賈丹丹，黃春敏，劉英，胡海峰*

(1.國(guó)藥集團(tuán)健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 200437；2.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040)

六神曲炮制過程中微生物的分離與鑒定△

賈丹丹1，2，黃春敏1，劉英1，2，胡海峰1，2*

(1.國(guó)藥集團(tuán)健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 200437；2.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040)

目的：揭示中藥飲片六神曲傳統(tǒng)發(fā)酵炮制工藝中有益微生物種群。方法：應(yīng)用經(jīng)典的微生物分離純化方法，結(jié)合形態(tài)學(xué)考察和16S rRNA或18S rRNA基因序列分析，對(duì)六神曲發(fā)酵炮制過程中樣品進(jìn)行微生物的分離及初步菌種分類鑒定。結(jié)果：共分離獲得細(xì)菌8株、酵母菌3株、絲狀真菌4株。8種細(xì)菌分別為成團(tuán)泛菌、溶血葡萄球菌、阿氏腸桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌、戊糖片球菌；3種酵母菌分別為伯頓生絲畢赤酵母、漢氏德巴利氏酵母、庫德里阿茲威氏畢赤酵母；4種絲狀真菌分別為卷枝毛霉、總狀毛霉、爾青霉、亮白曲霉。結(jié)論：六神曲傳統(tǒng)發(fā)酵炮制工藝涉及多種微生物共同參與發(fā)酵過程，為后續(xù)建立六神曲現(xiàn)代發(fā)酵炮制工藝奠定了菌種基礎(chǔ)。

六神曲；發(fā)酵；微生物；分離；鑒定

六神曲最早收載于《藥性論》[1]，是由面粉、赤小豆、苦杏仁、鮮青蒿、鮮蒼耳、鮮辣蓼按一定比例混勻后經(jīng)過微生物發(fā)酵而制成的曲劑，具有消食健胃、和中止瀉的功能[2]。傳統(tǒng)六神曲發(fā)酵是利用天然條件下的微生物進(jìn)行發(fā)酵，由于發(fā)酵環(huán)境中的菌種不同，造成不同產(chǎn)地或相同產(chǎn)地不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量差異較大。而且某些真菌會(huì)產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，如黃曲霉素。這些因素使六神曲的應(yīng)用受到影響[3]。以純種發(fā)酵代替?zhèn)鹘y(tǒng)發(fā)酵，菌種比較固定，保證發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性，利于中藥現(xiàn)代化。本實(shí)驗(yàn)采集傳統(tǒng)發(fā)酵六神曲的多個(gè)樣品，對(duì)其進(jìn)行微生物種群的分離及鑒定，為后續(xù)實(shí)現(xiàn)六神曲的純種發(fā)酵奠定了菌種基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵六神曲樣品(中國(guó)中藥公司提供)；LB培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；Fx KOD Buffer、脫氧核糖核苷三 磷酸/dNTP、Fx KOD酶、Easy Taq Buffer、Easy Taq酶(TaKaRa公司)；自帶引物(上海生工生物科技有限公司合成)。

1.2 儀器

電子天平(上海精科天平)；精密數(shù)顯示酸度計(jì)(Sartorius)；壓力蒸汽滅菌鍋(上海劃線醫(yī)用核子儀器有限公司)；超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)

2 方法

2.1 分離培養(yǎng)基的配制

2.1.1 LB培養(yǎng)基(適合培養(yǎng)細(xì)菌) 酵母浸粉5.0 g·L-1、蛋白胨10.0 g·L-1、氯化鈉5.0 g·L-1、瓊脂20.0 g·L-1，pH 7.0～7.2。高壓蒸汽滅菌后加入過濾除菌的制霉菌素(終質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1)。

2.1.2 MRS培養(yǎng)基(適合培養(yǎng)乳酸菌) 蛋白胨10.0 g·L-1、牛肉膏10.0 g·L-1、酵母浸粉5.0 g·L-1、檸檬酸氫二銨2.0 g·L-1、葡萄糖20.0 g·L-1、吐溫-80 1.0 mL·L-1、乙酸鈉5.0 g·L-1、磷酸氫二鉀2.0 g·L-1、硫酸鎂0.6 g·L-1、硫酸錳0.25 g·L-1、瓊脂20.0 g·L-1，pH 6.8。高壓蒸汽滅菌后加入過濾除菌的溴甲酚綠指示劑(終質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1)。

2.1.3 孟加拉紅培養(yǎng)基(適合培養(yǎng)真菌) 蛋白胨5.0 g·L-1、葡萄糖10.0 g·L-1、磷酸二氫鉀1.0 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1、1/3000孟加拉紅溶液100 mL·L-1，pH自然。高壓蒸汽滅菌后加入過濾除菌的鏈霉素(終質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1)。

2.1.4 高氏一號(hào)培養(yǎng)基(適合培養(yǎng)放線菌) 可溶性淀粉20.0 g·L-1、硝酸鉀1.0 g·L-1、磷酸氫二鉀0.5 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、氯化鈉0.5 g·L-1、硫酸亞鐵0.01 g·L-1、瓊脂20.0 g·L-1，pH 7.4～7.6。高壓蒸汽滅菌后加入過濾除菌的重鉻酸鉀(終質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1)。

2.2 微生物的分離純化

2.2.1 制備六神曲稀釋液 取樣品粉末0.5 g，在無菌條件下將其加至裝有49.5 mL無菌0.9%氯化鈉溶液，含玻璃小珠的250 mL錐形瓶中，振搖約20 min，使菌分散，得10-2稀釋度的菌懸液。從中吸取0.5 mL菌懸液，加至盛有4.5 mL無菌水的試管中，充分混勻。如上操作，依次制成10-3、10-4、10-5、10-6等稀釋度的菌懸液。

2.2.2 涂布 用無菌吸管分別吸取10-4、10-5、10-6稀釋度的菌懸液0.2 mL，滴入制好的平板中，用無菌涂布棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻。

2.2.3 培養(yǎng) 將LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將孟加拉紅培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.4 菌株純化 將培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行平板劃線，直到分出純的單菌落為止。

2.3 菌株鑒定

2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定 菌落形態(tài)：用接種針取單菌落，細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；真菌接種于孟加拉紅培養(yǎng)基，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌體在培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)與生長(zhǎng)情況。

顯微觀察：細(xì)菌用結(jié)晶紫染色，置于顯微鏡下觀察細(xì)菌結(jié)構(gòu)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色；酵母菌用美藍(lán)染色，置于顯微鏡下觀察；絲狀真菌用插片法進(jìn)行培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)過插片的位置后，取出玻片進(jìn)行顯微鏡觀察。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 細(xì)菌以菌落為模板，上游引物27F：5′GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，下游引物1495R：5′CTACGGCTACCTTGTTACGA3′，完成PCR擴(kuò)增。PCR體系為Fx KOD Buffer 12.5 μL、dNTP 0.4 μL、引物各0.3 μL、FX KOD酶0.4 μL、DMSO 1.25 μL、ddH2O 10μL。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)熱5 min，94 ℃變性1 min，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)30次，72 ℃保持10 min，16 ℃保溫。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行序列分析。

真菌以提取的基因組DNA為模板，上游引物NS1：5′GTAGTCATATGCTTGTCTC3′，下游引物NS2：5′GGCTGCTGGCACCAGACTTGC3′，完成PCR擴(kuò)增。

基因組提?。喝∨囵B(yǎng)的真菌一管，裝入細(xì)砂，用FastPrep儀器進(jìn)行操作(5 M·S-1，10 s，2次)。然后加入500 μL DES溶液和5 μLβ-巰基乙醇，混勻，65 ℃水浴30 min。加入500 μL水飽和苯酚∶三氯甲烷∶異戊醇(25∶24∶1)，12 000 r·min-1離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，再加500 μL水飽和苯酚∶三氯甲烷∶異戊醇(25∶24∶1)，沉淀一次。12 000 r·min-1離心5 min后，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入冷的70%乙醇混勻，-20 ℃沉淀2 h。12 000 r·min-1離心5 min，揮干殘余的乙醇，加入TER溶液溶解。

PCR體系為Easy Taq Buffer 2.5 μL、dNTP 1.0 μL、引物各1.0 μL、Easy Taq酶0.1 μL、DMSO 1.25 μL、模板0.5 μL、ddH2O 21 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)熱5 min，94 ℃變性1 min，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)30次，72 ℃保持10 min，16 ℃保溫。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行序列分析。

3 結(jié)果與分析

通過對(duì)六神曲炮制過程中不同時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行分離，總共得到細(xì)菌8種，酵母菌3種，絲狀真菌4種，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)所分菌株進(jìn)行綜合鑒定。

3.1 細(xì)菌

3.1.1 形態(tài)鑒定 各株細(xì)菌在LB平板上的菌落形態(tài)、顯微觀察及革蘭氏染色結(jié)果見表1。

表1 細(xì)菌形態(tài)描述

3.1.2 細(xì)菌種屬初步鑒定 將PCR測(cè)序結(jié)果提交至NCBI，與Gene Bank數(shù)據(jù)庫中已知基因序列進(jìn)行Blast對(duì)比，分析待測(cè)菌株與模式菌株的同源性。根據(jù)細(xì)菌菌株的16S rRNA序列比對(duì)分析結(jié)果及其形態(tài)學(xué)特征，并結(jié)合《細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《微生物分類學(xué)》等有關(guān)資料，對(duì)所分細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定，鑒定結(jié)果見表2。

表2 細(xì)菌種屬初步鑒定

3.2 酵母菌

3.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 各酵母菌在孟加拉紅平板上的菌落形態(tài)及顯微觀察情況見表3。

表3 酵母菌形態(tài)描述

3.2.2 酵母菌種屬初步鑒定 將PCR測(cè)序結(jié)果提交至NCBI，與Gene Bank數(shù)據(jù)庫中已知基因序列進(jìn)行blast對(duì)比，分析待測(cè)菌株與模式菌株的同源性。根據(jù)真菌菌株的18s rDNA序列比對(duì)分析結(jié)果及其形態(tài)學(xué)特征，并結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》和《微生物分類學(xué)》等有關(guān)資料，對(duì)所分酵母菌進(jìn)行初步鑒定，鑒定結(jié)果見表4。

表4 酵母菌種屬初步鑒定

3.3 絲狀真菌

3.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 各絲狀真菌在孟加拉紅平板上的菌落形態(tài)及顯微觀察見表5。

表5 絲狀真菌形態(tài)描述

圖1 SIPI-JDD-F-1的顯微圖譜

圖2 SIPI-JDD-F-2的顯微圖譜

圖3 SIPI-JDD-F-3的顯微圖譜

圖4 SIPI-JDD-F-4的顯微圖譜

3.3.2 絲狀真菌種屬初步鑒定 將PCR測(cè)序結(jié)果提交至NCBI，與Gene Bank數(shù)據(jù)庫中已知基因序列進(jìn)行blast對(duì)比，分析待測(cè)菌株與模式菌株的同源性。根據(jù)真菌菌株的18s rDNA序列比對(duì)分析結(jié)果及其形態(tài)學(xué)特征，并結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》和《微生物分類學(xué)》等有關(guān)資料，對(duì)所分絲狀真菌進(jìn)行初步鑒定，鑒定結(jié)果見表6。

表6 絲狀真菌種屬初步鑒定

4 結(jié)論與討論

以傳統(tǒng)發(fā)酵六神曲樣品為研究對(duì)象，從不同發(fā)酵過程樣品中分離得到8種細(xì)菌，3種酵母菌和4種絲狀真菌，并結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。目前從傳統(tǒng)發(fā)酵六神曲樣品中已分離并初步鑒定的微生物有絲狀真菌和酵母菌，其中絲狀真菌包括黃曲霉菌、產(chǎn)黃青霉菌、枝孢霉菌[1]、雜色曲霉、肉色曲霉、傘枝犁頭霉[3]，酵母菌包括淺白隱球酵母、釀酒酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母、扣囊擬內(nèi)孢酵母[2]。本文首次對(duì)分離得到的細(xì)菌進(jìn)行了初步鑒定，并分離得到4種其他文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道的絲狀真菌和2種酵母菌，為后續(xù)進(jìn)行六神曲純種發(fā)酵奠定了菌種基礎(chǔ)。其中，阪崎腸桿菌為致病菌，可能為六神曲發(fā)酵過程中的雜菌。此外，枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、爾青霉、亮白曲霉具有淀粉酶和蛋白酶活力，伯頓生絲畢赤酵母具有淀粉酶活力，為后續(xù)研究六神曲代謝產(chǎn)物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。以10%六神曲原料和2%瓊脂為斜面培養(yǎng)基對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，上述菌株在六神曲原料中均能夠正常生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度與狀態(tài)與其在LB培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中無異。說明上述分離得到的菌株在六神曲原料中生長(zhǎng)良好，可用于六神曲的純種發(fā)酵。將純種發(fā)酵六神曲代替?zhèn)鹘y(tǒng)的自然發(fā)酵，菌種固定，質(zhì)量可控，是六神曲實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的必然。

[1] 王秋紅，蘇陽，王荔慧，等.六神曲中真菌的分離與鑒定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(07)：122-126.

[2] 張麗霞，高文遠(yuǎn)，王海洋，等.六神曲中酵母菌的鑒定[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37(13)：1928-1931.

[3] 鄔吉野，李瑩，王德馨，等.六神曲的發(fā)酵菌種分離及純種發(fā)酵考察[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(16)：12-14.

[4] 杜連祥，路福平.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005.

[5] 胡靜，楊旭東，夏清平，等.中藥“神曲”中微生物的研究[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25(02)：19-20.

[6] 高慧，賈天柱.六神曲的發(fā)酵菌種分離及純種發(fā)酵考察[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33(20)：2323-2325.

[7] 莫小林，伍小燕，韋振源.10種中藥制劑微生物限度檢查方法學(xué)的驗(yàn)證[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(13)：56.

[8] 周德慶，張文治，強(qiáng)義國(guó).生物學(xué)教學(xué)[M].北京：中國(guó)學(xué)術(shù)期刊電子出版社，1981.

IdentificationandIsolationofMicroorganismsfromMedicatedLeavenduringItsProduction

JIA Dandan1，2，HUANGChunmin1，LIUying1，2，HUHaifeng1，2*

(1.SinopharmHealthIndustryInstitiuteCo，Ltd，Shanghai200437，China；2.ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry，Shanghai200040，China)

Objective：In order to elucidate the beneficial microorganisms in Medicated Leaven made by traditional fermented methods.Methods：Using classical microbial isolation and purification methods，the strains in Medicated Leaven samples were isolated and purified.The preliminary taxonomy of the strains isolated was carried out by investigating the morphological properties and analyzing and comparing their 16SrRNA or 18SrRNA gene sequence.Results：Eight species of bacteria，three species of yeasts and four species of filamentous fungi were isolated and identified in Medicated Leaven samples.The bacteria werePantoeaagglomerans，Staphylococcushaemolyticus，Enterobacterasburiae，Escherichiacoli，Bacillussubtilis，Bacilluscereu，Cronobactersakazakii，Pediococcuspentosaceus；the yeasts wereHyphopichiaburtonii，Debaryomyceshansenii，Pichiakudriavzevii；the filamentous fungi wereMucorcircinelloides，Mucorracemosus，Penicilliumcamemberti，Aspergilluscandidus.Conclusion：Many species of microorganisms exist in Medicated Leaven samples，which help to reconstruct modern fermentation technology of Medicated Leaven.

Medicated Leaven；fermentation；microorganism；isolation；identification

2015-12-31)

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)專項(xiàng)(201507004)

*

胡海峰，研究員，研究方向：微生物藥物研究與開發(fā)；Tel：(021)62892873，E-mail：haifenghu88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.023