陸俊霞，李珂珂，王平，崔攀，陳麗榮，弓曉杰*

(1.大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622；2.大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622；3.中國科學院 大連化學物理研究所 藥用資源開發(fā)實驗室，遼寧 大連 116023)

兒茶酚香豆素清除自由基能力測定及作用機制探索△

陸俊霞1，3，李珂珂2，王平3，崔攀3，陳麗榮1，弓曉杰2*

(1.大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622；2.大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622；3.中國科學院 大連化學物理研究所 藥用資源開發(fā)實驗室，遼寧 大連 116023)

目的：測定兒茶酚香豆素清除自由基的能力，并研究其作用機制。方法：測定系列不同濃度的4-取代、8-含氮氫鍵受體和單甲基化兒茶酚香豆素衍生物對DPPH、ABTS·+自由基的清除率，繪制濃度-清除率曲線，結(jié)合文獻報道的酚類化合物清除自由基的作用機制，研究兒茶酚類香豆素清除自由基的作用機制。結(jié)果：所有被測兒茶酚香豆素化合物都具有良好的抗氧化活性，其對ABTS·+自由基的清除能力強于對DPPH的清除能力。當引入含氮氫鍵受體，形成分子內(nèi)氫鍵后，其對DPPH自由基的清除能力減弱，而對ABTS·+的清除能力沒有明顯變化。當兒茶酚香豆素被單甲基化后，其清除自由基的活性明顯下降。結(jié)論：兒茶酚類香豆素清除DPPH自由基的作用機制和酚羥基的氫原子轉(zhuǎn)移有關(guān)，而清除ABTS·+的作用方式可能是質(zhì)子丟失，電子轉(zhuǎn)移。

兒茶酚香豆素；自由基；作用機制

活性氧種(ROS)介導的氧化應(yīng)激與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如帕金森和老年癡呆癥等[1-2]。ROS的累積甚至會導致DNA雙鍵斷裂、蛋白肽鏈斷裂和基因突變[3]。因此，ROS的清除對于預防和治療氧化應(yīng)激導致的機體氧化損傷、維護人類健康具有重要的意義[4]。探究化合物抗氧化活性作用機制為獲得高活性的抗氧化劑提供了可靠的理論依據(jù)。兒茶酚類香豆素具有顯著的抗氧化活性，但是，目前對酚類化合物清除自由基的作用機制研究尚未清楚[5]。本研究采用DPPH、ABTS·+模型對系列兒茶酚香豆素的抗氧化活性進行評價，并在此基礎(chǔ)上探索兒茶酚香豆素清除這兩類自由基的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 材料

七葉亭和瑞香素(天津希恩思生化科技有限公司，純度>97%)，其他系列的24個兒茶酚香豆素衍生物均為合成品(純度>98%)，化學結(jié)構(gòu)及名稱見圖1；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[DPPH，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，美侖生物)；實驗用水為Millipore 純化水。

1.2 儀器

Synergy H1 型全功能微孔板檢測酶標儀(美國博騰儀器有限公司)；Millipore 純水儀(美國Millipore 公司)；96孔板(美國Conring公司)；可調(diào)量程移液器(Eppendorf Research plus)。

化合物RR1R2R3化合物名稱1HOHHOH七葉亭2CH3OHHOH4?甲基七葉亭3C6H5OHHOH4?苯基七葉亭4CH2ClOHHOH4?氯甲基七葉亭5CF3OHHOH4?三氟甲基七葉亭6HHOHOH瑞香素7CH3HOHOH4?甲基瑞香素8C6H5HOHOH4?苯基瑞香素9CH2ClHOHOH4?氯甲基瑞香素10CF3HOHOH4?三氟甲基瑞香素11HOHOH8?(1?亞甲基?4?羥基哌啶)七葉亭12HOHOH8?(1?亞甲基吡咯烷基)七葉亭13CH3OHOH4?甲基?8?(1?亞甲基吡咯烷基)七葉亭14CH3OHOH4?甲基?8?(1?亞甲基二甲氨基)七葉亭15HOHHOCH36?羥基?7?甲氧基香豆素16HOCH3HOH7?羥基?6?甲氧基香豆素17CH3OHHOCH34?甲基?6?羥基?7?甲氧基香豆素18CH3OCH3HOH4?甲基?7?羥基?6?甲氧基香豆素19C6H5OHHOCH34?苯基?6?羥基?7?甲氧基香豆素20C6H5OCH3HOH4?苯基?7?羥基?6?甲氧基香豆素21HHOHOCH38?羥基?7?甲氧基香豆素22HHOCH3OH7?羥基?8?甲氧基香豆素23CH3HOHOCH34?甲基?8?羥基?7?甲氧基香豆素24CH3HOCH3OH4?甲基?7?羥基?8?甲氧基香豆素25C6H5HOHOCH34?苯基?8?羥基?7?甲氧基香豆素26C6H5HOCH3OH4?苯基?7?羥基?8?甲氧基香豆素

圖1兒茶酚香豆素衍生物的化學結(jié)構(gòu)及名稱

2 方法

2.1 DPPH法

參照文獻報道的方法稍作修改[6]。主要實驗步驟：添加180 μL DPPH乙醇液和20 μL不同濃度的待測物的二甲基亞砜(DMSO)溶液于96孔板，室溫避光反應(yīng)30 min，測定其在517 nm處的吸光度，記作Asample。對照組為：180 μL DPPH乙醇液和20 μL DMSO，吸光度值記為Acontrol；180 μL乙醇液和20 μL待測物，吸光度值記為Ablank。每個樣品平行測定2次，根據(jù)公式(1)計算不同濃度樣品對DPPH自由基的清除率。最后，采用GraphPad Prism 6 軟件繪制清除率-濃度對數(shù)曲線。

(1)

2.2 ABTS法

參照文獻報道的方法稍作修改[7]。主要實驗步驟：7 mmol·L-1ABTS的磷酸緩沖溶液(PBS；1 mmol·L-1，pH=7.4)和2.45 mmol·L-1K2S2O4的PBS溶液，兩者按1∶1混合，室溫避光保存12～16 h，吸收值穩(wěn)定后將溶液稀釋至吸光度介于0.8～0.9，即為ABTS·+自由基工作液。取180 μL ABTS·+工作液和20 μL不同濃度待測物的DMSO溶液于96孔板，室溫充分反應(yīng)10 min，測定其在734 nm處的吸光度值，記作Asample。對照組為180 μL ABTS·+工作液和20 μL DMSO，其吸光度值記為Acontrol；180 μL PBS和20 μL待測物，吸光度值記為Ablank。每個樣品平行測定2次，根據(jù)公式(1)計算不同濃度樣品對ABTS·+自由基的清除率，采用GraphPad Prism 6軟件繪制ABTS·+清除率-濃度對數(shù)曲線。

2.3 Gaussian 09計算方法

采用Gaussian 09密度泛函理論(Density Functional Theory，DFT)對兒茶酚香豆素酚羥基鍵的解離能進行計算[8-10]。首先在B3LYP/6-31+G(d)水平，對兒茶酚香豆素類化合物粒子進行幾何構(gòu)型優(yōu)化，然后頻率計算298 K時的熱力學能參數(shù)，最后根據(jù)公式(2)計算羥基鍵的解離能[11]。

BDE(kJ·mol-1)=(HAr-O·+HH·-HAr-OH)×2 565.5

(2)

式中：HAr-OH、HAr-O·、HH·分別為298 K時，兒茶酚香豆素分子均裂前后分子和自由基的能量。

3 結(jié)果與討論

3.1 4-取代兒茶酚香豆素對DPPH、ABTS·+自由基的清除能力

不同結(jié)構(gòu)的4-取代兒茶酚香豆素(化合物1～10)，清除DPPH、ABTS·+自由基的結(jié)果如圖2和圖3所示。10種兒茶酚香豆素化合物均具有良好的自由基清除能力，其中七葉亭類(1～5)化合物對DPPH自由基的清除能力強于瑞香素類(6～10)；而對ABTS·+的清除率，兩者相當。這可能是由于氫鍵的影響，在七葉亭化合物中，分子內(nèi)氫鍵只存在于鄰酚羥基之間；在瑞香素類衍生物中，不僅鄰二酚羥基間能形成分子內(nèi)氫鍵，而且8-OH和內(nèi)酯環(huán)氧也能形成分子內(nèi)氫鍵，8-羥基氫由于同時受到7-羥基氧、內(nèi)酯環(huán)氧和8-羥基氧的共同作用而被鈍化，不易給出氫，表現(xiàn)出較弱的自由基清除能力。因此，七葉亭類衍生物對自由基的清除能力比瑞香素類強。根據(jù)酚類化合物清除自由基的作用機制，兒茶酚香豆素清除DPPH自由基的作用機制可能為氫原子轉(zhuǎn)運[12-13]。同時，兒茶酚香豆素對ABTS·+的清除能力(約90%)高于對DPPH自由基的清除能力(約60%)，故測定ABTS·+的清除率更能體現(xiàn)出酚類化合物的抗氧化活性。

3.2 含氮七葉亭對DPPH、ABTS·+的清除能力

化合物11～14在七葉亭C-8位引入含氮氫鍵受體基團，與7-OH形成分子內(nèi)氫鍵，仍表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。圖4中，化合物11～14清除DPPH自由基的能力弱于母體化合物。這可能是由于分子內(nèi)氫鍵影響酚羥基的解離能，進而影響其對DPPH自由基的清除能力。這再一次說明，兒茶酚類化合物清除自由基的作用機制為酚羥基氫原子轉(zhuǎn)運。圖5顯示，七葉亭類化合物中引入大小不同的含氮基團，其清除ABTS·+的能力等同于母體化合物。氫鍵的存在及氫鍵作用力的強弱對七葉亭類化合物清除ABTS·+的抗氧化活性沒有顯著的影響。依此推測，兒茶酚類香豆素清除ABTS·+的作用機制可能是丟失質(zhì)子，電子傳遞。因為從電子效應(yīng)的角度考慮，氮具有較強的電負性，為吸電子基團；從共軛效應(yīng)的角度考慮，氮原子含有一對孤電子對，為供電子基團。當含氮基團和7-位羥基氫形成分子內(nèi)氫鍵時，氮作為氫鍵的電子供體，此時氮以電子效應(yīng)為主，其與苯環(huán)相連接的亞甲基表現(xiàn)出一定的電負性，容易給出氫。而含氮雜環(huán)的空間位阻較大，排斥氮和鄰酚羥基形成分子內(nèi)氫鍵，其發(fā)揮抗氧化活性的仍然是酚羥基占主導地位。

注：A.化合物1和6；B.化合物2和7；C.化合物3和8；D.化合物4和9；E.化合物5和10；下同。圖2 4-取代兒茶酚香豆素對DPPH自由基的清除率

圖3 4-取代兒茶酚香豆素對ABTS·+的清除率

注：A.化合物1、11、12；B.化合物2、13、14；下同。圖4 含氮七葉亭衍生物對DPPH的清除率

圖5 含氮七葉亭衍生物對ABTS·+的清除率

3.3 兒茶酚香豆素單甲基化產(chǎn)物清除自由基的能力

為了深入理解和驗證兒茶酚類香豆素清除DPPH自由基的作用機制，測定并比較分析了系列兒茶酚香豆素及其單甲基化產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力，并根據(jù)酚類化合物清除自由基的作用機制，采用gaussain 09密度泛函理論對酚羥基的解離能(Bond Dissociation Energy，BDE)進行計算。結(jié)果見表1、2。

表1 1 mmol·L-1香豆素類化合物對DPPH自由基清除率 (%)

表2 兒茶酚香豆素化合物的酚羥基解離能(BDE) /kJ·mol-1

如表2所示，兒茶酚香豆素被選擇性甲基化后，其抗氧化活性顯著降低，但是仍具有以下的結(jié)構(gòu)-抗氧化活性關(guān)系，7-OH>8-OH>6-OH。對酚羥基的解離能計算結(jié)果如表3所示，同一化合物的酚羥基解離能滿足BDE6-OH>BDE7-OH，BDE8-OH>BDE7-OH，而且同分異構(gòu)體之間，7，8-二羥基的解離能介于6，7-二羥基之間。根據(jù)BDE值，兒茶酚香豆素清除自由基的能力為7-OH6，7>7-OH7，8>8-OH>6-OH。這雖然不能作為比較七葉亭類和瑞香素類化合物抗氧化活性的充分條件。但是，可以得出含有7-OH的單酚香豆素具有較高抗氧化活性的結(jié)論，這與實驗結(jié)果相匹配。基于以上的對比分析和計算，表明酚類香豆素化合物清除DPPH自由基的作用方式為酚羥基的氫原子轉(zhuǎn)移到自由基上。至于兒茶酚類香豆素和單酚類香豆素間顯著的抗氧化活性差異，這可能是由于鄰酚羥基之間存在協(xié)同作用。

4 結(jié)論

兒茶酚香豆素是一類良好的抗氧化劑，其對DPPH、ABTS·+自由基具有顯著的清除能力，對ABTS·+的清除率強于對DPPH自由基的清除率，ABTS·+法更能體現(xiàn)化合物的抗氧化活性。比較七葉亭和瑞香素類化合物抗氧化活性，其中，對DPPH自由基的清除率，七葉亭類化合物的作用能力高于瑞香素類化合物，其作用機制為酚羥基氫原子轉(zhuǎn)運，氫鍵的形成通過改變羥基的解離能進而影響其抗氧化活性。對ABTS·+的清除活性，七葉亭類化合物的作用能力等同于瑞香素類化合物，氫鍵對清除率沒有顯著的影響，但是與給出質(zhì)子的能力相關(guān)。因此，兒茶酚香豆素清除ABTS·+的作用機制可能是丟失質(zhì)子，電子傳遞。此研究和討論為兒茶酚香豆素化合物的理性結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了可靠的理論依據(jù)，對獲得高活性的候選抗氧化藥物具有理論指導作用。

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FreeRadicalScavengingCapabilityofCatecholCoumarinsandMechanism

LU Junxia1，3，LIKeke2，WANGPing3，CUIPan3，CHENLirong1，GONGXiaojie2*

(1.CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering，DalianUniversity，Dalian116622，China；2.CollegeofMedical，DalianUniversity，Dalian116622，China；3.LaboratoryofPharmaceuticalResourceDiscovery，DalianInstituteofChemicalPhysics，ChineseAcademyofSciences，Dalian116023，China)

Objective：To evaluate free radical scavenging capacity of catechol coumarin，and further explore the mechanism of the reaction between catechol coumarins and free radical.Methods：DPPH，ABTS·+scavenging activity of a series of coumarins including substituent group at position 4，8 and monomethylation products were assayed，then the curve of logc-scvenging activity was drawn.Finally，the free radical scavenging mechanism of catechol compounds was explored according to the literature.Results：All of compounds investigated possessed excellent antioxidant activity，and the ability to get rid of ABTS·+was stronger than that of DPPH.The ability of getting rid of DPPH was reduced by introducing nitrogen-containning groups，which acting as hydrogen bond acceptors for formation of intramolecular hydrogen bonds，while no significant changes in ABTS·+were found.However，the antioxidant activity decreased significantly，even to inactivation，for monomethylation of catechol coumarins.Conclusion：The mechanism complies with Hydrogen Atom Transfer (HAT) for scavenging DPPH，while sequential proton loss electron transfer may be more appropriate for ABTS·+.

Catechol coumarins；free radical；mechanism

2016-04-06)

國家自然科學基金(81172949)；遼寧省優(yōu)秀人才支持計劃(LR2013058)；遼寧省自然科學基金計劃(2015020657)；遼寧省科技廳科學技術(shù)計劃(2014204007)；大連市科技局科技計劃(2014E12SF071)

*

弓曉杰，教授，碩士生導師，研究方向：中藥新藥開發(fā)；E-mail：gxjclr@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.007