潘如金

(江蘇省中醫(yī)院　藥學(xué)部，江蘇　南京　210029)

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甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物制備工藝優(yōu)化與質(zhì)量評(píng)價(jià)

潘如金

(江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南京210029)

目的：優(yōu)化甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物的制備工藝，并探索其對(duì)提高甲硝唑水溶性、化學(xué)穩(wěn)定性等方面的影響。方法：用飽和水溶液法制備包合物，以包合物的包合率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)其包合工藝進(jìn)行優(yōu)化以確定最佳制備工藝。結(jié)果：最佳制備工藝為：包合溫度49 ℃，包合時(shí)間1.85 h，β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比1.4 ∶1，包合物的包合率為72.54%。結(jié)論：通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化制得的甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物，物理化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，能夠明顯提高甲硝唑的水溶性，選用的模型合理有效。

甲硝唑；響應(yīng)面法；β-環(huán)糊精；包合物；質(zhì)量評(píng)價(jià)

甲硝唑(Metronidazole，MNZ)是一種硝基咪唑類藥物，對(duì)于滴蟲(chóng)和阿米巴病有顯著的治療作用，對(duì)厭氧菌具有確切的抑制效果已被最近幾年的研究證實(shí)，而且在內(nèi)科，外科和口腔科的應(yīng)用也非常廣泛[1]，而由于水溶性較低，穩(wěn)定性差等因素使得甲硝唑在制劑生產(chǎn)與臨床應(yīng)用等過(guò)程產(chǎn)生了多方面的限制[2-3]。β-環(huán)糊精(β-Cyclodextrin, β-CD)擁有特殊的空腔分子結(jié)構(gòu)，其分子外部可親水而內(nèi)部疏水，在范德華力作用下能夠把一些不具有生物相容性的藥物分子包合于其分子空腔中，從而形成類分子膠囊樣的包合物[4]，既可增加藥物的生物相容性，又能起到緩釋作用。將甲硝唑包合于其分子的空腔結(jié)構(gòu)中有助于提高其水溶性并改善穩(wěn)定性。

響應(yīng)面法是是數(shù)學(xué)方法與統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合的產(chǎn)物，可用于對(duì)受多個(gè)變量影響的響應(yīng)值進(jìn)行建模和分析，最終目的為優(yōu)化該響應(yīng)值。響應(yīng)面法的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)是通過(guò)設(shè)計(jì)合理的有限次數(shù)試驗(yàn)，建立一個(gè)包括各顯著因素的一次項(xiàng)平方項(xiàng)和任何兩個(gè)因素之間的一級(jí)交互作用項(xiàng)的數(shù)學(xué)模型，從而擬合出因素與響應(yīng)值間的全局函數(shù)關(guān)系，有助于快速建模，縮短優(yōu)化時(shí)間和提高應(yīng)用可信度。然后通過(guò)對(duì)函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，對(duì)影響響應(yīng)值的各因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件[5]。本試驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)影響甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物制備工藝的主要因素進(jìn)行考察與優(yōu)化，并探索其對(duì)提高甲硝唑水溶性、化學(xué)穩(wěn)定性等方面的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甲硝唑原料和甲硝唑?qū)φ掌?批號(hào)：101910-201507，株洲遠(yuǎn)成合中科技發(fā)展有限公司)；β-環(huán)糊精(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其他常規(guī)試劑均為分析純，購(gòu)至國(guó)藥試劑公司。

1.2儀器與設(shè)備

TU-1950型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；E103型生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；HDM-500D型數(shù)顯攪拌電熱套(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1包合物的制備精密稱取β-環(huán)糊精處方量，置于100 mL的燒杯中，加入蒸餾水適量并輕微攪拌使成β-環(huán)糊精的飽和溶液[6]。將含有磁子的燒杯置于電熱套中低速攪拌并加熱至規(guī)定溫度。將20 mL無(wú)水乙醇加熱至50 ℃，精密稱取處方量甲硝唑并加至無(wú)水乙醇中，待甲硝唑完全溶解后，逐滴緩慢加入到上述β-環(huán)糊精飽和溶液中，并調(diào)整至適當(dāng)轉(zhuǎn)速。攪拌至規(guī)定時(shí)間后，將燒杯連同試液置于冰箱中冷藏18 h，抽濾后用0.01 mol/L鹽酸溶液立即沖洗3遍以除去未被包合的甲硝唑。將抽濾獲得的沉淀物置于60℃真空干燥箱中干燥3 h，即得甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物。

1.3.2包合率的計(jì)算將制得的甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物置于研缽中，用研杵研磨成粉末狀后，過(guò)120目篩網(wǎng)，精密稱取研碎后的粉末10.0 mg置于25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容、搖勻，待加入的包合物粉末全部溶解后，用0.1 mol/L鹽酸溶液作為空白對(duì)照，在267.50 nm波長(zhǎng)處測(cè)量溶液的吸光度[7-8]，把測(cè)定結(jié)果代入回歸曲線，以計(jì)算所制包合物中甲硝唑的含量和甲硝唑包合率。

1.3.3試驗(yàn)方法分別考察包合溫度、β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比和包合時(shí)間三個(gè)因素對(duì)包合物制備產(chǎn)生的影響，并以包合率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化。

1.3.4包合物的顯微鑒別取適量甲硝唑、β-環(huán)糊精、甲硝唑和β-環(huán)糊精混合物、甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物分別溶于60℃的水溶液中使成飽和溶液，待完全溶解后在室溫條件下進(jìn)行自然降溫，冷卻至室溫后溶液中形成的晶體經(jīng)過(guò)濾、干燥、制片后置于顯微鏡下觀察結(jié)晶的形態(tài)[9]。

2　結(jié)果與分析

2.1含量檢測(cè)方法學(xué)

精密稱取甲硝唑?qū)φ掌?0 mg于100 mL的容量瓶中，再加入0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解并定容，搖勻后作為標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)液5.0 mL置于50 ml容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容并搖勻作為測(cè)試液；用0.1mol/L鹽酸溶液作為空白對(duì)照，按照分光光度法在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明甲硝唑在276.50 nm處有最大紫外吸收，而環(huán)糊精輔料在此波長(zhǎng)處對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容，在276.50 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度，以濃度對(duì)吸光度進(jìn)行線性回歸所得回歸方程為：Abs=0.03277C+0.00395，r=0.9999。由此可見(jiàn)在所涉及到的甲硝唑溶液濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好[10]，實(shí)驗(yàn)精密度、穩(wěn)定性和回收率實(shí)驗(yàn)符合要求。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1包合溫度對(duì)甲硝唑包合率的影響取甲硝唑0.79 g，β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比1 ∶1，包合時(shí)間1.5 h，中包合物制備方法進(jìn)行制備?？疾觳煌蠝囟葘?duì)甲硝唑包合率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，在溫度25～45 ℃之間時(shí)，甲硝唑的包合率隨溫度的升高而增加，而溫度繼續(xù)升高超過(guò)45 ℃時(shí)包合率開(kāi)始逐漸下降，因此包合溫度選取45 ℃較為適宜。

圖1　溫度對(duì)包合物包合率的影響

圖2　摩爾比對(duì)包合物包合率的影響

2.2.2摩爾比對(duì)甲硝唑包合率的影響將包合溫度設(shè)為45 ℃，包合時(shí)間為1.5 h，按包合物制備方法進(jìn)行制備。考察不同的β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比對(duì)甲硝唑包合率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比由1 ∶2增加到5 ∶4的過(guò)程中，甲硝唑的包合率逐漸增加，而在β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比超過(guò)5 ∶4之后，包合率開(kāi)始明顯降低，因此β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比選取5 ∶4較為適宜。

2.2.3包合時(shí)間對(duì)甲硝唑包合率的影響取甲硝唑0.79 g，β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比5 ∶4，包合溫度為45℃，按包合物制備方法進(jìn)行制備?？疾觳煌蠝囟葘?duì)甲硝唑包合率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)，甲硝唑的包合率顯著增加，而當(dāng)時(shí)間超過(guò)1.5 h后，包合率則會(huì)緩慢下降，因此包合時(shí)間選取1.5 h較為適宜。

圖3　包合時(shí)間對(duì)包合物包合率的影響

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝試驗(yàn)及分析

2.3.1數(shù)據(jù)模型的建立以單因素試驗(yàn)結(jié)果作為基礎(chǔ)，選擇包合溫度、β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比和包合時(shí)間三個(gè)因素作為考察對(duì)象，按照Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法按3因素3水平對(duì)甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物制備工藝進(jìn)行優(yōu)化[11]。設(shè)計(jì)的因素及水平見(jiàn)表1，采用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)試驗(yàn)因素進(jìn)行設(shè)計(jì)并對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，結(jié)果見(jiàn)表2。以包合率(Y)作為因變量，β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比(A)、包合溫度(B)、包合時(shí)間(C)為自變量。所建立的回歸曲線方程為：

Y=-139.36+177.76*A+2.50*B+29.57*C+1.26*AB+12.42*AC+0.31*BC-95.36*A2-0.05*B2-16.80*C2

表1　響應(yīng)面法因素水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2　響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3　回歸方程的方差分析

注：*** 表示差異極顯著(<0.001)；** 表示差異高度顯著(<0.01)；* 表示差異顯著(<0.05)。

根據(jù)表3能夠得出，考察因素對(duì)甲硝唑包合率產(chǎn)生影響程度的次序?yàn)椋篊>A>B，即包合時(shí)間>β-環(huán)糊精-甲硝唑摩爾比>包合溫度。由方差分析得出的數(shù)據(jù)可知，該模型的p<0.0001，模型極顯著。失擬項(xiàng)p= 0.3255> 0.05，較正相關(guān)系數(shù)平方R2= 0.9130，可說(shuō)明此模型和實(shí)際擬合程度的誤差比較小且能夠用于分析與預(yù)測(cè)β-環(huán)糊精包合甲硝唑的工藝水平。因此可認(rèn)為以上所得二次回歸方程模型較為合適。

2.3.2響應(yīng)曲面分析在對(duì)模型的響應(yīng)曲面和其對(duì)應(yīng)的等高線圖進(jìn)行分析之后，能夠得知影響因素之間的交互作用及其對(duì)于包合率的作用情況。對(duì)最佳條件進(jìn)行預(yù)測(cè)和驗(yàn)證即可得知甲硝唑包合物制備的最優(yōu)工藝條件。所建立模型的響應(yīng)曲面及其等高線圖見(jiàn)圖4-6。

圖4　包合溫度與摩爾比對(duì)藥物包合率的交互影響

圖5　包合時(shí)間與包合溫度對(duì)藥物包合率的交互影響

通過(guò)對(duì)甲硝唑包合物制備工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化所得的最優(yōu)工藝條件為：A=1.38，B=49.32，C=1.85，即所得最優(yōu)工藝為：β-環(huán)糊精/甲硝唑摩爾比為1.38，包合溫度為49.32℃，包合時(shí)間為1.85 h。在此條件下模型預(yù)測(cè)包合率最優(yōu)結(jié)果為72.10%；為便于實(shí)際操作對(duì)此工藝進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，取β-環(huán)糊精/甲硝唑摩爾比為1.4，包合溫度為49 ℃，包合時(shí)間為1.85 h。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)所得包合率均值為72.54 %，與預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)相差0.61%，能夠證明回歸模型擬合結(jié)果較好。預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果基本沒(méi)有差異，回歸方程在實(shí)際應(yīng)用中可顯示各個(gè)因素的作用。所以運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物制備工藝是可行的。

2.4包合物的穩(wěn)定性考察

取甲硝唑原料藥適量，精密稱定，再稱取相當(dāng)量的甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物，分別倒入相同的試管中后，暴露于日光條件下放置5 d，并詳細(xì)記錄?？捎^察到試管中甲硝唑原料藥顏色明顯變黃，而甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物的顏色并未發(fā)生明顯的變化。

分別稱取甲硝唑原料藥和甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物10 mg于100 ml的容量瓶中，加水溶解并定容。置于室溫條件下，然后分別在第0、1、2、3、4、5、6 d測(cè)定吸光度，計(jì)算溶液中藥物的含量變化情況。所得結(jié)果見(jiàn)圖7，從圖中可知將甲硝唑包合于β-環(huán)糊精后穩(wěn)定性可大大提高。

圖7　甲硝唑、甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物穩(wěn)定性結(jié)果

2.5溶解度測(cè)定與結(jié)果

稱取甲硝唑與制得的甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物5 mg分別置于100 mL量筒中，于25 ℃條件下逐滴滴加蒸餾水，每隔5 min強(qiáng)力振搖30 s；觀察30 min內(nèi)的溶解情況，直至無(wú)目視可見(jiàn)的溶質(zhì)顆粒[12]。測(cè)定結(jié)果表明甲硝唑經(jīng)β-環(huán)糊精包合后其水溶性是未經(jīng)包合的2.18倍。

2.6包合物的顯微鑒別

按1.3.4中鑒別方法對(duì)所制備包合物進(jìn)行顯微鑒別，結(jié)果見(jiàn)圖8。從圖中可以看出，甲硝唑、β-環(huán)糊精、甲硝唑和β-環(huán)糊精混合物經(jīng)過(guò)重結(jié)晶后其晶體分別呈長(zhǎng)針形、方塊形、長(zhǎng)針形與方塊形的混合且顏色較淺幾乎透明，可知兩者的簡(jiǎn)單混合并未發(fā)生相互作用，而甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物經(jīng)重結(jié)晶后呈無(wú)規(guī)則塊狀、顏色較深，與其它三者明顯不同，生成了新的產(chǎn)物，即甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物。

圖8　各組分的顯微結(jié)晶圖(a: MNZ; b: β-CD; c: MNZ 與β-CD; d: MNZ-β-CD 包合物)

3　結(jié)論與討論

關(guān)于響應(yīng)面法優(yōu)化硝唑類藥物環(huán)糊精包合物制備工藝的報(bào)道多有涉及，但未發(fā)現(xiàn)優(yōu)化甲硝唑包合物的報(bào)道[13]。本試驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)影響甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物制備工藝的關(guān)鍵因素進(jìn)行了考察和優(yōu)化，對(duì)所制備的包合物進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)將甲硝唑制成包合物后可明顯提升其穩(wěn)定性，這些結(jié)果將有利于甲硝唑制劑的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。

在多數(shù)與甲硝唑結(jié)構(gòu)類似藥物包合物包合工藝優(yōu)化過(guò)程中，當(dāng)攪拌速度調(diào)節(jié)至一定范圍內(nèi)時(shí)其對(duì)包合工藝的產(chǎn)生的影響幾乎可以忽略，如鄒國(guó)省等用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化替硝唑環(huán)糊精包合物的制備工藝[14]；伍永富等Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化木犀草素-β-環(huán)糊精包合物的制備工藝[15]。而且由于實(shí)驗(yàn)室中現(xiàn)有攪拌電熱套功能條件的限制，所以在本試驗(yàn)中將攪拌速度調(diào)節(jié)統(tǒng)一至一定轉(zhuǎn)速后沒(méi)有繼續(xù)考察攪拌速度對(duì)甲硝唑包合率的影響。

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化甲硝唑-β-環(huán)糊精包合物制備工藝所得的最佳條件能有效提高包合物中甲硝唑的包合率，明顯改善甲硝唑的水溶性和穩(wěn)定性，并為其制劑的工業(yè)化生產(chǎn)及臨床應(yīng)用提供了一定依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：馬世堂)

Optimization of Preparation Technology and Quality Evaluation of Metronidazole -beta- Cyclodextrin Inclusion Compound

PAN Ru-jin

(Pharmacy Department, Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine , Nanjing 210029, China)

Objective: To optimize the preparation technology of MNZ-β-CD inclusion compound according to the characteristics of β-CD, and to explore its effect on improving the water solubility, chemical stability and so on. Method: the inclusion compound was prepared by the method of saturated aqueous solution, and the entrapment efficiency of inclusion compound was used as the evaluation index, and the method of response surface design was used to optimize the preparation process. Result: the optimal processing parameters were: 49 ℃, the mixing time=1.85 h, β-CD ∶MNZ=1.4 ∶1, the entrapment efficiency of inclusion compound was 72.54%. Conclusion: The adopted model was reasonable and effective. The physical and chemical properties of MNZ-β-CD inclusion compound were optimized by Box-Behnken surface response design method which was stable.

Metronidazole; Response surface method; Cyclodextrin; Inclusion compound; Quality evaluation

2016-04-01

江蘇省中醫(yī)藥局基金項(xiàng)目(LZ13061)。

潘如金(1969-)，男，江蘇省南京市人，主管藥師，主要從事中藥學(xué)研究。

R944

A

1673-8772(2016)04-0035-07