趙榮文,譚麗萍,劉同軍

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院,濟南 250353

溶菌酶(lysozyme)存在于卵清、唾液等生物分泌液中,能夠催化細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖 N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵的水解。當(dāng)與帶負(fù)電荷的病毒蛋白相互結(jié)合時,溶菌酶能夠與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽[1],這種復(fù)鹽可使病毒失去活力。根據(jù)溶菌酶的結(jié)構(gòu)和起源分為六大類[2],即c型溶菌酶；g型溶菌酶；i型溶菌酶；植物源溶菌酶；微生物源溶菌酶和噬菌體T4溶菌酶。溶菌酶的作用很廣泛,越來越多人的研究人員開始關(guān)注溶菌酶,綜述了溶菌酶常用的分離純化方法以及其應(yīng)用。

1 分離純化方法

1.1 超濾法

超濾法是根據(jù)分子大小不同,使用不同大小孔徑的膜進行分離純化。陳姍姍[3]將畢赤氏基因重組酵母發(fā)酵液經(jīng)過離心分離、超濾、膜分離、陽離子交換樹脂吸附后,得到溶菌酶,經(jīng)真空干燥后酶活可達(dá) 20 000 U/mg,通過這一系列步驟吸附后,大大提高了純化效率。

1.2 親和萃取法

在親和萃取中,一種配基與另一種成相聚合物以共價相結(jié)合,由于這種配基與要提取的目的產(chǎn)品有較高的親和力,這樣體系雙水相處理量大,而且親和層析專一性高。有研究人員建立了一種利用辛巴藍(lán)修飾的新型離子液體[C4MIM]3CB高效萃取雞蛋清中溶菌酶的方法[4],并利用蛋白結(jié)構(gòu)模型,計算其與[C4MIM]3CB的結(jié)合能,與其它已有的萃取分離方法相比,此法選擇性高、操作簡便、產(chǎn)品純度高,為蛋清中溶菌酶的提取分離提供了一條新的、高效的途徑。

1.3 離子交換法

離子交換法是根據(jù)溶液中不同帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異來達(dá)到分離純化效果的一種方法。溶菌酶屬于堿性蛋白質(zhì),可使用弱酸型陽離子交換樹脂對其進行分離。鄧晗等[5]研究了一種重組人溶菌酶的分離純化方法,采用固液分離、膜過濾、疏水層析及離子交換層析對重組人溶菌酶進行分離純化,結(jié)果表明該方法可獲得重組人溶菌酶的單一組分,純化后的重組人溶菌酶可與人溶菌酶抗體特異性結(jié)合,方法簡單易操作,成本低。

1.4 吸附法

吸附法是選用一些吸附劑來吸附溶菌酶,由于這些吸附劑吸附力較弱,或者易引起蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用不廣,由此,研究人員開始選用凝膠或者通過組裝新的復(fù)合材料來分離提取溶菌酶,還有人通過分子印跡來選擇識別分離溶菌酶,大大提高了溶菌酶的提取率。

Li等[6]通過Ca2+和戊二醛(GA)制備了藻酸鹽(SA)/羧甲基纖維素(CMC)凝膠珠交聯(lián)并研究了它們在水溶液中對溶菌酶的吸附性能。利用SA和CMC上具有豐富的活性羧基,所獲得的SA/CMC凝膠珠具有優(yōu)異的整合溶菌酶的高吸附性能。與此同時,可以制備一種以殼聚糖、檸檬酸和人發(fā)纖維組合的復(fù)合材料來吸附溶菌酶[7],有效的提高溶菌酶的提取率。Kamini Mishra等[8]利用納米金屬離子和溶菌酶的相互作用來吸附溶菌酶,溶菌酶被物理吸附在納米顆粒表面上。已知溶菌酶和納米金屬離子之間相互作用是因為強大的靜電引力作用,這里反映出熵有可能成為吸附過程中的重要因素的結(jié)論。溶菌酶的識別和分離也可以通過羥乙基丙烯酸酯和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯在聚多巴胺修飾的二氧化鈦納米顆粒上的自由基聚合來實現(xiàn)[9],制備溶菌酶印跡二氧化鈦納米粒子用于溶菌酶的選擇性識別和分離。大大提高了溶菌酶的提取率,實現(xiàn)了在蛋白質(zhì)分離過程中的有效識別,甚至能夠從稀釋的蛋清中分離溶菌酶。

2 應(yīng) 用

2.1 在食品方面的應(yīng)用

溶菌酶在食品中應(yīng)用極其廣泛,無論是將其作為單一的防腐劑還是配合其他的試劑一起發(fā)揮作用,包括將溶菌酶的某些特性提高后再與其他聚合物配合使用,都有顯而易見的效果,溶菌酶在食品行業(yè)的應(yīng)用技術(shù)已經(jīng)比較成熟,作為一種無毒蛋白質(zhì),可以選擇性地分解微生物的細(xì)胞壁。

王者[10]將溶菌酶脂質(zhì)體添加到菜籽色拉油中研究其脂溶性,結(jié)果顯示溶菌酶脂質(zhì)體脂溶性較好,可減緩感官的下降速率,抑制菌落總數(shù)增加和硫代巴比妥酸值和pH值的上升等。同時Khairuddin N等[11]在小麥基活性包裝薄膜中加入溶菌酶,加入溶菌酶的薄膜具有防潮的性質(zhì),堅韌有力。Badun等[12]對溶菌酶吸附的動力學(xué)和等溫線以及溶菌酶與載體結(jié)合的強度進行研究,結(jié)果顯示溶菌酶的吸附使材料的表面更親水,而且達(dá)到吸附平衡的速度取決于溶菌酶溶液滲透到碳材料孔隙中的能力。聚乙烯表面的溶菌酶吸附是可逆的,而在活性炭和石墨箔的表面上不可逆。楊偉杰等[13]發(fā)現(xiàn)溶菌酶與甘氨酸可組合提升對G-細(xì)菌的溶解力。溶菌酶與葡萄糖氧化酶、乳過氧化氫酶組合使用可強化水產(chǎn)品防腐保鮮效果。溶菌酶固定在聚合物上也可以應(yīng)用于食品包裝的表面,溶菌酶被包埋在不同的聚合物中[14],如聚乙烯醇薄膜,顯示出抗微生物活性。

2.2 溶菌酶的生物學(xué)功能

溶菌酶有殺菌免疫功能,是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子。當(dāng)溶菌酶被應(yīng)用于生物學(xué)方面時更多的是將溶菌酶進行生物學(xué)改造后發(fā)揮更大的作用,例如使用克隆技術(shù)深入分析溶菌酶的生物結(jié)構(gòu),可以精準(zhǔn)有效的利用其特性進行應(yīng)用。

Cabrefiga等[15]利用BP100(同源多功能十一肽)與溶菌酶的協(xié)同效應(yīng),BP100與溶菌酶的結(jié)合減少了達(dá)到細(xì)胞死亡所需的時間和最低抑菌濃度,BP100肽與溶菌酶結(jié)合后,即使在植物提取物存在下,BP100對抗解淀粉歐文氏菌的殺菌活性也會增加,并且在植物預(yù)防火疫病的侵襲上也會有所增強。

不止在疾病方面有所作用,有研究者通過克隆某些溶菌酶增加了在免疫學(xué)方面的研究價值,Liu等[16]首次克隆并鑒定了P.fulvidraco LysG基因(一種g-型溶菌酶),經(jīng)驗證,PfLysG在調(diào)節(jié)病原體感染的先天免疫反應(yīng)中起重要作用,PfLysG在腎,脾和腸中高度表達(dá)。在分別用脂多糖和多核糖核苷酸多聚胞苷酸模擬病原體攻擊后,PfLysG的mRNA表達(dá)在免疫組織的不同時間點顯著上調(diào)。結(jié)果表明,P.fulvidraco的g-型溶菌酶參與先天免疫應(yīng)答。劉然然等[17]通過對大鯢c-型、g-型溶菌酶基因進行克隆及鑒定,分析其結(jié)構(gòu)特征,推測其保守性。結(jié)果表明,大鯢c-型和g-型溶菌酶及兩棲動物溶菌酶具有較高的同源性,兩者在肝臟和胃中表達(dá)量最高,大鯢c-型溶菌酶在肌肉和腦中表達(dá)量最低,大鯢g-型溶菌酶在肌肉和皮膚中表達(dá)量最低。

Jordan等[18]利用溶菌酶及相關(guān)溶解度等實驗,研究了多價陰離子影響蛋白質(zhì)之間相互作用和蛋白質(zhì)凈電荷的能力。在低離子強度條件下,高價陰離子通過改變?nèi)芫阜肿又g的靜電相互作用,能夠更有效地降低溶菌酶和溶菌酶之間的排斥,而多價陰離子會導(dǎo)致溶菌酶凈電荷的逆轉(zhuǎn)和高離子強度下的過充電。不止是溶菌酶相互之間會產(chǎn)生相互作用,溶菌酶與肽酶的相互作用可以抑制瘤胃原生動物,Park等[19]確定了不同的溶菌酶和肽酶化學(xué)抑制劑對瘤胃原生動物及其相關(guān)原核生物的影響,尾狀芽孢桿菌依賴于溶菌酶和肽酶來消化和利用被吞噬的微生物,特異性抑制這些酶可以抑制尾狀芽孢桿菌。也就意味著通過特異性抑制溶菌酶和肽酶來抑制瘤胃原生動物。

2.3 在生物材料方面的應(yīng)用

溶菌酶可以作為模型蛋白,促進蛋白質(zhì)晶體、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系和蛋白質(zhì)與界面的相互作用機制等研究[20]。劉輝等[21]以卵清溶菌酶為生物模板,硼氫化鈉為還原劑,制備銠鎳合金納米纖維、鈀銅合金納米纖維。制備出納米纖維相比于商業(yè)催化劑分別有更好的氧化還原性和催化氧化活性。

研究表明可以用金納米顆粒制備的PVA-溶菌酶微泡顯示出比沒有金納米粒子的PVA-溶菌酶微泡有更大的光學(xué)消光值[22],這些值隨著金納米粒子的濃度增加而增加,兩種類型的微泡都顯示出對革蘭氏陰性大腸桿菌的抗菌活性,含有金納米粒子的氣泡比前者表現(xiàn)更好。

Ely等[23]研究從牛和羊的臨床標(biāo)本中分離出54株莫拉菌,對浮游細(xì)胞和無梗細(xì)胞的生物膜形成能力和溶菌酶敏感性進行了體外評價。結(jié)果表明浮游形態(tài)的莫拉菌具有溶菌酶活性。但是在固結(jié)生物膜方面溶菌酶沒有能力消除預(yù)形成的生物膜。

徐子明等[24]選取卵清溶菌酶通過人工干預(yù)和設(shè)計塑造成特定狀態(tài)的纖維模板,進行了鉑、鈀、金貴金屬納米材料的溫和可控自組裝,結(jié)果表明,卵清溶菌酶纖維模板對鉑納米晶形貌有主導(dǎo)作用。對所制備的鉑、鈀納米晶進行相關(guān)的電催化性能測試,不同結(jié)構(gòu)形貌的納米晶因粒子大小、排列方式等不同表現(xiàn)出不同的電催化活性。

Somu等[25]使用蛋清溶菌酶和牛載脂蛋白α乳清蛋白通過優(yōu)化的脫溶劑技術(shù)制備超分子蛋白納米組裝體,該組裝體證明了基于植物化學(xué)的抗癌劑的高負(fù)載能力,比如姜黃素負(fù)載的組裝體在24 h內(nèi)誘導(dǎo)了包括小鼠黑素瘤在內(nèi)的所有癌細(xì)胞的細(xì)胞活力降低了90%以上。所以載有姜黃素的超分子蛋白納米組裝體將成為一種新的癌癥療法,它通過雙重治療機制的戰(zhàn)略模式發(fā)揮作用。細(xì)菌纖維素在治理水污染方面發(fā)揮作用,Silva 等[26]制備了雙納米纖維生物吸附膜,是利用纖維素納米纖維和溶菌酶納米纖維組成的,用于去除水溶液中的汞。在pH11接觸24 h后,pH依賴性去除率達(dá)到99%,接近溶菌酶蛋白的等電點,其殘留濃度低于人類飲用水的指導(dǎo)值。

2.4 溶菌酶在其他方面的研究及應(yīng)用

近幾年來,人們對溶菌酶的不同方面進行了不同程度的改進及研究,包括對溶菌酶進行改性、溶菌酶制品的檢測方法等。

張齊等[27]把i-型溶菌酶與海參溶菌酶比較,i-型溶菌酶對指示菌溶壁微球菌具有明顯的抑菌作用。溶菌酶在海參先天免疫系統(tǒng)中起重要作用,是機體應(yīng)對病原菌的重要免疫應(yīng)答因子。Dyakova等[28]利用X射線小角散射研究沉淀陽離子類型對溶菌酶溶液結(jié)構(gòu)的影響,當(dāng)加入沉淀劑時,在溶菌酶溶液中除單體外,還有大量二聚體和八聚體。隨著離子半徑的增大,一價離子Li+-Na+-K+系列中八聚體的分?jǐn)?shù)增加,這與不同的鹽存在時溶菌酶的溶解度數(shù)據(jù)一致。八聚物分?jǐn)?shù)隨著沉淀劑濃度的增加和溫度的降低而增加,在所有類型的沉淀劑中都有所體現(xiàn)。Guo等[29]利用光譜技術(shù)研究了溶菌酶與離子液體[C4mim]BF4、[C4mim]Cl、[C4mim]Br和[dmim]I在水溶液中的結(jié)合區(qū)域。加入離子液體可以增強肽鍵價電子躍遷,從而提高溶菌酶在210 nm處的吸收峰強度。四種離子液體均可滅活溶菌酶的熒光團,且隨著離子液體濃度的增加,滅活效果更加明顯。且溶菌酶分子活性位點上的兩個Trp62和Trp108殘基主要參與溶菌酶分子與離子液體的相互作用。

Jie等[30]探究了3種取代度的羧甲基纖維素與溶菌酶之間的靜電相互作用,結(jié)果顯示取代度越高,與溶菌酶的靜電相互作用越強,溶菌酶的抑菌性隨著羧甲基纖維素取代度的增加而逐漸降低。Aich等[31]通過研究得出溶菌酶有在膠體金納米粒子表面吸附和膠體金納米粒子的聚集這兩個相互作用。在膠體金納米粒子表面吸附溶菌酶,利用靜電作用在溶菌酶和膠體金納米粒子之間形成基態(tài)絡(luò)合物,進入到膠體金納米粒子表面形成電暈和重新定位。聚集是由溶菌酶分子通過與檸檬酸封頂膠體金納米粒子的表面結(jié)合,中和表面電荷。

李曉穎等[32]建立重組人溶菌酶滴眼液的無菌檢測方法,經(jīng)驗證,重組人溶菌酶滴眼液對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用。Epaud等[33]確定了給藥外源性溶菌酶會進一步增強體內(nèi)細(xì)菌的殺滅,急性肺部感染時內(nèi)源性溶菌酶增加,早期給藥外源性溶菌酶進一步提高體內(nèi)細(xì)菌的殺滅能力。且人溶菌酶比雞蛋溶菌酶和兔溶菌酶對枯草芽孢桿菌的抗性更強,數(shù)據(jù)還表明,對于需要氣管插管和難以治療的肺炎患者,氣管內(nèi)給予溶菌酶可能是一種可行的常規(guī)治療的輔助手段。

劉紀(jì)紅等[34]通過對溶菌酶進行改性,把溶菌酶進行化學(xué)修飾,增強溶菌酶的殺菌能力,拓展溶菌酶的抗菌譜和溶菌范圍。張永勤等[35]將溶菌酶把表面脫乙?；讱に仡w粒作為載體,戊二醛為交聯(lián)劑進行固定化,可提高溶菌酶的熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。Xue等[36]研究了固定化溶菌酶和天然溶菌酶對提高污泥脫水能力的性能,分析表明污泥絮凝結(jié)構(gòu)在天然和固定的溶菌酶處理下被破壞,提高了污泥的沉降能力,固定的溶菌酶在經(jīng)過循環(huán)后仍具有活性。

Andrea等[37]制備不同氨基酸功能化氧化鐵磁性納米粒子驗證了納米顆粒能夠顯著抑制溶菌酶淀粉樣蛋白纖維化并破壞淀粉樣原纖維。納米顆粒會影響溶菌酶的滯后和生長曲線的穩(wěn)態(tài)階段。Wu 等[38]通過優(yōu)化溶菌酶納米脂質(zhì)體的制備,模擬胃腸液和腸液的溶菌酶的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn),在37 ℃時胃腸液和腸液具有一定的穩(wěn)定性,表明制備和優(yōu)化的溶菌酶納米脂質(zhì)體是穩(wěn)定的。

近幾年,改性溶菌酶的出現(xiàn),重組人溶菌酶等,這些改進拓寬了溶菌酶的應(yīng)用范圍,溶菌酶和其他物質(zhì)相結(jié)合組裝成新的材料進行其他應(yīng)用,為溶菌酶在科研等各個方面的研究提供了依據(jù)。

3 總結(jié)及展望

對溶菌酶的分離純化以及最近的研究進展進行的綜合分析可以發(fā)現(xiàn)溶菌酶憑借著獨特的性質(zhì)展示了廣泛的使用價值,近幾年,研究者已經(jīng)把溶菌酶應(yīng)用到了各個方面,特別是當(dāng)把溶菌酶進行改性之后,溶菌酶相應(yīng)的特性被擴大,比如將溶菌酶進行化學(xué)修飾,從而增強溶菌酶的殺菌能力,拓展溶菌酶的抗菌譜和溶菌范圍,再將變性后的溶菌酶使用到食品、生物材料、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,溶菌酶發(fā)揮的作用就更明顯,其利用價值也相應(yīng)增加。

近幾年,溶菌酶的應(yīng)用越來越廣泛,但是溶菌酶的產(chǎn)量問題是限制其應(yīng)用的重要因素,利用基因工程,化學(xué)修飾等方法提高溶菌酶的產(chǎn)量迫在眉睫。研究者制備了溶菌酶-果膠復(fù)合體,但未對該復(fù)合體進行全面評價,需要進一步探究其特性,有望進一步開發(fā)納米凝膠負(fù)載抗癌藥物及開發(fā)急緩控釋,靶向定位于一體的功能化納米載體。為了提高溶菌酶活性,利用酶解溶菌酶形成多肽產(chǎn)物來提高溶菌酶的抑菌效果,再加以應(yīng)用到某些生物藥物中,會具有重大的研究意義。