端有輕度水腫，輕度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，皮下纖維有增生；中段皮下組織有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織水腫明顯，成纖維增生不明顯；遠(yuǎn)端皮膚全層壞死，組織結(jié)構(gòu)崩解，皮下出現(xiàn)彌漫性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。D組為空白組對(duì)照，近端皮下有大量炎性細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，組織結(jié)構(gòu)崩解，組織水腫，且成纖維細(xì)胞增生明顯減少。由FJ-2300型計(jì)數(shù)儀計(jì)算各組皮瓣下血管斷面數(shù)密度，4組大鼠結(jié)果分別為(35.57±5.23)、(24.92±3.13)、(21.97±3.25) %、(13.74±4.61) 個(gè)/mm2，經(jīng)SPSS軟件分析四組間比較P<0.01，說(shuō)明各組間新生血管計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組與各對(duì)照組的兩兩比較結(jié)果顯示：A組與B組間比較P=0.0167，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可以認(rèn)為A組的新生血管計(jì)數(shù)優(yōu)于B組；A組與C組間比較P=0.0167，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可以認(rèn)為A組的新生血管計(jì)數(shù)優(yōu)于C組；A組與D組間比較P=0.0167，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可以認(rèn)為A組的新生血管計(jì)數(shù)優(yōu)于D組。

2.4蛋白印跡檢測(cè)術(shù)后7 d，細(xì)胞裂解液中檢測(cè)bFGF和HIF-1在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)結(jié)果顯示為陽(yáng)性，對(duì)照組1、2顯示為弱陽(yáng)性，空白對(duì)照組為陰性，結(jié)果見圖1、2。

圖1　bFGF與GAPDH檢測(cè)結(jié)果

圖2　HTF-1與GAPDH檢測(cè)結(jié)果

3　討論

血管的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、細(xì)胞外基質(zhì)的降解管腔的形成等過(guò)程[5]，其中bFGF被認(rèn)為是最重要的血管生成因子之一[3,6]。bFGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖以及遷移，作用于血管生成的多個(gè)環(huán)節(jié)。劉丹、王璐等[7-8]在鼠背部設(shè)計(jì)隨意性皮瓣，原味縫合后皮下注射bFGF,結(jié)果顯示可明顯提高皮瓣存活率。HIF-1是低氧時(shí)表達(dá)的一種蛋白，對(duì)傷口的愈合、新血管的再生起著重要的作用。周盛源等[9]通過(guò)將bFGF基因?qū)隑MSCs，建立了損傷模型后實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入bFGF實(shí)驗(yàn)組損傷修復(fù)效果明顯優(yōu)于對(duì)照組。通過(guò)人乳腺癌細(xì)胞為對(duì)象，研究了bFGF和HIF-1在腫瘤新血管生成過(guò)程中的密切關(guān)系，發(fā)現(xiàn)bFGF以劑量和時(shí)間依賴性的方式誘導(dǎo)HIF-1的表達(dá)，并且通過(guò)MEKI/ERK和PI-3K/Akt兩條通路發(fā)揮作用[9]。

由于bFGF屬于生物活性蛋白，對(duì)熱和酸敏感，在體內(nèi)不穩(wěn)定易被蛋白酶分解，導(dǎo)致生物學(xué)效應(yīng)不能充分發(fā)揮；HIF-1在正常氧狀態(tài)下易被體內(nèi)細(xì)胞漿的泛素蛋白水解系統(tǒng)降解，應(yīng)用藥物的緩釋制劑可解決以上的問(wèn)題。王璐等[10]研究局部注射bFGF復(fù)合明膠微囊對(duì)大鼠背部任意皮瓣存活的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)bFGF明膠微囊可提高皮瓣的成活率?；蛑委熓悄壳把芯康臒狳c(diǎn)領(lǐng)域，但目前多采用病毒載體轉(zhuǎn)染，如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，雖取得了一定成功，但是一個(gè)病毒載體只能轉(zhuǎn)染一個(gè)目的基因，轉(zhuǎn)染效率較低，并且在表達(dá)時(shí)間、免疫反應(yīng)及安全性等方面存在諸多問(wèn)題。Leong等[10]在1998年創(chuàng)立了納米微囊包裹非病毒載體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。殼聚糖是納米微囊結(jié)果，可將基因包裹在內(nèi)部。Corski等[11]采用殼聚糖DNA納米載體轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、腎肉瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)殼聚糖DNA納米微囊在基因轉(zhuǎn)運(yùn)中具有毒性小及細(xì)胞依賴性的特點(diǎn)。

我們?cè)O(shè)計(jì)了隨意皮瓣動(dòng)物模型，將納米微囊載體介導(dǎo)的bFGF聯(lián)合HIF-1直接注射于大鼠皮下組織。研究發(fā)現(xiàn)納米膠囊載體可以較好的控制bFGF和HIF-1的釋放。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)各組皮瓣成活率的比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的皮瓣成活率最高，與其他對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；通過(guò)對(duì)成活皮瓣進(jìn)行常規(guī)病理切片HE染色的組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠皮瓣的色澤、質(zhì)地及組織彈性均比其他對(duì)照組要好；同時(shí)血管密度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的新生血管斷面的數(shù)密度要顯著高于其他對(duì)照組。蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞目的基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組bFGF和HIF-1蛋白的表達(dá)比其他對(duì)照組更明顯。以上結(jié)果表明，應(yīng)用bFGF聯(lián)合HIF-1的基因治療要比單純應(yīng)用bFGF或HIF-1的效果理想，能顯著促進(jìn)皮瓣新生血管的形成，改善皮瓣供血，從而增加大鼠隨意皮瓣的成活率。

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An experimental study on nanoparticle mediatedapplication with bFGF and HIF-1 to increase hypoxia toleranceof random skin flap

WANG Zhixue,XIAO Jizhou,ZHAO Zhenxia,et al

(DepartmentofBurn,TheSecondRenminHospital,Liaocheng,Shandong252600,China)

ObjectiveTo investigate the impact of basic fibroblast growth factor(bFGF) and hypoxia-induced factor -1(HIF-1) mediated by nanoparticleon hypoxia tolerance of random skinflap in rats.MethodsWe designedone random skin flap of 6cm×2cm on the back of SD rat(n=40).Then rats were randomized into four groups:group A as the experimental group with application of bFGF and HIF-1;group Bas the first control group with soleapplication ofbFGF;group C as the second control group with sole application of HIF-1 and group D as blank control group with application of normal saline only.ResultsThe exprimental group which was mediated bynanoparticle,compared with the other control groups,achieved higher survival rate of skin flap.ConclusionsGene therapy with bFGF and HIF-1 mediated by nanoparticle can promote the neovascularization in skinflap,enhance the hypoxia tolerance and increase the survival rate of random skin flap of rats.

Surgical flaps；Nanocapsules；Fibroblast growth factors；Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator；Neovascularization,physiologic；Rats

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.008

2016-03-18，

2016-06-21)