蔣超　王以朋　邱貴興　吳志宏　翁習(xí)生

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京100730）

·基礎(chǔ)研究·

晚期骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨下松質(zhì)骨祖細(xì)胞的特性研究

蔣超王以朋邱貴興吳志宏翁習(xí)生*

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京100730）

背景：骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又名退行性骨關(guān)節(jié)病，對其治療目前局限于早期的保守治療和晚期的關(guān)節(jié)置換。晚期OA患者軟骨下是否具有間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstem cells，MSCs）決定了骨髓刺激技術(shù)可否用于晚期軟骨缺損為主要表現(xiàn)的OA患者。但晚期OA患者軟骨下松質(zhì)骨是否具有MSCs仍不明確。目的：探討晚期OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨下是否具有成軟骨分化能力的松質(zhì)骨祖細(xì)胞，為晚期膝OA患者軟骨自身修復(fù)的研究奠定基礎(chǔ)。方法：5例因晚期膝OA行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的術(shù)中標(biāo)本，取其軟骨下松質(zhì)骨，經(jīng)分離培養(yǎng)后得到貼壁細(xì)胞，傳代培養(yǎng)后行流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面抗原；成骨、成脂、成軟骨分化后分別行堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅染色、油紅O染色、阿利新藍(lán)、Ⅱ型膠原和聚蛋白聚糖組織化學(xué)染色，Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、聚蛋白聚糖及SOX-9基因表達(dá)水平實(shí)時(shí)聚合酶連反應(yīng)（Real-Time PCR，RT-PCR）測定。結(jié)果：從晚期膝OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨下松質(zhì)骨內(nèi)獲得的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原基本符合MSCs標(biāo)準(zhǔn)，且具有成骨、成脂、成軟骨分化能力。結(jié)論：晚期OA患者軟骨下存在具有干細(xì)胞性質(zhì)、可進(jìn)行體外成軟骨分化的松質(zhì)骨祖細(xì)胞。該發(fā)現(xiàn)可為“一步式——微骨折處理-成軟骨誘導(dǎo)材料填充-軟骨修復(fù)”治療理念提供一定依據(jù)。

骨關(guān)節(jié)炎；間質(zhì)干細(xì)胞；軟骨細(xì)胞

【Abstract】Background:Bonemarrow stimulation can be used in end-stage osteoarthritis patients in w hom cartilage defects mainly presents only when there weremesenchymal stem cells（MSCs）in the subchondral zone of the knee.But the existence of MSCs in the end-stage osteoarthritis patients is still unknown.Objective:To analyzemulti-differentiation capacity of cells derived from human subchondral bone in patientsw ith end-stage knee osteoarthritis.Methods:Human progenitor cellsw ere isolated and derived from subchondral cortico-spongious bone chips from 5 patientsundergoing total knee arthroplasty due to end-stage osteoarthritis.Mesenchymalstem cell related cell surface antigenswere analyzed by flow cytometry. A fter in vitro osteogenic，adipogenic and chondrogenic differentiation，alkaline phosphatase activity，Alizarin red staining，Oil Red O staining，A lcian blue staining and immunohistochem ical staining for collagenⅡand Aggrecan w ere conducted. Real-time PCRwasperformed to confirm related geneexpression of chondrogenic differentiation，such ascollagenⅠ，collagenⅡ，Aggrecan and SOX-9.Results:Surface antigens of successfully-cultured cells from subchondral cortico-spongious bone chipsw ere almost in accord w ith those of MSCs.And the cells had the ability of osteogenic，adipogenic and chondrogenic differentiation.Conclusions:Multi-potential progenitor cells do exist in subchondralbone in the kneeof patientswith end-stageosteoarthritis.

【Keywords】Osteoarthritis；Mesenchymal Stem Cells；Chondrocytes

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又名退行性骨關(guān)節(jié)病，是世界范圍內(nèi)的慢性致殘性疾病之一［1］。其具體發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，但關(guān)節(jié)面軟骨破壞是其主要病理改變。目前對于晚期OA患者，行關(guān)節(jié)置換術(shù)是緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)功能的唯一有效治療方案，但存在嚴(yán)重不良反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)。對于早期OA及其他病因?qū)е碌能浌侨睋p，臨床上多采用骨髓刺激技術(shù)比如微創(chuàng)微骨折處理［2，3］，該技術(shù)通過打通骨髓和軟骨缺損表面，幫助間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstem cells， MSCs）從骨髓遷移到軟骨缺損區(qū)進(jìn)行成軟骨分化，從而修復(fù)缺損區(qū)。盡管既往的臨床經(jīng)驗(yàn)和研究不建議該技術(shù)用于晚期OA患者的治療［4，5］，但隨著近些年國內(nèi)外對MSCs的研究越來越深入，各種促軟骨分化誘導(dǎo)因子和材料被發(fā)現(xiàn)，使通過細(xì)胞組織工程技術(shù)修復(fù)晚期OA患者軟骨缺損成為可能［6-13］。如能證實(shí)晚期OA患者關(guān)節(jié)軟骨下存在具有成軟骨分化能力的松質(zhì)骨祖細(xì)胞，將為該治療方法提供進(jìn)一步的基礎(chǔ)和理論依據(jù)，從而提供可能的“一步式——微骨折處理-成軟骨誘導(dǎo)材料填充-軟骨修復(fù)”治療方法。所謂“一步式”，即一次關(guān)節(jié)鏡操作下完成軟骨缺損區(qū)的材料填充，而不需要通過骨髓獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)后再植入關(guān)節(jié)腔內(nèi)的多次操作。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)研究對象

選取2013年10月至2013年12月行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的晚期OA患者5例，其中男2例，女3例；年齡54～79歲，平均67歲；OA診斷均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會膝骨關(guān)節(jié)炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［14］，所有患者除外腫瘤、全身感染、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、血友病性關(guān)節(jié)炎等，術(shù)前12個(gè)月未進(jìn)行過有創(chuàng)的關(guān)節(jié)腔內(nèi)治療，未長期使用包括激素、免疫抑制劑等藥物，無長期抽煙、酗酒等。本實(shí)驗(yàn)使用手術(shù)廢棄組織，已通過北京協(xié)和醫(yī)院臨床試驗(yàn)倫理委員會同意。入組患者信息見表1。

表1　入組患者基本資料

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑、儀器

人成脂肪、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（R&D公司，美國）；人MSCs專用培養(yǎng)基（Science Cell公司，美國）；小鼠抗人CD146、CD45、CD90等熒光標(biāo)記的流式檢測抗體（BD公司，美國）；小鼠抗人聚蛋白聚糖（Aggrecan）抗體、Ⅱ型膠原抗體、Ⅰ型膠原抗體（Abcam公司，美國）；茜素紅、阿利新藍(lán)、油紅O染色試劑盒（Sigma公司，美國）；堿性磷酸酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；實(shí)時(shí)聚合酶連反應(yīng)（Real-Time PCR，RT-PCR）相關(guān)產(chǎn)品（Takara公司，日本）；流式細(xì)胞儀（BD公司，美國）。

1.3軟骨下松質(zhì)骨祖細(xì)胞分離及培養(yǎng)

在無菌條件下用咬骨鉗將膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)中所截取脛骨平臺及股骨髁軟骨下松質(zhì)骨處理成2～3mm大小的骨顆粒，經(jīng)PBS反復(fù)清洗除去表面所附脂肪、血液等異物。將松質(zhì)骨顆粒置于25 cm2培養(yǎng)瓶，加入7m l含10%胎牛血清、100U/m l青霉素、100mg/m l鏈霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM-高糖培養(yǎng)基，輕輕晃動使松質(zhì)骨顆粒均勻平鋪。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 d，期間不換液，直至顯微鏡下可見骨組織周圍出現(xiàn)一定數(shù)量的梭狀貼壁細(xì)胞時(shí)進(jìn)行第1次換液，并且用PBS清洗除去松質(zhì)骨顆粒，改用MSCs增殖培養(yǎng)基，每3 d換一次液。7～9 d后原代細(xì)胞鋪滿瓶底90%左右，以0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代或凍存。取第1代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面抗原流式檢測，第3代細(xì)胞行成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化。

1.4細(xì)胞表面抗原流式細(xì)胞儀檢測

取第1代細(xì)胞經(jīng)PBS清洗2次，PBS重懸濃度1×105個(gè)/μL，冰上操作，加適量小鼠抗人CD14-FITC、CD19-APC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-APC、CD105-FITC、CD146-PE、CD166-PE、HLA-DR-APC等抗體，4℃孵育30m in，用同種同型非相關(guān)IgG抗體孵育作為陰性對照。孵育完成后用含1%牛血清白蛋白的PBS清洗細(xì)胞2次，再將細(xì)胞重懸于200μL PBS上機(jī)檢測。

1.5成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化

1.5.1成骨、成脂誘導(dǎo)分化：取第3代細(xì)胞（n=5例），胰酶消化后重懸計(jì)數(shù)，參考成骨、成脂肪分化培養(yǎng)基說明書，以5×104個(gè)/孔的密度接種于含有細(xì)胞爬片的24孔板中，MSCs增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞貼壁匯合至70%～80%后改為添加成骨誘導(dǎo)因子的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d換液一次，同時(shí)設(shè)以干細(xì)胞增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為陰性對照，所加培養(yǎng)基量和操作均保持一致。誘導(dǎo)21 d后4%多聚甲醛固定，行茜素紅染色及堿性磷酸酶活性測定。同樣方法消化、計(jì)數(shù)、接種細(xì)胞與24孔板，MSCs增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞貼壁匯合至90%～100%后改添加成脂誘導(dǎo)因子的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)以干細(xì)胞增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為陰性對照，每3 d換液一次，直至誘導(dǎo)21 d，行油紅O染色檢測。

1.5.2成軟骨誘導(dǎo)分化：參考微球培養(yǎng)法［15］，同上方法將細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔濃度接種與含0.2m l干細(xì)胞增殖培養(yǎng)基的U-型底96孔板中，室溫、200 g離心5m in，隨即置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜。24 h后通過200μL移液槍沿著孔壁輕輕吹打U-型底孔板內(nèi)細(xì)胞薄膜層使其懸?。ㄗ⒁馕鹌茐募?xì)胞層完整性），隨后實(shí)驗(yàn)組改用含有成軟骨誘導(dǎo)因子的成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，對照組為干細(xì)胞增殖培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d換液一次，在此過程中細(xì)胞微球逐漸形成。誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d后行阿利新藍(lán)染色，聚蛋白聚糖（aggrecan）、人Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色。同時(shí)將同組細(xì)胞微球收集后提取總RNA，RT-PCR測定成軟骨相關(guān)基因Ⅱ型膠原、aggrecan、SOX-9和Ⅰ型膠原的表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1松質(zhì)骨祖細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞表面抗原檢測

原代松質(zhì)骨祖細(xì)胞在培養(yǎng)4～6 d后逐漸從骨組織遷移至培養(yǎng)瓶，并貼壁生長，細(xì)胞呈梭狀、成纖維細(xì)胞樣形態(tài)（圖1）。對第1代細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測，顯示增殖后的松質(zhì)骨祖細(xì)胞基本符合MSCs細(xì)胞表面抗原的相關(guān)特征［16］，即細(xì)胞基本不表達(dá)CD14（0.24%）、CD19（0.96%）、CD34（0.47%）、CD45（0.95%）、HLD-DR（0.21%），高表達(dá)CD44（98.69%）、CD73（97.94%）、CD90（99.88%）、CD166（91.46%），且CD105（6.13%）、CD146（10.41%）亦呈陽性。

圖1　A.原代松質(zhì)骨祖細(xì)胞從骨組織遷出，貼壁生長（×400）；B.第1次傳代之前細(xì)胞狀態(tài)為梭形，呈成纖維細(xì)胞樣（×100）

2.2松質(zhì)骨祖細(xì)胞成骨、成脂分化研究

將成骨、成脂肪誘導(dǎo)21 d的細(xì)胞及非誘導(dǎo)對照組細(xì)胞均分別進(jìn)行茜素紅染色和堿性磷酸酶活性監(jiān)測以驗(yàn)證其成骨分化；通過油紅O染色驗(yàn)證其成脂分化（圖2）。對比分化誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)分化組茜素紅染色（圖2A）和堿性磷酸酶活性染色均顯示陽性（圖2B），未分化組染色基本為陰性（圖2D和2E）；油紅O染色也僅在誘導(dǎo)分化組為陽性（圖2C）。顯示該松質(zhì)骨祖細(xì)胞具有明顯的成骨、成脂分化潛能。

圖2　松質(zhì)骨祖細(xì)胞行成骨、成脂分化誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組予分別行茜素紅染色（A、D）、堿性磷酸酶活性染色（B、E）和油紅O染色（C、F），顯示誘導(dǎo)組染色均呈陽性，而未誘導(dǎo)組為陰性（×100）

2.3松質(zhì)骨祖細(xì)胞成軟骨分化研究

成軟骨分化誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組均通過微球培養(yǎng)法培養(yǎng)28 d，隨后收集細(xì)胞微球包埋切片，行相關(guān)免疫組化染色和組織染色（圖3）。分化誘導(dǎo)組阿利新藍(lán)染色呈陽性（圖3A），未誘導(dǎo)組為陰性（圖3E），提示胞內(nèi)有酸性黏蛋白的出現(xiàn)，是干細(xì)胞成軟骨分化的可靠指標(biāo)之一。同時(shí)，將組織切片行蛋白聚糖、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原免疫組化染色，誘導(dǎo)組三者均成陽性（圖3B、C、D）；而未誘導(dǎo)組蛋白聚糖和Ⅱ型膠原免疫組化染色為陰性（圖3F、H），Ⅰ型膠原免疫組化染色陽性（圖3G）。

誘導(dǎo)28 d后將誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組細(xì)胞微球分別予以提總RNA，RT-PCR檢測Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrencan、SOX-9基因的mRNA表達(dá)水平（圖4），發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)較未誘導(dǎo)組下降，前者僅為后者的0.57倍；而Ⅱ型膠原、Aggrecan、SOX-9mRNA的表達(dá)較未誘導(dǎo)組顯著升高，其中Ⅱ型膠原表達(dá)量前者為后者的88.11倍，Aggrecan表達(dá)量前者為后者54.04倍，SOX-9表達(dá)量前者是后者41.29倍。上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。相關(guān)基因RTPCR引物見表2。

3　討論

圖3　松質(zhì)骨祖細(xì)胞予成軟骨分化誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d，行免疫組化染色和組織染色

MSCs的發(fā)現(xiàn)和深入研究［17-19］極大擴(kuò)展了人們對干細(xì)胞的認(rèn)識，也為臨床上的組織/細(xì)胞工程學(xué)開拓了巨大的想象力。目前，在包括骨髓、軟骨、滑膜、脂肪等各個(gè)人體組織內(nèi)均已發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞的存在。誘導(dǎo)MSCs定向成軟骨分化是目前國內(nèi)外對其研究的熱點(diǎn)之一［10-13］。軟骨缺損亦是OA的主要病理改變，因此誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化來修復(fù)缺損區(qū)可能成為OA治療的新方法。而相比于其他部位獲取MSCs，通過關(guān)節(jié)鏡下微骨折處理，使軟骨下松質(zhì)骨內(nèi)此類細(xì)胞遷移至軟骨缺損區(qū)，通過適當(dāng)方法誘導(dǎo)其高效定向成軟骨分化具有避免二次手術(shù)、簡化治療過程等優(yōu)點(diǎn)。既往研究認(rèn)為老年和晚期OA患者微骨折處理等方法治療軟骨缺損的效果不理想，不建議在此類人群中使用微骨折治療方法［4，5］。但Scharstuhl等［20］通過對比研究不同人群來源骨髓MSCs分離所得，認(rèn)為骨髓MSCs的數(shù)量和成軟骨分化能力與年齡、OA嚴(yán)重程度無關(guān)，進(jìn)而認(rèn)為通過MSCs治療OA軟骨缺損是可能的。Neumann等［21］首次報(bào)道從健康人腓骨頭松質(zhì)骨內(nèi)分離出具有成軟骨分化能力的間充質(zhì)祖細(xì)胞（mesenchymal progenitor cells，MPC），但鮮有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于從老年晚期OA患者軟骨下松質(zhì)骨內(nèi)分離獲得此類細(xì)胞。假設(shè)老年晚期OA患者關(guān)節(jié)軟骨下松質(zhì)骨內(nèi)存在具有成軟骨分化能力的祖細(xì)胞，可以在臨床上通過微骨折處理，利用此類細(xì)胞進(jìn)行“一步式”軟骨修復(fù)，本研究對此進(jìn)行了驗(yàn)證。

圖4　松質(zhì)骨祖細(xì)胞經(jīng)28 d成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，RT-PCR提示Ⅰ型膠原基因表達(dá)水平下降；成軟骨相關(guān)基因Ⅱ型膠原、aggrecan、SOX-9的表達(dá)水平上升，**P＜0.01

表2　RT-PCR引物

流式細(xì)胞檢測提示該松質(zhì)骨祖細(xì)胞表面抗原表達(dá)CD73、CD90、CD105，不表達(dá)CD14、CD19、CD34、CD45、HLD-DR，符合目前關(guān)于MSCs細(xì)胞表面抗原的相關(guān)特性，但此類細(xì)胞的CD105表達(dá)較低，分析原因如下：①從松質(zhì)骨中遷出的細(xì)胞并非單純一個(gè)集落群；②可能與細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)和細(xì)胞傳代等有關(guān)系。已有文獻(xiàn)表明不同的培養(yǎng)基或者傳代數(shù)的不同可以改變細(xì)胞表面抗原表達(dá)。本研究為模擬“一步式”微骨折-軟骨修復(fù)治療過程，未將細(xì)胞進(jìn)行表面抗原分選后再誘導(dǎo)分化。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道CD105、CD166雙陽性的滑膜來源細(xì)胞較陰性者具有更加明顯的成軟骨分化能力［22］，是否也適用于松質(zhì)骨祖細(xì)胞有待后續(xù)研究的進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究將第3代細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂、成軟骨分化研究，通過相應(yīng)的細(xì)胞染色、組織染色及免疫組化染色分析其分化結(jié)果。茜素紅染色和堿性磷酸酶活性染色的陽性驗(yàn)證晚期OA患者軟骨下松質(zhì)骨祖細(xì)胞具有成骨分化能力；油紅O染色陽性則證實(shí)其成脂分化能力。由于本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)關(guān)注晚期OA患者軟骨下松質(zhì)骨祖細(xì)胞成軟骨分化能力，故對多個(gè)軟骨分化相關(guān)標(biāo)記物進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果表明作為成軟骨分化最主要的標(biāo)志物Ⅱ型膠原、聚蛋白聚糖均出現(xiàn)在誘導(dǎo)后的細(xì)胞微球組織中，而成骨相關(guān)指標(biāo)Ⅰ型膠原的染色較未分化組弱，提示細(xì)胞被成功向軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)。進(jìn)而通過RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證Ⅱ型膠原、蛋白聚糖和SOX-9基因mRNA表達(dá)水平較未誘導(dǎo)組顯著升高，SOX-9基因被認(rèn)為與軟骨形成密切相關(guān)，是證實(shí)細(xì)胞成軟骨分化的可靠指標(biāo)，而Ⅰ型膠原的基因表達(dá)量明顯下降，該結(jié)果與免疫組化染色基本一致。由此確認(rèn)未經(jīng)細(xì)胞表面抗原分選的由脛骨平臺下松質(zhì)骨遷移出的祖細(xì)胞具有良好的成軟骨分化能力。

綜上，結(jié)合松質(zhì)骨祖細(xì)胞的貼壁生長特性、細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞表面抗原分析，成骨、脂、軟骨分化的多分化潛能，本研究認(rèn)為晚期OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨下松質(zhì)骨內(nèi)仍有具成軟骨分化能力的祖細(xì)胞，可為“一步式——微骨折處理-成軟骨誘導(dǎo)材料填充-軟骨修復(fù)”治療理念提供一定依據(jù)。

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Characteristicsof progenitor cells derived from subchondralcortico-spongiousbone in end-stageosteoarthritis patients

JIANG Chao，WANGYipeng，QIU Guixing，WU Zhihong，WENG Xisheng*
（Departmentof Orthopedics，Peking Union M edical College Hospital，CAMS&PUMC，Beijing 100037，China）

2095-9958（2016）02-0069-06

10.3969/j.issn.2095-9958.2016.01-14

翁習(xí)生，E-mail：xshweng@medmail.com.cn