楊建香

（桂林師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報編輯部，廣西桂林541001）

南海紅樹林內(nèi)生真菌Sk-4代謝產(chǎn)物研究

楊建香

（桂林師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報編輯部，廣西桂林541001）

研究南海紅樹林內(nèi)生真菌Sk-4的代謝產(chǎn)物。方法：采用硅膠柱色譜法、凝膠色譜法（Sephadex LH-20）、TLC（薄層層析法）等進行分離純化，并通過氫譜、碳譜、質(zhì)譜等數(shù)據(jù)分析鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果：分離出四個化合物從紅樹內(nèi)生真菌的菌體中。經(jīng)波譜解析，分別為：（1）大黃素-9，10-蒽二酮；（2）Curvularin；（3）5，5’-氧-二亞甲基-雙（2-呋喃甲醛）；（4）3，8-二羥基-6-甲基-9-氧-9H-氧雜蒽-1-羧酸酯。結(jié)論：四個化合物均首次從南海紅樹林內(nèi)生真菌Sk-4中分離得到。

紅樹林；內(nèi)生真菌；代謝產(chǎn)物

人類生存的星球的75%的表面被海水覆蓋，海洋是地球上生物資源最豐富的領(lǐng)域，也是萬物的生命之源。特殊的海洋環(huán)境造就了海洋生物種類的特殊性。海洋生物的一個重要類群是海洋真菌，海洋真菌是一塊具有極大開發(fā)潛力的新領(lǐng)域，可以孕育出種類繁多且結(jié)構(gòu)特異的新型藥理活性代謝產(chǎn)物。

海洋真菌中的紅樹林，由于特殊的生長環(huán)境，已經(jīng)成為海內(nèi)外專家尋找先導(dǎo)化合物的重要途徑。紅樹林內(nèi)生真菌更是構(gòu)成了海洋真菌中非常重要的類群。［1］紅樹林內(nèi)生真菌由于其獨特的遺傳背景和代謝途徑使得其代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)出化合物結(jié)構(gòu)新穎、種類繁多、生物活性多樣化的特點。［2］我國廣州中山大學(xué)林永成課題組率先開展了紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的研究，在新藥的開發(fā)研究方面取得了非常重要的突破。

本文通過對南海紅樹林內(nèi)生真菌SK-4的次級代謝產(chǎn)物進行系統(tǒng)的研究，結(jié)果首次從該紅樹林內(nèi)生真菌的菌體中分離得到四個化合物，通過質(zhì)譜、核磁波譜數(shù)據(jù)分析，鑒定出該化合物分別為：（1）大黃素－9，10-蒽二酮；（2）Curvularin；（3）5，5’-氧-二亞甲基-雙（2-呋喃甲醛）；（4）3，8-二羥基-6-甲基-9-氧-9H-氧雜蒽-1-羧酸酯。

一、實驗部分

（一）儀器和試劑

柱層析硅膠（300-400目）（青島裕民源硅膠試劑廠生產(chǎn)），薄層層析硅膠（GF254）（青島基億達硅膠試劑有限公司生產(chǎn)）；柱層析反相硅膠Rp-C18（40-60μm）（上海博勢生物科技有限公司生產(chǎn)），柱層析凝膠（Sephadex LH-20）（北京綠百草科技有限公司生產(chǎn)）。RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司生產(chǎn)）。Bruker-500核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司生產(chǎn)），Thermo DSQ電子轟擊電離質(zhì)譜儀（美國Thermo公司生產(chǎn)）。實驗中所用的甲醇、石油醚、乙酸乙酯等均為分析純試劑。

（二）菌種培養(yǎng)

紅樹林內(nèi)生真菌SK-4采自廣東省湛江市，采用土豆（土豆需要削皮，切碎）、大米、葡萄糖和酵母膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基，首先在一個大型的圓口的塑料桶中量取普通自來水50升，然后用電子天平秤取土豆6（Kg）、大米5（（Kg）、葡萄糖10（Kg）和酵母膏1（Kg），分別加入水中，用木棒反復(fù)攪拌，并調(diào)節(jié)該溶液為中性。裝250mL培養(yǎng)基于500mL的三角瓶內(nèi)，然后在常壓下滅菌35 min。

在紫外照射下殺菌30min后，開始接種45升，在恒溫搖床上培養(yǎng)30天后開始收集培養(yǎng)液和菌體。

（三）提取與分離

將所得的培養(yǎng)液和菌體采用紗布過濾，在培養(yǎng)液中加入等體積的乙酸乙酯反復(fù)萃取，至少5次，上層萃取液濃縮成浸膏過柱。菌體曬干后，加入甲醇浸泡，至少浸泡5次，將所得的浸泡液濃縮，結(jié)果獲得甲醇濃縮液30克。將獲得的濃縮液中加入柱層析硅膠（300-400目）100克，進行反復(fù)多次柱層析分離，以石油醚：乙酸乙酯（10：90，20：80，30：70，40：60，50：50）梯度洗脫，薄層層析法多次分離。最終分離出四個化合物，并通過電子分析天平稱量，獲得化合物1（12.05mg），化合物2（5.05mg），化合物3（8.10mg）和化合物4（5.45mg）。并通過電子轟擊質(zhì)譜、核磁波譜數(shù)據(jù)等方法鑒定出化合物的結(jié)構(gòu)。

（四）化合物的實驗數(shù)據(jù)

化合物1：紅色結(jié)晶，1HNMR（Acetone-d6，500MHz）：δ7.18（1H，d，1.4Hz），6.87（1H，d，2.6Hz），6.75（1H，d，1.4 Hz），6.30（1H，d，2.6Hz），2.12（3H，s），12.60（1H，s），12.10（1H，s），9.98（1H，s）；13CNMR（Acetone-d6，500MHz）：188.5（C），179.3（C），163.4（C），163.1（C），160.2（C），146.4（C），133.4（C），131.1（C），122.2（CH），118.3（CH），111.2（C），108.2（C），106.6（CH），105.7（CH），15.0（CH3）。

化合物2：無色結(jié)晶，1HNMR（CDCL3，400 MHz）：6.16（1 H，d，1.6 Hz），6.11（1 H，d，1.6 Hz），4.68（1 H，m），3.56（1 H，d，J=14.8 Hz），3.47（1 H，d，J=14.8 Hz），2.86（1 H，m），2.51（1 H，d，m），1.51（1 H，m），1.371 H，m），1.29（1 H，m），1.23（1 H，m），1.20（1 H，m），1.17（1 H，m），1.06（1 H，m），1.02（1 H，m），0.88（3 H，d，J=5.8 Hz），12.13（1 H，s），9.71（1 H，s）；13CNMR data（CDCL3，400 MHz）：202.5（C），171.7（C）160.8（C）159.0（C），137.7（C），122.0（CH），113.0（C），103.2（CH），73.3（CH），44.4（CH2），40.4（CH2），33.6（CH2），28.2（CH2），25.3（CH2），24.1（CH2），21.3（CH3）。

化合物3：白色粉末，1HNMR（CDCL3，400 MHz）：6.96（1H，d，J=7.5 Hz），6.28（1H，d，J=7.5 Hz），4.25（2H，s），8.95（1H，s）；13CNMR（CDCL3，400MHz）：δC180.2（CH），160.2（C），150.8（C），120.9（CH），116.5（CH），60.7（CH2）。EIMS：m/z 254。

化合物4：白色晶體，EIMS：m/z 300。1HNMR（CDCL3，400 MHz）：δH 6.85（1H，d，J=2.4Hz），6.76（1H，d，J=，2.4Hz），6.49（1H，d，J=2.4Hz），6.66（1H，d，J=2.4Hz），3.80（3H，s），2.30（3H，s），12.40（1H），10.30（1H）；13C NMR（CDCL3，400 MHz）：δC181.4（C），170.1（C），165.4（C），163.1（C），162.0（C），158.6（C），153.6（C），138.7（C），115.4（CH），115.0（CH），114.0（C），110.0（CH），109.0（C），106.1（CH），63.8（CH3），25.3（CH3）。

二、結(jié)果與討論

化合物1：紅色針狀結(jié)晶，通過電子轟擊質(zhì)譜（EIMS）顯示化合物的分子量為270，再結(jié)合核磁波譜以及DEPT譜推斷出該化合物的分子式為C15H10O5，不飽和度為11。從1HNMR中可以看出該化合物有兩個螯合的酚羥基（δ 12.60和12.10），說明這兩個酚羥基與酮羰基形成分子內(nèi)氫鍵，一個酚羥基（δ 9.98），另外δ 7.18（1H，d，1.4Hz）和6.75（1H，d，1.4 Hz）與δ 6.87（1H，d，2.6Hz）和δ 6.30（1H，d，2.6Hz），通過H的化學(xué)位移以及他們之間的偶爾常數(shù)，推斷出這四個H屬于苯環(huán)上的芳香H質(zhì)子，且他們處于間位，δ2.12（3H，s）說明該化合物中存在一個甲基。13CNMR中，δ 188.5，179.3說明化合物中存在明顯的兩個酮羰基，再結(jié)合δ163.4（C），163.1（C），160.2（C），146.4（C），133.4（C），131.1（C），122.2（CH），118.3（CH），111.2（C），108.2（C），106.6（CH），105.7（CH）說明該化合物是一個典型的蒽醌類結(jié)構(gòu)。通過與參考文獻［3］對照，確定該化合物是大黃素－9，10-蒽二酮。

化合物2：無色的固體，電子轟擊質(zhì)譜（EIMS）顯示出化合物的分子量為292，再結(jié)合1HNMR譜中顯示化合物中有20個H信號、13CNMR譜顯示該化合物有16個C信號，從而推斷出該化合物的分子式為：C16H20O5，不飽和度為7；1HNMR譜顯示出該化合物有兩個酚羥基，其中一個是螯合的酚羥基δ12.13（1H，s），另一個為普通的酚羥基δ9.71（1H，s），δ6.16（1H，d，1.6 Hz））和6.11（1 H，d，J=1.6 Hz）顯示是苯環(huán)上的氫，且通過耦合常數(shù)推斷屬于間位氫，13CNMR顯示化合物中存在一個酮羰基（δ202.5），一個酯基（δ171.7），一個甲基（δ21.3），以及DEPT譜顯示該化合物中有6個CH2，3個CH，6個季碳。結(jié)合1HNMR譜，δ4.68（1H，m），δ 3.56（1H，d，J=15.7 Hz）和3.47（1H，d，J=15.7 Hz），2.86（1H，m）和2.51（1H，d，m）；1.51（1H，m）和1.37（1H，m）；1.29（1H，m）和1.23（1H，m）；1.20（1H，m）和1.17（1H，m）；1.06（1H，m）和1.02（1H，m）；以及13CNMR譜，δ73.3（CH），δ 44.4（CH2），40.4（CH2），33.6（CH2），28.2（CH2），25.3（CH2），24.1（CH2）說明化合物中有一個大環(huán)內(nèi)酯。將核磁數(shù)據(jù)與參考文獻［4-5］對照，基本一致，所以推斷該化合物為：Curvularin。

化合物3：白色結(jié)晶，通過質(zhì)譜（EIMS）顯示出該化合物的分子離子峰為234，推斷出化合物的分子量為234，但是1HNMR譜顯示化合物中有5個H，13CNMR譜中顯示化合物有6個C，這樣初步推斷出該化合物為對稱結(jié)構(gòu)，化合物的分子式為：C12H10O5，不飽和度為8，DEPT譜顯示化合物有2個季碳，3個CH，1個CH2。由于該化合物是對稱結(jié)構(gòu)，說明化合物中有4個季碳，6個CH，2個CH2。1HNMR譜中顯示化合物中有一個醛基δH 8.95（1H，s），δ 6.96（1H，d，J= 7.5 Hz）和δ 6.28（1H，d，J=7.5 Hz）顯示為烯氫，通過耦合常數(shù)推斷為相鄰的烯氫。另外有一個連有氧原子的亞甲基δ 4.25（2H，s）。再結(jié)合相關(guān)的13CNMR數(shù)據(jù)，δC180.2（CH），160.2（C），150.8（C），120.9（CH），116.5（CH），60.7（CH2）。推斷出該化合物是一個醚類結(jié)構(gòu)。根據(jù)上述波譜數(shù)據(jù)并與參考文獻［6］對照，基本一致。

化和物4：白色固體，電子轟擊質(zhì)譜（EIMS）顯示化合物的分子量為300，再根據(jù)1HNMR、13CNMR和DEPT譜推斷出化合物的分子式為C16H12O6，不飽和度為11。1HNMR譜顯示有兩個酚羥基，其中一個為螯合的酚羥基（δH12.4），另一個普通的酚羥基（δH10.3），δ6.85（1H，d，J=2.4Hz）和6.76（1H，d，J=，2.4Hz）以及，6.66（1H，d，J=2.4Hz）和6.49（1H，d，J=2.4Hz），從氫質(zhì)子的化學(xué)位移以及耦合常數(shù)推斷出為苯環(huán)中的間位氫。且存在兩個苯環(huán)。δ3.80（3H，s）和2.30（3H，s）顯示化合物中存在兩個甲基，且前一個甲基與氧原子相連。13CNMR譜中，顯示化合物中存在一個酮羰基（δ181.4），一個酯基（δ170.1），通過以上數(shù)據(jù)的推斷，得知化合物的不飽和度為10，而該化合物的不飽和度為11，說明存在一個環(huán)。根據(jù)上述數(shù)據(jù)，并與參考文獻對照［7］，確定化合物為3，8-二羥基-6-甲基-9-氧-9H-氧雜蒽-1-羧酸酯。

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Metabolites of Mangrove Endophytic Fungus Sk-2 from the South China Sea

Yang Jianxiang
（Editorial Department of Journal of Guilin Normal College，Guilin，Guangxi 541001，China）

Objective：To study the secondary metabolites of mangrove endophytic fungus No·Sk-4 from the south china sea.Method：The compounds were isolated by column chromatography and identified on the basis of physic-chemical constants and spectral analysis.Result：Four metabolites were obtained and elucidated as 1，3，8-trihydroxy-6-methyl-9，10-anthraquinone（1），Curvularin（2），5，5'-oxydimethylene-bis（2-fur-aldehyde）（3），3，8-dihydroxy-6-methyl-9-oxo-9H-xanthene-1-carboxylate（4）.Conclusion：The four metabolites were obtained from endophytic fungus No·Sk-4 for the first time.

mangrove；endophytic fungus；metabolites

O629

A

1001-7070（2016）03-0137-03

（責(zé)任編輯：韋國友）

2016-03-05

廣西教育廳科研項目“三種中國南海紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物研究”（項目編號：KY2015LX598）。

楊建香（1979-），女，山西原平人，桂林師范高等?？茖W(xué)校教授、博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。