謝小麗，王凱，龐玉新*，楊全，陳振夏

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737；3.海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，海南 儋州 571737)

·中藥工業(yè)·

正交試驗(yàn)法優(yōu)選艾粉β-環(huán)糊精包合方法及其工藝△

謝小麗1，2，3，王凱2，3，龐玉新2，3*，楊全1*，陳振夏2，3

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737；3.海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，海南 儋州 571737)

目的：優(yōu)選艾粉β-環(huán)糊精包合方法及其工藝。方法：以包合物中左旋龍腦載藥量與收得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)法優(yōu)選飽和水溶液法、研磨法及超聲法包合艾粉的工藝參數(shù)，再進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果：研磨法最優(yōu)，其最佳工藝參數(shù)為艾粉與β-環(huán)糊精的投料比1∶4，研磨時(shí)間45 min，加4倍量水，重復(fù)3次試驗(yàn)，包合物中左旋龍腦平均載藥量達(dá)16.49%，平均收得率達(dá)89.22%，綜合評(píng)分是31.04。結(jié)論：研磨法制備的艾粉包合物得到的平均載藥量、收得率及綜合評(píng)分均比其他兩種方法高，且工藝簡(jiǎn)單、合理可行，可以作為提高艾粉的穩(wěn)定性的一種方法，故優(yōu)選研磨法。

艾粉；β-環(huán)糊精；包合物；正交試驗(yàn)；制備工藝

艾粉為菊科植物艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.新鮮或干燥地上部分經(jīng)水蒸氣蒸餾法得到的，其氣清香，味苦，辛涼，具有抗菌、抗氧化、消腫、鎮(zhèn)痛、消炎等功能，是重要的醫(yī)藥工業(yè)原料，已成為30余種中成藥的主藥、引藥或佐藥[1-2]。

β-環(huán)糊精(β-Cyclodextrin，β-CD)是一種無臭無毒的白色結(jié)晶粉末，是由7個(gè)葡萄糖分子組成的一種特殊 “內(nèi)疏水，外親水”的中空?qǐng)A筒立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，不易受酶、pH、熱等外在條件的影響，可與多種無機(jī)、有機(jī)分子結(jié)合成主客體包絡(luò)物。目前廣泛應(yīng)用于藥學(xué)領(lǐng)域，尤其是在中藥制劑中的應(yīng)用[3-7]。

左旋龍腦為艾粉的主要有效成分，其易揮發(fā)、逸散、難溶于水，在制劑加工過程中損失較大。為了提高艾粉穩(wěn)定性，掩蓋其苦澀、刺激性氣味，本文采用β-環(huán)糊精包合技術(shù)，考察不同包合方法、不同因素對(duì)包合物載藥量和收得率的影響，篩選出最佳工藝，旨在為醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)更好地利用艾粉提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7890A氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)；RCT basic型磁力恒溫?cái)嚢杵?廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)；DHG-9035A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；CPA225D分析天平(Sartorius 公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Heraeus Multifuge X3R型高速冷凍離心機(jī)(ThermoFisher公司)。

1.2 試藥

β-環(huán)糊精(江蘇豐園生物技術(shù)有限公司，分子量：1 134.98，含量≥98%)；艾粉(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，左旋龍腦含量≥60%)；左旋龍腦對(duì)照品(阿法埃莎化學(xué)有限公司，批號(hào)：10147015，純度>98%)；水楊酸甲酯(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，純度>99.5%)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

β-環(huán)糊精包合物常用的方法有飽和水溶液法、研磨法和超聲法[8]，本文采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選這3種方法對(duì)艾粉包合的工藝。

飽和水溶液法：按不同比例稱取適量β-環(huán)糊精，加入適量的蒸餾水，置磁力恒溫?cái)嚢杵魃?，升溫?cái)嚢柚镣耆芙?。待恒溫時(shí)，緩慢滴加艾粉乙醇溶液，繼續(xù)攪拌一定時(shí)間后冷卻，置4 ℃冰箱冷藏12 h，取出。邊用4 ℃蒸餾水洗滌邊抽濾，再用乙酸乙酯清洗3次，每次超聲15 min后離心10 min(3000 r·min-1)，以除去未被包合的艾粉，45 ℃烘箱干燥，即得。

通過查閱文獻(xiàn)[9-10]，選取艾粉與β-環(huán)糊精的比例(A)、攪拌時(shí)間(B)、包合溫度(C)為主要影響因素，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 飽和水溶液法因素水平表

研磨法：按不同比例稱取適量β-環(huán)糊精，置于研磨缽中，加入適量倍數(shù)的蒸餾水，沿同一方向研成糊狀，研磨3 min后，邊研邊緩慢滴加艾粉乙醇溶液，研磨至一定時(shí)間后，包合液處理方法如同“飽和水溶液法”，即得。

通過查閱文獻(xiàn)[11]，以艾粉與β-環(huán)糊精的比例(A)、研磨時(shí)間(B)、加水倍數(shù)(C)為主要影響因素，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表4。

表2 研磨法因素水平表

超聲法：按不同比例稱取適量β-環(huán)糊精，加入適量的蒸餾水，放入超聲清洗儀中，選擇合適的超聲溫度與超聲功率，超聲5 min后，邊超聲邊緩慢滴加艾粉乙醇溶液，超聲至預(yù)定時(shí)間取出，再按“飽和水溶液法”的方法處理包合液，即得。

通過查閱文獻(xiàn)[12]，以艾粉與β-環(huán)糊精的比例(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲溫度(C)、超聲功率(D)為因素，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表7。

表3 超聲法因素水平表

2.2 包合物中左旋龍腦含量的測(cè)定

以水楊酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，采用氣相色譜法測(cè)定包合物中左旋龍腦的含量。

2.2.1 色譜條件 HP-5石英毛細(xì)管色譜柱(30 m× 0.32 mm，0 25 μm)；以80 ℃為起始溫度，保持2 min，先以5 ℃·min-1升溫至100 ℃，然后以20 ℃·min-1升溫至200 ℃，進(jìn)樣口溫度為220 ℃；檢測(cè)器溫度240為 ℃；氮?dú)饬魉贋?5 mL·min-1；氫氣流速為30 mL·min-1；空氣流速為400 mL·min-1；進(jìn)樣量為0.6 μL；分流比為9∶1。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取50 mg左旋龍腦對(duì)照品，置25 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的左旋龍腦對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.25、0.5、1、2.5、5 mL置10 mL容量瓶中，各加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液水楊酸甲酯(質(zhì)量濃度為1.34 mg·mL-1)，再以無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別取上述6種濃度溶液，在2.2.1色譜條件下進(jìn)樣0.6 μL分析。以左旋龍腦峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)濃度的比值為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程：Y=18.281X-0.149 4(r=0.999 8)。結(jié)果表明，左旋龍腦在0.02～1 mg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 樣品含量測(cè)定 精密稱取50 mg包合物，置50 mL試管中，加入20 mL無水乙醇，超聲15 min，離心10 min(5000 r·min-1)。吸取3 mL上清液于10 mL容量瓶中，加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液水楊酸甲酯(質(zhì)量濃度為1.34 mg·mL-1)，加無水乙醇定容至刻度，在2.2.1色譜條件下進(jìn)樣0.6 μL分析，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算包合物中左旋龍腦的含量，按以下公式計(jì)算包合物收得率與載藥量。

收得率(%)=包合物重量(g)/[β-環(huán)糊精加入量(g)+艾粉加入量(g)]×100%

載藥量(%)=包合物中左旋龍腦含量(g)/包合物重量(g)×100%

2.2.4 綜合評(píng)價(jià)指標(biāo) 本試驗(yàn)所采用的艾粉，其左旋龍腦含量達(dá)60%以上，左旋龍腦在包合物中的含量，即其載藥量用于衡量包合的效果。載藥量越高，包合效果就越好，因而作為主要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)為0.8；包合物收得率在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，在投入量一定的情況下，收得率越高，載藥率越高，將收得率作為次要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定為0.2。

綜合評(píng)分=0.8×載藥量+0.2×收得率

3 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.1 飽和水溶液法

飽和水溶液法包合艾粉的工藝優(yōu)選的正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表5。

表4 飽和水溶液法正交試驗(yàn)表

表5 飽和水溶液法方差分析

由表4、表5可知，各因素影響包合工藝的程度為B>A>C，因素A、B對(duì)包合工藝差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最佳包合工藝為A2B1C2，即艾粉與β-環(huán)糊精的比例為1∶6，攪拌時(shí)間為1 h，攪拌溫度為50 ℃。

3.2 研磨法

研磨法工藝優(yōu)選的正交試驗(yàn)結(jié)果見表6，方差分析試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表6 研磨法正交試驗(yàn)表

表7 研磨法方差分析

由表6、表7可知，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為A>B>C，其中因素A對(duì)包合工藝差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因素B、C差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最佳包合工藝為A1B2C2，即艾粉與β-環(huán)糊精的比例為1∶4，研磨時(shí)間為45 min，加水倍數(shù)為β-環(huán)糊精的4倍量。

3.3 超聲法

超聲法制備艾粉包合物的正交試驗(yàn)結(jié)果見表8，方差分析表9。

表8 超聲法正交試驗(yàn)表

表9 超聲法方差分析

由表8、表9可知，各因素影響包合工藝的順序?yàn)镃>B>A>D，其中超聲溫度對(duì)工藝差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最佳包合工藝為A2B1C3D3，即艾納香提取物與β-環(huán)糊精的比例為1∶6，超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為60 ℃，超聲功率為120 W。

3.4 包合方法比較

根據(jù)3種方法的最佳包合工藝，各重復(fù)試驗(yàn)3次，由表10綜合評(píng)分可知，研磨法>飽和水溶液法>超聲法，故采用研磨法最佳工藝制備的艾粉包合物包合效果最好，結(jié)果見表10。

表10 不同包合方法的最佳工藝試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

4 討論

通過試驗(yàn)結(jié)果可知，在艾粉的包合過程中，研磨法、飽和水溶液法、超聲法都為可行的包合方法，制備包合物的左旋龍腦的平均含率分別達(dá)到了16.49%、15.24%、13.61%，研磨法優(yōu)于另兩種方法，最佳工藝參數(shù)：艾粉與β-環(huán)糊精的比例為1∶4，攪拌時(shí)間為45 min，加水倍數(shù)為β-環(huán)糊精的4倍量。由于艾粉對(duì)熱不穩(wěn)定，在一定的溫度下攪拌或超聲都會(huì)造成艾粉有效成分的揮發(fā)，而研磨法在常溫下進(jìn)行，在包合過程中揮發(fā)較少、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用較少，因此研磨法更適宜制備艾粉包合物。

在試驗(yàn)中，考慮到β-環(huán)糊精溶解于水中，在預(yù)設(shè)時(shí)間內(nèi)可能沒有完全被利用，因此將包合液置于4 ℃冰箱冷藏12 h，當(dāng)溫度降低時(shí)，未被利用的β-環(huán)糊精會(huì)析出，從而提高包合物的純度；由于無水乙醇對(duì)包合物具有很強(qiáng)的破壞作用，而乙酸乙酯可溶艾粉但不溶β-環(huán)糊精，因此選用乙酸乙酯洗滌未被包合的艾粉，從而得到包合效果更好的包合物。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)艾粉所含成分的性質(zhì)，采用β-環(huán)糊精包合技術(shù)，首次將艾粉揮發(fā)性成分進(jìn)行包合，減少了揮發(fā)性物質(zhì)的損失，為以艾粉為原料的相關(guān)劑型的開發(fā)提供借鑒。

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OptimizationofPreparationMethodandTechnologyofAifen-β-cyclodextrinInclusionCompoundbyOrthogonalExperiment

XIE Xiaoli1，2，3，WANGKai2，3，PANGYuxin2，3*，YANGQuan1*，CHENZhenxia2，3

(1.SchoolofTraditionalChinese，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China；2.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina，Danzhou571737，China；3.HainanProvincialEngineeringResearchCenterforBlumeaBalsamifera，Danzhou571737，China；)

Objective：To optimize the method and the technology ofβ-cyclodextrin inclusion compound of Aifen.Methods：Thel-borneol ratio inclusion rate and inclusion compound complexes yield was selected as evaluation index，the Aifen inclusion compound process parameters of saturated aqueous solution method，grounding method and ultrasonic method were compared and optimized according to the orthogonal experiment.Results：Grounding method was comparative optimal.The method of trituration was suggest as the optimal inclusion method and the optimum inclusion process parameters were as follows：The weight ratio of Aifen andβ-cyclodextrin：1∶4，adding in 4 times water and triturating time：45 min；The test was repeated 3 times，with inclusion of the averagel-borneol ratio was 16.49%，the inclusion of the average complexes yield was 89.22%，the comprehensive score was 31.04.Conclusion：The average drug loading，the yield and the comprehensive score of Aifen prepared by grounding method were higher than those of the other two methods，and the process is simple，reasonable and feasible，can be as a method of improving the stability of Aifen.Therefore，the optimization is grounding method.

Aifen；β-cyclodextrin；inclusion compound；orthogonal experiment；preparation technology

2015-07-15)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81303171/81374065)；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2011DFB31690)

*

龐玉新，副研究員，研究方向：南藥資源研究與開發(fā)利用；Tel：(0898)23300268，E-mail：blumeachina@126.com 楊全，教授，研究方向：中藥資源與開發(fā)研究；Tel：(020-)39352353，E-mail：yangquan7208@vip.163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.021