馮成，王碩仁，張鵬，曹俊嶺，吳愛(ài)明，婁利霞，閆彥芳，聶波*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 骨科，北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100700)

RP-HPLC測(cè)定八珍益母湯劑兩種煎藥方法芍藥苷和阿魏酸的含量△

馮成1，王碩仁2，張鵬3，曹俊嶺4，吳愛(ài)明2，婁利霞2，閆彥芳2，聶波2*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 骨科，北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100700)

目的：比較傳統(tǒng)砂鍋和煎藥機(jī)煎煮八珍益母湯對(duì)芍藥苷和阿魏酸含量的影響。方法：采用傳統(tǒng)砂鍋和煎藥機(jī)煎煮制備八珍益母湯，反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測(cè)定煎液中芍藥苷和阿魏酸的含量。色譜條件：ImtaktC18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸(14∶86，ν/ν)溶液；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為芍藥苷230 nm，阿魏酸322 nm；柱溫為25 ℃。結(jié)果：芍藥苷在傳統(tǒng)砂鍋煎液中含量略高于煎藥機(jī)煎液；阿魏酸在兩種煎液中含量相近。結(jié)論：傳統(tǒng)砂鍋煎煮與煎藥機(jī)煎煮八珍益母湯劑中主要有效成分含量差異不明顯。

傳統(tǒng)砂鍋煎煮；煎藥機(jī)煎煮；八珍益母湯劑；芍藥苷；阿魏酸；含量測(cè)定

八珍益母方由益母草、黨參、炒白術(shù)、茯苓、甘草、當(dāng)歸、川芎、酒白芍、熟地黃9味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血、活血調(diào)經(jīng)的功能，臨床廣泛用于治療氣血兩虛兼血瘀之月經(jīng)不調(diào)及多種內(nèi)科疾病，療效顯著[1]。中藥湯劑是中醫(yī)臨床應(yīng)用最早、最廣泛、藥效最可靠的劑型，其煎煮質(zhì)量直接影響臨床療效。中藥煎藥機(jī)代替?zhèn)鹘y(tǒng)砂鍋煎藥已被廣泛應(yīng)用。但兩種煎藥方法對(duì)湯劑中有效成分的影響一直是人們普遍關(guān)注問(wèn)題，煎煮條件對(duì)湯劑化學(xué)成分及其藥效的影響值得深入系統(tǒng)地研究。因此，本文選擇臨床常用的補(bǔ)益方劑——八珍益母湯劑為研究對(duì)象，采用HPLC法對(duì)煎藥機(jī)與傳統(tǒng)砂鍋煎煮制備的兩種八珍益母湯劑中的芍藥苷和阿魏酸含量進(jìn)行檢測(cè)，以比較兩種煎藥方法對(duì)八珍益母方有效成分煎出的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

東華YFY-20煎藥機(jī)(北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司)；普通砂鍋；島津LC-10Avp高效液相色譜儀(由2個(gè)LC-10ATvp輸送泵、CTO-ASvp柱溫箱、Rheodyne 7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、SPD-M10Avp紫外-可見(jiàn)二極管陣列檢測(cè)器、CLASS-VP色譜工作站和電腦組成)；島津AEG-45SM十萬(wàn)分之一分析天平；GILSON x57356A移液管；TP 300超聲波清洗機(jī)；SIGMA 3K15臺(tái)式低溫高速冷凍離心機(jī)(西安特普訊儀器設(shè)備有限公司)；Mill-Q A10+純水機(jī)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；獅鼎5HB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；康樂(lè)DZF-1型真空干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)。

1.2 材料

芍藥苷對(duì)照品、阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為10736-200631，110773-200611)；處方藥材均購(gòu)自北京白塔寺藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院閆永紅教授鑒定為合格品；煎藥機(jī)煎液由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院煎藥室制備；砂鍋煎液為北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；85%磷酸(Fluka，HPLC級(jí))；甲醇(MERCK，HPLC級(jí))；乙腈(J.T.Baker，HPLC級(jí))；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 砂鍋煎液制備

將八珍益母湯劑1劑置砂鍋內(nèi)，加10倍量水，浸泡30 min，武火加熱至沸，改為文火煎煮40 min，倒出煎液；藥渣加水8倍量水，武火加熱至沸，改文火煎煮25 min，合并2次煎液，過(guò)濾后，分裝，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。重?fù)以上操作3批次，平均一劑煎液體積為650 mL。同法分別制備缺酒白芍、缺川芎和當(dāng)歸的兩種陰性煎液。

2.2 煎藥機(jī)煎液制備

將八珍益母湯劑6劑混合均勻后裝入無(wú)紡布袋內(nèi)，置煎藥機(jī)內(nèi)，加水4200 mL，浸泡30 min后，再加3900 mL水，開(kāi)始加熱。溫度升到120 ℃，壓力增至0.12 kPa停止加熱。出液包裝，棄去前2袋，按出袋順序依次編號(hào)，每袋200 mL。重復(fù)上述操作3批次。同法分別制備缺酒炒白芍、缺川芎和當(dāng)歸的兩種陰性對(duì)照煎液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密量取經(jīng)105 ℃五氧化二磷減壓干燥36 h的芍藥苷對(duì)照品4.94 mg，置5 mL棕色量瓶?jī)?nèi)，用HPLC級(jí)甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度為0.988 mg·mL-1；精密量取經(jīng)105 ℃五氧化二磷減壓干燥36 h的阿魏酸對(duì)照品10.19 mg，置10 mL棕色量瓶?jī)?nèi)，用HPLC級(jí)甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度為1.019 mg·mL-1；分別精密量取400 μL芍藥苷和阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，置同-5 mL棕色量瓶?jī)?nèi)，用HPLC級(jí)甲醇定容至刻度，搖勻，即得含芍藥苷和阿魏酸混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0.070 94、0.081 52 mg·mL-1。

2.4 供試品溶液的制備

精密量取相當(dāng)于原生藥2.6 g的八珍益母湯于雞心瓶?jī)?nèi)，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴50 ℃濃縮至約5 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶?jī)?nèi)，逐滴加入甲醇至刻度(邊加邊振搖)，超聲25 min，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，離心(13 000 r·min-1，10 ℃，10 min)，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5 色譜條件

色譜柱：lmtakt C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水(14∶86，v/v)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：芍藥苷為230 nm，阿魏酸為322 nm；柱溫：25 ℃。

2.6 系統(tǒng)適應(yīng)性及專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別精密量取芍藥苷對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺芍藥陰性供試品溶液和缺川芎、當(dāng)歸陰性供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1(因兩種煎液色譜圖近似，僅列煎藥機(jī)煎液樣品色譜圖)。

注：A.對(duì)照品；B、C.煎藥機(jī)煎液供試品(不同波長(zhǎng)下)；D.缺芍藥陰性供試品；E、F.缺川芎、當(dāng)歸陰性供試品(不同波長(zhǎng)下)；1.芍藥苷；2.阿魏酸。圖1 八珍益母湯劑HPLC圖

如圖1可知，芍藥苷保留時(shí)間為19.86 min，阿魏酸保留時(shí)間為34.21 min，供試品色譜圖在對(duì)照品對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，且芍藥苷、阿魏酸色譜峰分別與前后色譜峰分離良好。缺芍藥陰性供試品溶液和缺川芎、當(dāng)歸陰性供試品溶液在相應(yīng)位置不出現(xiàn)色譜峰。結(jié)果表明，系統(tǒng)適應(yīng)性良好，其他成分對(duì)芍藥苷、阿魏酸的測(cè)定無(wú)干擾。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

取2.3項(xiàng)下芍藥苷和阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液各10、40、100、200、600、1000 μL，置同一5 mL棕色量瓶?jī)?nèi)，加入HPLC級(jí)甲醇定容至刻度，搖勻，即得一系列含芍藥苷和阿魏酸的混合對(duì)照品溶液。分別取混合對(duì)照品溶液各10 uL，進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品芍藥苷、阿魏酸含量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，芍藥苷、阿魏酸分別在0.079 04～1.976 00 μg、0.020 38～2.038 00 μg呈良好的線(xiàn)性關(guān)系?；貧w方程分別為Y1=1 614 355X1-41 391.2，r=0.999 8(n=6)；Y2=6 196 894X2-57 151.2，r=0.999 9(n=6)。

2.8 精密度試驗(yàn)

精密量取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果峰面積RSD分別為芍藥苷1.59%，阿魏酸0.61%，表明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、16 h注入液相色譜儀測(cè)定，峰面積RSD分別為芍藥苷1.05%，阿魏酸0.22%，表明芍藥苷和阿魏酸在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取同一批砂鍋煎液5份，按供試品溶液制備方法平行制備5份，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果芍藥苷平均質(zhì)量濃度為0.086 01 mg·mL-1，RSD為1.63%；阿魏酸平均質(zhì)量濃度為0.017 29 mg·mL-1，RSD為1.94%，說(shuō)明該樣品處理方法重復(fù)性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的砂鍋煎液6份，分為2組，按比例精密加入一定量的對(duì)照品，按照供試品溶液制備方法處理，依法測(cè)定芍藥苷和阿魏酸的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

注：回收率=(測(cè)得量-樣品中量)/加入量×100%。

2.12 樣品測(cè)定結(jié)果

分別取砂鍋煎液和煎藥機(jī)煎液，按供試品制備方法處理，并按照所建立的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算煎液中芍藥苷、阿魏酸含量。同時(shí)按《中華人民共和國(guó)藥典》2015版規(guī)定方法分別測(cè)定生藥白芍中芍藥苷含量和生藥當(dāng)歸、川芎中阿魏酸含量。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，計(jì)算芍藥苷和阿魏酸的提取率，同時(shí)使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用獨(dú)立T檢驗(yàn)，分析兩組間芍藥苷和阿魏酸含量的差異，p>0.05，兩種煎煮方法獲得的芍藥苷和阿魏酸含量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 八珍益母方煎液中芍藥苷和阿魏酸的提取率

注：提取率=煎液中指標(biāo)成分含量(mg)/對(duì)應(yīng)生藥中該成分含量(mg)×100% 。

3 討論

3.1 色譜條件的確定

[2-5]所采用的色譜方法，本研究嘗試乙腈-水、乙腈-1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸等多種流動(dòng)相，結(jié)果乙腈-水、乙腈-1%冰醋酸溶劑系統(tǒng)下芍藥苷和阿魏酸有不同程度的拖尾，而在乙腈-0.1%磷酸(14∶86，v/v)系統(tǒng)下分析時(shí)，芍藥苷、阿魏酸與前后色譜峰分離良好，故采用該溶劑系統(tǒng)為分析用流動(dòng)相。嘗試采用梯度洗脫程序(0 min，乙腈-0.1%磷酸(14∶86)；30 min，乙腈-0.1%磷酸(15∶85)，雖能一定程度上縮短分析時(shí)間，但系統(tǒng)保留時(shí)間不夠穩(wěn)定，阿魏酸的分離度過(guò)小。

3.2 供試品處理方法

嘗試將煎液直接經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)色譜圖上雜質(zhì)峰較多，芍藥苷和阿魏酸不能很好分離，且不利于色譜儀的維護(hù)。改用取煎煮液濃縮后加甲醇超聲的方法，能有效去除雜質(zhì)峰，顯著改善分離效果，且有利于色譜儀的維護(hù)，加樣回收率試驗(yàn)符合要求，故選用此法處理供試品。

3.3 不同煎藥方法對(duì)湯劑有效成分含量影響的比較

比較八珍益母湯兩種煎液中芍藥苷、阿魏酸的煎出率可知，芍藥苷在傳統(tǒng)砂鍋煎液中含量略高于煎藥機(jī)煎液，分析其原因：芍藥苷易溶于水，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，故在兩種煎藥方法下，均得到很好的煎出;而傳統(tǒng)砂鍋煎煮條件下，煎煮時(shí)間較長(zhǎng)，故芍藥苷的煎出率略高于煎藥機(jī)煎煮，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。阿魏酸易溶于水，但結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，故煎煮時(shí)間長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其降解，而含量下降，因此，傳統(tǒng)砂鍋煎煮的含量略低于煎藥機(jī)煎煮。但差異不具有統(tǒng)計(jì)意義。在一定程度上說(shuō)明，傳統(tǒng)砂鍋煎藥方法與機(jī)器煎藥方法對(duì)于某些水溶性且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化學(xué)成分的煎出影響不大。

課題組曾以清熱解表代表方感冒清熱湯劑為研究對(duì)象，比較傳統(tǒng)煎藥和煎藥機(jī)煎藥對(duì)湯劑中有效成分含量的影響，結(jié)果顯示，在機(jī)煎液中葛根素的煎出率較高，而砂鍋液中升麻苷的煎出率較高，兩者中5-O-甲基維斯阿米醇苷的煎出率相近[6]。本試驗(yàn)以補(bǔ)益藥代表方八珍益母湯為研究對(duì)象，比較兩種煎藥方法對(duì)芍藥苷含量的影響，結(jié)果顯示，傳統(tǒng)砂鍋煎液芍藥苷含量略高于煎藥機(jī)煎液，阿魏酸則略低于煎藥機(jī)煎液，但差異不明顯。分析原因，兩種煎藥方法在加熱溫度、時(shí)間、壓力等方面存在差異，產(chǎn)生上述不同結(jié)果涉及到中藥所含有的化學(xué)成分的溶解性、穩(wěn)定性、pH值、共存的化學(xué)成分等多種復(fù)雜因素，具體選擇哪種煎藥方式、對(duì)有效成分的影響如何、是否影響臨床療效等，有待于進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

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ContentDeterminationofPaeoniflorinandFerulicAcidinBazhenYimuDecoctionPreparedwithTwoDecoctingMethodsbyRP-HPLC

FENG Cheng1，WANGShuoren2，ZHANGPeng3，CAOJunling3，WUAiming2，LOULixia2，YANYanfang2，NIEBo2*

(1.SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China; 2.KeyLaboratoryofChineseInternalMedicineofMinistryofEducationandBeijing,DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China;3.DepartmentofOrthopaedicsDongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China; 4.DepartmentofPharmacy,DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China)

Objective：To compare effects on the contents of paeoniflorin and ferulic acid in Bazhen Yimu Decoction (BYD) prepared by machine-boiling method and marmite-boiling method.Method：BYD was decocted by traditional marmite and decocting machine respectively.Then the content of paeoniflorin and ferulic acid in the decoction were determinedby RP-HPLC.Imtakt C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) was used with acetonitrile:0.3% phosphoric acid (14∶86) as the mobile phase, the flow rate was 1.0 mL/min, and the detection wavelengths of paeoniflorin and ferulic Acid were set at 230 nm and 322 nm with temperature at 25 ℃.Results:The content of paeoniflorin was slightly higher, and that of ferulic acid was similar in the marmite-boiling-decoction than those in the machine-boiling-decoction.Conclusion:The differences was not obvious from the contents of main effective components in the decoctions of BYD prepared by between machine-boiling method and marmite-boiling method.

Marmite-boiling；machine-boiling；Bazhen Yimu Decoction；paeoniflorin；ferulic acid; content determination

2016-04-07)

北京市教育委員會(huì)共建項(xiàng)目

*

聶波，博士，副研究員，研究方向：中藥藥理與中藥體內(nèi)代謝了；E-mail：nieboww_1977@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.023