李鑫焱程橋凡浙錄張恒海張倩

酮咯酸氨丁三醇和羅哌卡因合用對(duì)小鼠創(chuàng)口愈合的影響

李鑫焱①程橋②凡浙錄②張恒海②張倩②

目的：研究酮咯酸氨丁三醇和羅哌卡因?qū)?chuàng)面粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的表達(dá)和傷口愈合的影響。方法：選取清潔級(jí)雄性成年昆明小鼠128只，隨機(jī)分為四組，D組小鼠腹腔注射等劑量的氯化鈉溶液0.1 mL/（kg·12 h）；L組于傷口周圍浸潤(rùn)注射0.5%的羅哌卡因1 mL/（kg·12 h）；N組腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射液5 mg/（kg·12 h）；H組腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射5 mg/（kg·12 h）復(fù)合創(chuàng)口周圍浸潤(rùn)注射0.5%的羅哌卡因1 mL/（kg·12 h）。在小鼠手術(shù)切口模型完成后的第3、7、10天，每次不放回地從每組中隨機(jī)抽取8只小鼠隨后用Elisa法測(cè)定剪取組織中的GM-CSF濃度，并觀測(cè)每組剩余8只小鼠的切口愈合時(shí)間和情況。結(jié)果：H組小鼠在第7、10天時(shí)傷口GM-CSF 表達(dá)較D組高（P<0.05）；在愈合時(shí)間上，H組較D組的愈合時(shí)間短（P<0.05）；在愈合后瘢痕面積來看，H組的瘢痕面積較L組?。≒<0.05），與D組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：酮咯酸氨丁三醇和羅哌卡因合用可促進(jìn)小鼠創(chuàng)面粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)，加快傷口的愈合，且不會(huì)引起瘢痕的過度增生。

酮咯酸氨丁三醇； 羅哌卡因； 傷口愈合

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

隨著外科發(fā)展以及各種鎮(zhèn)痛藥物的發(fā)展更新，術(shù)后鎮(zhèn)痛已經(jīng)成為了臨床麻醉鎮(zhèn)痛的一個(gè)受到廣泛關(guān)注的問題。隨著現(xiàn)代疼痛學(xué)的發(fā)展和各種鎮(zhèn)痛藥物的不斷更新?lián)Q代，術(shù)后鎮(zhèn)痛也由單模式單種藥物鎮(zhèn)痛逐漸發(fā)展為多模式、多種藥物復(fù)合應(yīng)用鎮(zhèn)痛。藥物復(fù)合應(yīng)用可以減小單個(gè)藥物的用量，同時(shí)可以達(dá)到良好的鎮(zhèn)痛效果。其中，傷口周圍浸潤(rùn)局麻藥作為一種操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉且不良反應(yīng)少的術(shù)后鎮(zhèn)痛方式，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用。羅哌卡因是一種長(zhǎng)效的酰胺類局麻藥物，曾有學(xué)者在氣管插管全麻開顱手術(shù)聯(lián)合應(yīng)用羅哌卡因阻滯頭皮神經(jīng)，結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用羅哌卡因組血流動(dòng)力學(xué)較單純?nèi)榻M穩(wěn)定，鎮(zhèn)痛效果良好[1]。非甾體類抗炎藥通過抑制環(huán)氧合酶（COX）的活性抑制前列腺素的生成，在術(shù)后鎮(zhèn)痛中發(fā)揮著重要的作用。有劉付麗[2]的研究顯示，在腹腔鏡膽囊切除術(shù)后腹腔內(nèi)注射羅哌卡因并靜脈注射帕瑞昔布鈉具有良好的鎮(zhèn)痛效果，減少術(shù)后嗎啡用量。第一代非甾體類抗炎藥物——酮咯酸氨丁三醇，是第一個(gè)可供注射的非甾體類鎮(zhèn)痛藥物。有實(shí)驗(yàn)支持酮咯酸氨丁三醇用于燒傷患者的術(shù)后鎮(zhèn)痛效果較好，不良反應(yīng)少這一結(jié)論[3]。而這些藥物在臨床上應(yīng)用于術(shù)后鎮(zhèn)痛時(shí)雖然可以達(dá)到鎮(zhèn)痛的效果，但其對(duì)手術(shù)切口的愈合是否有影響還尚待研究。GM-CSF即粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)其有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，有臨床觀察研究顯示，應(yīng)用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子可以促進(jìn)深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的愈合，并防止感染[4]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，0.5%羅哌卡因用于傷口局部浸潤(rùn)可以促進(jìn)GM-CSF的表達(dá)，有促進(jìn)傷口愈合的作用[5]。本課題主要研究的是羅哌卡因和酮咯酸氨丁三醇合用對(duì)創(chuàng)口周圍的GM-CSF的表達(dá)及創(chuàng)面的愈合是否有影響。

1　材料與方法

1.1材料 取8周齡清潔的雄性昆明小鼠128只，體重30～40 g（山西省腫瘤醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。小鼠GM-CSF ELISA試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）、酮咯酸氨丁三醇注射液、鹽酸羅哌卡因注射液。

1.2分組 128只小鼠隨機(jī)分為四組，每組32只，分別為對(duì)照組（D組）、羅哌卡因組（L組）、酮咯酸氨丁三醇組（N組）、酮咯酸氨丁三醇聯(lián)合羅哌卡因組（H組）。

1.3模型制備 清潔級(jí)雄性昆明小鼠128只，0.6%戊巴比妥鈉以0.1 mL/10 g行腹腔麻醉，麻妥后固定背部皮膚，用電動(dòng)剃毛器剃去小鼠頸部以下約3 cm×3 cm大小面積的體毛，以脊柱正中，頸部以下約1 cm處標(biāo)記約1 cm×1 cm的方形標(biāo)記。常規(guī)消毒，沿標(biāo)記做全層皮膚缺損。D組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.1 mL/（kg·12 h），L組于創(chuàng)口周圍浸潤(rùn)注射0.5%羅哌卡因0.1 mL/（kg·12 h），N組小鼠腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射液5 mg/（kg·12 h），H組小鼠腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射5 mg/（kg·12 h）并且創(chuàng)口周圍浸潤(rùn)注射0.5%羅哌卡因1 mL/（kg·12 h），并將各只小鼠單籠飼養(yǎng)。

1.4標(biāo)本處理 于術(shù)后第3、7、10天從各組中隨機(jī)取8只小鼠處死，后剪取距創(chuàng)口4 mm的包括創(chuàng)面的皮膚組織，所取標(biāo)本清理后置于-80 ℃冰箱中保存。將所取標(biāo)本制成勻漿后離心，留取上層清液，用雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa法）測(cè)定剪取的皮膚組織中GM-CSF的濃度，為了減少剪取組織的誤差，筆者同時(shí)選用BCA測(cè)定蛋白法測(cè)定組織中的總蛋白濃度，計(jì)算兩者的比值以比較各組標(biāo)本中GM-CSF的含量。其余小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至其創(chuàng)面完全愈合，并記錄其完全愈合所需要的天數(shù)和愈合后的瘢痕面積。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1GM-CSF的表達(dá) 小鼠造模成功后第3、7、10天從各組中隨機(jī)取8只小鼠處死后所取的創(chuàng)面皮膚組織，用Elisa法測(cè)定組織中GM-CSF的濃度，并用BCA蛋白法測(cè)定組織中總的蛋白濃度，計(jì)算出每只小鼠的GM-CSF的濃度/總蛋白濃度的比值，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析[5]。

1.5.2創(chuàng)面完全愈合所需時(shí)間和愈合后瘢痕的面積 將四組剩余的小鼠繼續(xù)給藥直至創(chuàng)面完全愈合并記錄創(chuàng)面完全愈合所需要的天數(shù)。后將這些小鼠處死，剪取距瘢痕周圍1 cm左右的皮膚，在手術(shù)顯微鏡下觀察瘢痕的寬度和長(zhǎng)度并測(cè)量記錄[6]。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析法（ANOVA），組間相互比較采用LSD-t檢驗(yàn)的方法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1創(chuàng)面GM-CSF含量 在創(chuàng)面形成后的第3、7、10天，各組創(chuàng)面的GM-CSF占總蛋白的比值逐漸降低，各組之間第3天GM-CSF占總蛋白的百分比比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），第7、10天，各組之間GM-CSF占總蛋白的百分比比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1　小鼠創(chuàng)面GM-CSF/BCA比值（±s） %

表1　小鼠創(chuàng)面GM-CSF/BCA比值（±s） %

組別　第3天　第7天　第10天D組（n=8）　28.013±6.219　20.862±4.885　12.938±7.504※▲N組（n=8）　30.088±8.349　20.900±5.124　11.950±5.039 L組（n=8）　32.925±5.454　31.063±6.688*△　23.938±4.178 H組（n=8）　33.000±7.640　27.575±5.499#　20.213±8.417 F值　0.948　6.590　6.286 P值　0.431　0.002　0.002

2.2創(chuàng)面愈合時(shí)間和愈合后瘢痕面積 各組愈合時(shí)間、瘢痕面積比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見表2。

表2　各組小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間和愈合后瘢痕面積（±s）

表2　各組小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間和愈合后瘢痕面積（±s）

*與L組比較，P<0.001；△與H組比較，P=0.002；#與H組比較，P=0.008；※與D組比較，P=0.014；▲與L組比較，P=0.019

組別　愈合時(shí)間（d）　瘢痕面積（mm2）D組（n=8）　18.875±2.167*△　11.526±2.876 N組（n=8）　20.125±2.475　10.149±2.615 L組（n=8）　12.000±2.000#　18.649±2.437 H組（n=8）　15.125±2.100　15.187±3.154※▲F值　22.694　15.111 P值　<0.001　<0.001

3　討論

創(chuàng)口愈合的過程是機(jī)體對(duì)外來損傷所做出修復(fù)的過程。一般包括以下4個(gè)階段：止血、炎癥、增殖與重新塑形階段。其中，創(chuàng)傷后所引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)在傷口的愈合中有非常重要的作用。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）是一種多功能造血生長(zhǎng)因子，可刺激造血前體細(xì)胞增殖、分化、向外周轉(zhuǎn)移，又可誘導(dǎo)多種細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等的分化、增殖、活化，而且對(duì)其他細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及皮膚黏膜細(xì)胞等具有刺激生長(zhǎng)作用[7]，曾被Kaplan等最早在1992年首次把GM-CSF引入急性皮膚創(chuàng)面治療，證實(shí)創(chuàng)周注射rhGM-CSF證實(shí)可促進(jìn)急性皮膚缺損創(chuàng)面愈合[8]。在體外，他們發(fā)現(xiàn)GM-CSF 可刺激角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，是誘導(dǎo)朗罕細(xì)胞分裂增殖的主要因子。本實(shí)驗(yàn)組前期研究證明，于小鼠傷口周圍局部浸潤(rùn)0.5%的羅哌卡因，傷口周圍組織的GM-CSF的濃度升高，且創(chuàng)面愈合時(shí)間縮短，證明創(chuàng)周浸潤(rùn)羅哌卡因可以促進(jìn)創(chuàng)口的愈合[5]。

酮咯酸氨丁三醇是一種非選擇性的環(huán)氧合酶（COX）抑制劑，它主要是通過抑制COX的活性發(fā)揮止痛的作用。Cepeda等[9]的研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后應(yīng)用酮咯酸可以明顯減少術(shù)后嗎啡的用量，證明其有強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用。COX包括三種：COX-1、COX-2、COX-3，其中COX-2是前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶。譚趙云[10]等有研究表明，COX-2和VEGF的表達(dá)存在一定的正相關(guān)性，并且在增生性瘢痕中存在高表達(dá)的現(xiàn)象。

由本實(shí)驗(yàn)中可以看出，在造模后第7、10天，與對(duì)照組比較，羅哌卡因組的創(chuàng)口GM-CSF的表達(dá)明顯升高（P<0.05），證明創(chuàng)面周圍浸潤(rùn)羅哌卡因可促進(jìn)切口周圍GM-CSF分泌，與本實(shí)驗(yàn)組前期得出羅哌卡因用于傷口局部浸潤(rùn)可以促進(jìn)GM-CSF的表達(dá)這一結(jié)果吻合[5]。在造模后的第10天，酮咯酸氨丁三醇組GM-CSF分泌較對(duì)照組低（P<0.05），推測(cè)可能是酮咯酸氨丁三醇抑制了GM-CSF的表達(dá)，但尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。第7、10天，酮咯酸氨丁三醇和羅哌卡因合用組與對(duì)照組比較，小鼠切口周圍GM-CSF的表達(dá)上升（P<0.05），但合用組GM-CSF的表達(dá)低于羅哌卡因組（P<0.05），推測(cè)可能是羅哌卡因促進(jìn)了創(chuàng)面周圍的GM-CSF的分泌。有實(shí)驗(yàn)研究顯示，COX-2在抑制樹突狀細(xì)胞的分化成熟方面有重要作用，并且GM-CSF可刺激樹突狀細(xì)胞的分化[11]，但并未有證據(jù)顯示COX-2與GM-CSF之間存在關(guān)聯(lián)性。說明兩種藥物合用可以促進(jìn)創(chuàng)口周圍GM-CSF分泌，但促進(jìn)作用不如單純局部浸潤(rùn)羅哌卡因明顯。

在愈合時(shí)間方面看，羅哌卡因組愈合所用時(shí)間較對(duì)照組短（P<0.05），也證實(shí)了羅哌卡因促進(jìn)傷口愈合這一結(jié)論[5]。而與對(duì)照組比較，兩種藥物合用創(chuàng)口愈合所用時(shí)間縮短（P<0.05），說明兩種藥物合用可以加速創(chuàng)面的愈合，縮短愈合時(shí)間。從瘢痕的面積比較來看，羅哌卡因組的瘢痕面積大于對(duì)照組（P<0.05），可能與GM-CSF可以直接和間接促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和分泌膠原，且促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF-6）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β （TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子有關(guān)[12]，其中VEGF可以直接促進(jìn)血管新生，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性[13]。而這些細(xì)胞因子被證明與病理性瘢痕的形成、增生有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚[14]。其中，而酮咯酸氨丁三醇組的瘢痕面積較對(duì)照組?。≒<0.05），推測(cè)可能是酮咯酸氨丁三醇抑制了瘢痕增生。羅嘉倫等[15]采用小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，在50 μmol/L的尼美舒利的作用下，小鼠創(chuàng)口愈合時(shí)間與對(duì)照組相比無明顯差異，而創(chuàng)面則可以達(dá)到最佳修復(fù)效果，證明COX-2在病理性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要的調(diào)控作用。而本實(shí)驗(yàn)中酮咯酸氨丁三醇為非選擇性的COX抑制劑，也與其研究結(jié)果較為吻合。而兩種藥物合用時(shí)瘢痕的面積要小于羅哌卡因組（P<0.05），且瘢痕較為光滑平整，可能和酮咯酸氨丁三醇抑制病理性瘢痕的作用有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種藥物合用時(shí)可促進(jìn)創(chuàng)面GM-CSF的分泌，縮短小鼠創(chuàng)口愈合時(shí)間，而酮咯酸氨丁三醇又可通過抑制COX-2的活性來抑制瘢痕過度增生，促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)，但兩種藥物合用促進(jìn)傷口愈合的機(jī)制、是否有藥物相互的作用尚不十分清楚。另外，兩種藥物合用時(shí)各種藥物的最適濃度、合用的時(shí)機(jī)、同時(shí)又能達(dá)到良好的鎮(zhèn)痛效果等等問題仍是以后的實(shí)驗(yàn)中需要研究的方向。

[1]謝柳昭，李剛.羅哌卡因用于頭皮神經(jīng)阻滯效果的護(hù)理對(duì)策[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2013，11（13）：74-75.

[2]劉付麗，唐紅麗，董曉西，等.帕瑞昔布聯(lián)合腹腔內(nèi)羅哌卡因用于腹腔鏡膽囊切除術(shù)后鎮(zhèn)痛[J].肝膽胰外科雜志，2011，23（1）：21-23.

[3]李榮，張中軍.酮咯酸氨丁三醇用于燒傷患者術(shù)后鎮(zhèn)痛效果觀察[J].山東醫(yī)藥，2010，50（34）：108-109.

[4]楊尚凱.深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面治療與愈合后的關(guān)系[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2014，12（5）：132-133.

[5]王文璽，程橋，田首元，等.局麻藥物對(duì)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)及皮膚愈合的影響[J].中國(guó)藥物與臨床，2014，14（6）：756-758.

[6]羅嘉倫.不同濃度尼美舒利對(duì)皮膚傷口愈合的干預(yù)研究[D].湛江：廣州醫(yī)學(xué)院，2010.

[7]徐鯤，楊敏，孫靜，等.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子促進(jìn)兔手術(shù)聯(lián)合化療后的切口愈合[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33 （1）：102-105.

[8] Mann A，Breuhahn K，Schirmacher P，et al.Keratinocytederived granulocytemacrophagecolony stimulating factor accelerates wound healing：Stimulation of keratinocyte proliferation，granulation tissue formation， and vascularization[J]. Invest Dermatol，2001，117（6）：1382-1390.

[9] Cepeda M S，Carr D B，Miranda N， et al.Comparison of morphine，ketorolac，and their combination for postoperative pain-results from a large，randomized，double-blind trial[J]. Anesthesiology，2005，103（6）：1225-1232.

[10]譚趙云，趙柏程，錢利，等.COX-2 和VEGF 在增生性瘢痕中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)美容整形外科雜志，2008，19（5）：348-352.

[11]張苜.環(huán)氧合酶抑制劑在胃癌上清液中培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞分化成熟和功能的影響[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2006.

[12]郭敏，崔文慧，黃宏，等.粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子與創(chuàng)面愈合[J].創(chuàng)傷外科雜志，2011，13（3）：279-282.

[13]王天祥，鄒高峰，李超，等.CGF中VEGF、TGF-β1含量測(cè)定及其對(duì)軟組織創(chuàng)傷愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2013，11（10）：140-141.

[14]武元元，張選奮.病理性瘢痕形成中VEGF 表達(dá)及調(diào)控的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12（26）：5178-5181.

[15]羅嘉倫，涂臘根，潘麗，等.COX-2信號(hào)通路及其調(diào)控對(duì)皮膚傷口愈合的干預(yù)研究[J].解剖學(xué)研究，2011，33（2）：101-104.

Effects of Ketorolac Tromethamine Combine with Ropivacaine on Wound Healing in Mice

LI Xinyan，CHENG Qiao，F(xiàn)AN Zhe-lu，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：024-027

Objective：To study the effect of ketorolac tromethamine and ropivacaine on the expression of GM-CSF involved in wound healing.Method：The 128 healthy adult male Kunming mice，cleaning grade，were randomly divided into four groups and group D assigned to be injected intraperitoneally Saline with a equal dose 0.1 mL/（kg·12 h）.Group L injected 0.5% Ropivacaine 1 mL/（kg·12 h） around the cut.N group intraperitoneally Ketorolac Tromethamine 5 mg/（kg·12 h）.Group H injected Ropivacaine 1 mL/（kg·12 h）around the cut combineing with intraperitoneally Ketorolac Tromethamine 5 mg/（kg·12 h），respectively，in 12 hours.After the completion of the incision in mice models，we randomly selected eight mice without being putted back from every group at the 3rd，the 7thand the 10thday，then measured the expression of GM-CSF by Elisa. The rest 8 mice in the every group would be continued to feed to heal completely in order to record the time that the wound healing takes and observe the intertion status.Result：The expression of GM-CSF between group H and D were compared，group H was higher at 7th，10thday（P<0.05）.The healing time of group H was shorter than that of group D（P<0.05）.The area of scar in the group H was smaller than group L（P<0.05），compared with group D，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Ropivacaine combining with Ketorolac Tromethamine can increase the expression of GM-CSF and promote the healing of wound without causing the excessive scar hyperplasia.

Ketorolac Tromethamine； Ropivacaine； Wound healing

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.007

①山西醫(yī)科大學(xué) 山西 太原 030001

②山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

程橋

2015-12-10） （本文編輯：蔡元元）