蔣子雯　周志敏　唐紅波　杜　博　張其清　代蔭梅*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科， 北京 100026； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

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· 更年期與婦科內(nèi)分泌 ·

乙酰普魯蘭納米粒子BeWo b30細(xì)胞毒性及攝取研究

蔣子雯1周志敏2唐紅波1杜博2張其清2代蔭梅1*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科， 北京 100026； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

目的通過乙酰普魯蘭納米粒子對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞(BeWo b30)的細(xì)胞毒性以及細(xì)胞攝取研究，為普魯蘭基納米藥物跨胎盤屏障機(jī)制及妊娠期用藥提供科學(xué)依據(jù)。方法以透析法制備異硫氰酸熒光素標(biāo)記的乙酰普魯蘭納米粒子(fluorescein isothiocyanate labelled pullulan acetate nanoparticles， PA-FITC NPs)，分別利用激光粒度分析儀、掃描電鏡、透射電鏡考察乙酰普魯蘭納米粒子粒徑、Zeta電位、形貌及結(jié)構(gòu)；用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8， CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，考察不同濃度納米粒子(0.4～2.0 mg/mL)對(duì)BeWo b30細(xì)胞的細(xì)胞毒性；考察納米粒子濃度、孵育時(shí)間、孵育溫度對(duì)BeWo b30細(xì)胞攝取納米粒子的影響。結(jié)果PA-FITC納米粒子水合直徑為(348.0114.3)nm，Zeta電位為(-26.05.1)mV，呈表面光滑、內(nèi)部結(jié)構(gòu)規(guī)整的球形。PA-FITC納米粒子在0.4～2.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)細(xì)胞存活率為95.0%～100.5%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BeWo b30細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明：細(xì)胞吞噬納米粒子的量隨著PA-FITC NPs的濃度升高和孵育時(shí)間延長(zhǎng)而增大；當(dāng)孵育溫度從37 ℃降低至4 ℃，PA-FITC NPs的細(xì)胞攝取量顯著降低(P<0.05)。結(jié)論乙酰普魯蘭納米粒子呈球形，對(duì)BeWo b30細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性；BeWo b30細(xì)胞攝取PA-FITC 納米粒子與納米粒子濃度、孵育時(shí)間和孵育溫度呈正相關(guān)。

普魯蘭； BeWo b30細(xì)胞； 納米藥物； 妊娠期用藥

由于藥物遞送系統(tǒng)具有提高療效、減小不良反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，從而使載體合成及生物學(xué)評(píng)價(jià)成為生物醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)之一[1-2]。普魯蘭(pullulan)是一種水溶性天然多糖，由于良好的生物相容性、易修飾性及肝靶向性在肝癌及婦科腫瘤靶向制劑研究中受到關(guān)注[3-5]。然而，由于妊娠期婦女處于特殊生理時(shí)期及胎兒易感性，普魯蘭基納米粒子的孕期用藥安全性、納米藥物宮內(nèi)靶向遞送還未見報(bào)道。因此，在課題組前期乙酰普魯蘭納米粒子(pullulan acetate nanoparticles， PA-NPs)制備及抗腫瘤藥物遞送工作基礎(chǔ)上[1，4]，本課題組考察其對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞BeWo b30細(xì)胞毒性及細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取行為，為妊娠期用藥安全性及藥物遞送提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器和材料

恒溫磁力攪拌器(HPB220，江蘇安豐公司)；離心機(jī)(KA-1000， 芬蘭Thermo公司)；激光粒度分析儀(Nano-ZS，英國(guó)Malvern公司)；掃描電子顯微鏡(SUPRA 55VP，德國(guó)Carl Zeiss公司)； 透射電子顯微鏡(JEM100CXⅡ，日本電子株式會(huì)社)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；單人雙面凈化工作臺(tái)(SW-CJ-1F，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(Elipse Ti，日本Nikon公司)；全波長(zhǎng)掃描多功能酶標(biāo)儀(Varioskan Flash3001，芬蘭Thermo公司)； Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

人絨毛膜癌細(xì)胞BeWo b30由德克薩斯大學(xué) Erik Ritting 教授惠贈(zèng)。DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、HBSS緩沖液、PBS緩沖液均購自Gibico公司(美國(guó))。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)購自同仁研究所(日本)。

異硫氰酸熒光素標(biāo)記的乙酰普魯蘭(fluorescein isothiocyanate labelled pullulan acetate， PA-FITC)由本課題組前期合成。二甲基亞砜購自江天化工(天津)； 曲拉通、透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量8 000～14 000)購自索萊寶公司(北京)；96孔底透黑板、96孔全黑酶標(biāo)板購自Corning公司(美國(guó))；碳支持膜購自新興百瑞技術(shù)有限公司(北京)。

1.2方法

1)PA-FITC納米粒子的制備：精密稱取10 mg PA-FITC放入2 mL二甲基亞砜/水溶液(9∶1)過夜溶解。將完全溶解的PA-FITC溶液加入透析袋中透析，透析液為Milli-Q超純水。透析48 h，每2 h換液1次，全程避光。收集透析袋內(nèi)液體，定容，4 ℃冰箱避光保存、待用。

2)PA-FITC納米粒子表征：①粒徑和Zeta電位測(cè)定:取制備的PA-FITC納米粒子溶液20 μL，以適量超純水分散后置于粒徑樣品池，使用粒徑分析儀測(cè)量納米粒子的粒徑和Zeta電位。②納米粒子電鏡觀察: 取制備的納米粒子溶液20 μL，滴于表面潔凈的硅片上，自然干燥后20 mA噴金4 min，掃描電鏡下觀察；滴注于碳支持膜表面，自然干燥后在透射電鏡下觀察。

3)細(xì)胞培養(yǎng)：人絨毛膜癌細(xì)胞BeWo b30使用含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2。3～4 d細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。

4)BeWo b30細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)及PA-FITC NPs細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：CCK-8試劑，配制為與培養(yǎng)基體積比為1∶10的檢測(cè)體系。細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)胰蛋白酶消化，離心后重新分散為單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以每孔1萬個(gè)的密度接種于96孔板，并設(shè)置無細(xì)胞組進(jìn)行對(duì)照。待接種24 h細(xì)胞完全貼壁后吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3遍后加入110 μL CCK-8檢測(cè)體系，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱孵育2 h后，吸取100 μL上清液轉(zhuǎn)移至另一塊96孔板，使用酶標(biāo)儀震搖1 min混勻后450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值，連續(xù)測(cè)量9 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

以每孔1萬個(gè)細(xì)胞密度將BeWo b30接種于96孔板，24 h貼壁后各組加入100 μL不同質(zhì)量濃度的納米粒子溶液(2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.06、 0.03 mg/mL)，并設(shè)置0 mg/mL培養(yǎng)基組作為空白對(duì)照。孵育48 h后棄上清，加入CCK-8檢測(cè)體系，2 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。

5)納米粒子細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BeWo b30細(xì)胞，EDTA/胰蛋白酶蛋白消化，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔1萬個(gè)接種于96孔底透黑板，隔日換液。細(xì)胞融合至80%即可進(jìn)行攝取實(shí)驗(yàn)。

取生長(zhǎng)至融合的BeWo b30細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基后用預(yù)熱的PBS緩沖液沖洗3次。每孔加入100 μL預(yù)熱的HBSS緩沖液，37 ℃、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2平衡細(xì)胞30 min。取出細(xì)胞，棄上清后加入HBSS緩沖液稀釋的不同質(zhì)量濃度(400、200、100、50、25 μg/mL)的PA-FITC納米粒子100 μL，同時(shí)設(shè)置無細(xì)胞HBSS組和有細(xì)胞HBSS組作為空白對(duì)照，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。37 ℃孵育4 h后取出細(xì)胞，迅速棄上清，冰冷的PBS緩沖液清洗3次終止吞噬。4 h后裂解細(xì)胞，494 nm激發(fā)波長(zhǎng)處測(cè)量熒光值。調(diào)整孵育溫度為4 ℃，考察溫度對(duì)納米粒子攝取的影響。

在時(shí)間依賴性攝取研究中，取生長(zhǎng)至融合狀態(tài)的BeWo b30細(xì)胞，每孔加入400 μg/mL PA-FITC納米粒子100 μL，分別孵育0、2、15 min、1、2、4、6 h。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置HBSS組作為對(duì)照。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后，迅速吸棄上清，冰冷的PBS洗3次終止吞噬。每孔加入細(xì)胞裂解液100 μL，避光4 ℃裂解過夜，裂解液混合均勻，利用酶標(biāo)儀在494 nm激發(fā)波長(zhǎng)處測(cè)量熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1PA-FITCNPs制備及表征

如圖1A所示，掃描電鏡顯示PA-FITC納米粒子表面光滑，成均勻球形，粒徑約為100 ～ 250 nm。圖1A 透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)表明PA-FITC納米粒子為實(shí)心結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering， DLS)結(jié)果顯示，納米粒子平均水合直徑為348 nm，與電鏡檢測(cè)結(jié)果比較，水合直徑偏大(圖1B)。同時(shí)，DLS粒徑分布較寬，這與掃描電鏡粒徑分布不均一致。Zeta電位測(cè)定顯示PA-FITC NPs電荷分布呈尖峰，帶負(fù)電荷，為(-26±5.1)mV。

2.2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及PA-FITC NPs細(xì)胞毒性

BeWo b30細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行體外培養(yǎng)，約24 h貼壁。細(xì)胞融合80%時(shí)在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈鋪路石狀緊密排列(圖2A)，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示(圖2B)，在接種后第1天至第6天，細(xì)胞呈指數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì)，第7天細(xì)胞密度達(dá)到最大值。從第7天之后，細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)漂浮和細(xì)胞碎片，表明細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期。

當(dāng)細(xì)胞貼壁后，取不同質(zhì)量濃度(0.4～2.0 mg/mL)的PA-FITC NPs與細(xì)胞孵育4 h，將未作處理的BeWo b30細(xì)胞 (0 mg/mL組) CCK-8吸光度值設(shè)為100%，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度納米粒子組細(xì)胞存活率分別為95% ～ 100.48% (圖3)，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3乙酰普魯蘭納米粒子細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

2.3.1時(shí)間依賴性攝取

如圖4A所示，加入PA-FITC納米粒子后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取逐漸增加(P<0.05)，其中2 min至15 min，PA-FITC NPs在細(xì)胞裂解液中的濃度由0.36 μg/mL上升至2.62 μg/mL，增幅呈最大趨勢(shì)。15 min、1 h、4 h時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞仍持續(xù)攝取納

圖1　異硫氰酸熒光素標(biāo)記的乙酰普魯蘭納米粒子表征

A： BeWo b30 cells under optical microscope； B： size distribution of PA-FITC NPs by dynamic light scattering，dynamic light scattering， the mean diameter of PA-FITC NPs were 348 nm.

圖2　BeWo b30細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

A： light microscopic images of BeWo b30 grown on culture dish； B： cell growth curve of BeWo b30 (n=6).

米粒子，但升高趨勢(shì)較2 min至15 min時(shí)間段平緩。4 h至6 h時(shí)間段細(xì)胞對(duì)PA-FITC NPs攝取速度較之前呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，納米粒子在細(xì)胞裂解液中的質(zhì)量濃度由5.22 μg/mL上升至7.66 μg/mL。

2.3.2濃度/溫度依賴性攝取

如圖4B所示，在不同孵育溫度條件下，細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取均隨質(zhì)量濃度升高而逐漸增大，但4 ℃組的增幅顯著低于37 ℃組(P<0.05)。而且，納米粒子質(zhì)量濃度由200 μg/mL升至400 μg/mL時(shí)攝取量增幅最大，4 ℃組細(xì)胞裂解液中PA-FITC NPs質(zhì)量濃度由2.70 μg/mL升高至6.27 μg/mL，37 ℃組由0.29 μg/mL升高至0.58 μg/mL。

3　討論

與游離藥物相比，納米藥物遞送系統(tǒng)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如減少給藥次數(shù)、維持血藥濃度、提高藥物療效、

圖3　暴露于0.4～2.0 mg/mL PA-FITC NPs 4 h后

Values represent average% of untreated control±SD. No significant cell viability difference were observed between control group and PA-FITC NPs group；n=6； PA-FITC NPs：fluorescein isothiocyanate labelled pullulan acetate nanoparticles.

圖4　BeWo b30對(duì)PA-FITC NPs的攝取特征

A： cell uptake of PA-FITC NPs in BeWo b30 cells in ranging incubation time (n=6)， * each time point data shows significantly difference with other incubation time points； B：dose-effect of PA-FITC NPs to cell uptake under 4 ℃ and 37 ℃ (n=6)， * significantly different was observed at each concentration point in the same temperature； #significantly difference was observed beteween two temperature points in the same concentration； PA-FITC NPs：fluorescein isothiocyanate labelled pullulan acetate nanoparticles.

降低不良反應(yīng)等。通過調(diào)控納米粒子尺寸、形狀、表面電荷、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及化學(xué)組分，納米粒子作為藥物載體可達(dá)到靶向組織或器官，優(yōu)化藥物釋放速率，從而提高藥效以及患者依從性[5]。普魯蘭是一種水溶性天然多糖，易于功能化改性修飾合成不同種類的兩親性聚合物，從而利用自組裝原理制備出載藥納米粒子，并已用于宮頸癌和肝癌等腫瘤的靶向遞送研究[5-6]。

本文參照課題組前期方法[4]，將普魯蘭進(jìn)行乙?；杷男詾橐阴Ｆ蒸斕m，并偶聯(lián)異硫氰酸熒光素合成PA-FITC以便于檢測(cè)示蹤。將PA-FITC完全溶解于二甲基亞砜中放入透析袋透析，在有機(jī)溶劑與水的緩慢交換下兩親性高分子自組裝為表面光滑的球形納米粒子，粒徑分析儀測(cè)得粒徑為348 nm，表面電荷為(-26.0±5.1)mV，說明其在中性條件下穩(wěn)定不易聚集，結(jié)合課題組前期工作[4]分析，進(jìn)一步表明該納米粒子具有穩(wěn)定性好，制備重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)。BeWo b30細(xì)胞系來源于人絨毛膜癌組織，表達(dá)與滋養(yǎng)層細(xì)胞類似的載體蛋白[7]，有在多孔膜上形成緊密極化的單層細(xì)胞特性，并分泌人絨毛膜促性腺激素等胎盤特異性標(biāo)志物，因此常用來模擬建立體外胎盤屏障，用于研究各種藥物或納米粒子的胎盤透過性，為妊娠期用藥安全提供科學(xué)依據(jù)。本研究首先繪制了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，該細(xì)胞在培養(yǎng)4～7 d為快速生長(zhǎng)期，具有聚集生長(zhǎng)的特性，細(xì)胞鋪滿后呈鋪路石狀，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致。7 d后細(xì)胞進(jìn)入衰退期，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，后出現(xiàn)成塊浮起。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果以及觀察生長(zhǎng)狀態(tài)有助于考察細(xì)胞在培養(yǎng)環(huán)境中的生長(zhǎng)情況，對(duì)建立胎盤屏障模型中的細(xì)胞接種密度以及確立模型最佳使用時(shí)間具有指導(dǎo)意義。

納米粒子在表現(xiàn)出巨大應(yīng)用價(jià)值的同時(shí)，其生物安全性，尤其對(duì)妊娠期母體和胎兒的正負(fù)面影響亟待評(píng)估[9]。目前已經(jīng)有研究[10-11]報(bào)道，納米粒子可穿過大鼠胎盤并進(jìn)入胎鼠肝、脾和腦，并造成胎鼠發(fā)育不良，普魯蘭基納米粒子對(duì)母體或胎兒是否存在毒性和其他影響尚未有研究報(bào)道。本文進(jìn)行的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PA-FITC納米粒子0.4 ～ 2.0 mg/mL各組細(xì)胞存活率與空白組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，證明PA納米粒子對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞無毒性，體外安全性好，可能適合作為婦產(chǎn)科，尤其妊娠期靶向用藥的藥物載體。

攝取實(shí)驗(yàn)表明，BeWo b30細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取具有明顯的質(zhì)量濃度依賴性，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)細(xì)胞對(duì)PA的攝取隨質(zhì)量濃度升高而升高，在37 ℃組中納米粒子的胞內(nèi)質(zhì)量濃度隨給予質(zhì)量濃度的升高由0.65 μg/mL 升至6.27 μg/mL，但在本文考察質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞對(duì)PA-FITC NPs的攝取并未出現(xiàn)平臺(tái)期，說明本文考察的質(zhì)量濃度還未到達(dá)細(xì)胞吞噬的飽和質(zhì)量濃度。在考察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)(0 min ～ 6 h)細(xì)胞對(duì)PA-FITC NPs的攝取隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)線性升高趨勢(shì)。Kloet等[12]研究了BeWo b30細(xì)胞單層胎盤屏障模型對(duì)聚苯乙烯納米粒子的攝取，Transwell小室下室納米粒子濃度在0～ h時(shí)間段內(nèi)與孵育時(shí)間呈正相關(guān)，與本文研究結(jié)果一致，在12 h后下室納米粒子的濃度趨于穩(wěn)定。Gitrowski等[13]研究了結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2對(duì)二氧化鈦納米粒子的攝取，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取在早期急劇升高，之后攝取速度逐漸變緩，24 h時(shí)攝取趨于穩(wěn)定。說明本文所考察的時(shí)間點(diǎn)尚未達(dá)到BeWo b30細(xì)胞的攝取飽和時(shí)間點(diǎn)，在胎盤模型研究中，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)考察時(shí)間。

通常認(rèn)為納米粒子進(jìn)入細(xì)胞具有溫度依賴性，常采用37 ℃和4 ℃作為溫度依賴性攝取的研究溫度[14]。當(dāng)溫度由37 ℃降至4 ℃時(shí)，細(xì)胞對(duì)PA-FITC納米粒子的攝取顯著減少(P<0.05)，溫度降低后，細(xì)胞為低活動(dòng)狀態(tài)，說明納米粒子進(jìn)入細(xì)胞的途徑具有顯著能量依賴性，而不是單純的從高質(zhì)量濃度到低質(zhì)量濃度的擴(kuò)散[15]。然而，PA-FITC納米粒子被攝取后在細(xì)胞內(nèi)的具體位置，以及被攝取的具體途徑和機(jī)制等問題仍需要進(jìn)一步探討[16]。同時(shí)，PA-FITC NPs能否通過滋養(yǎng)層細(xì)胞，以及PA-FITC NPs通過胎盤屏障的特點(diǎn)需要在體外單層胎盤屏障模型或胎盤離體灌流模型中作進(jìn)一步的評(píng)估。

總之，本研究以普魯蘭作為原料，制備了一種方法簡(jiǎn)單、安全性好、穩(wěn)定性高的納米藥物載體，考察了乙酰普魯蘭納米粒子對(duì)BeWo b30細(xì)胞的毒性及其在該細(xì)胞的攝取特征，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)普魯蘭基納米粒子在妊娠期用藥安全性和應(yīng)用潛力提供了科學(xué)依據(jù)。

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編輯孫超淵

Cell toxicity and cell uptake study of pullulan acetate nanoparticles to BeWo b30 cells

Jiang Ziwen1， Zhou Zhimin2， Tang Hongbo1， Du bo2， Zhang Qiqing2， Dai Yinmei1*

(1.DepartmentofGynecology，BeijingObstetricsandGynecologyHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100026，China； 2.TianjinKeyLaboratoryofBiomedicalMaterials，InstituteofBiomedicalEngineering，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Tianjin300192，China)

ObjectiveTo provide evidence for application in obstetrics field of drugs during pregnancy and the mechanism of pullulan-base nanoparticles across the placental barrier by investigating the cell uptake of pullulan acetate nanoparticles and the cell toxicity of pullulan acetate nanoparticles to BeWo b30 cells. MethodsThe fluorescein isothiocyanate labelled pullulan acetate nanoparticles (PA-FITC NPs) were prepared by using dialysis method. The methods to investigate the characteristics involved particle size and distribution, zeta potential and morphology of nanoparticles using dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy. The growth curve of BeWo b30 and the cell toxicity of different concentration of PA-FITC NPs were studied by cell counting kit-8. The influence of different NPs concentration, incubation time and incubation temperature on cell up-taking were observed in this study.ResultsThe prepared pullulan acetate nanoparticles are solid and spherical in shape. The mean diameter of PA-FITC NPs by DLS were (348.0±114.3)nm and the Zeta potential was (-26.0±5.1)mV. Cell viability in all concentration groups have no significant difference compared with the control group (P>0.05); higher PA-FITC NPs concentration and longer incubation time showed an increased cell uptake; cell uptake was decreased significantly after the temperature was reduced to 4℃. ConclusionThe results demonstrated that there was no obvious toxic effect of pullulan acetate nanoparticles on BeWo b30 cells; There is a positive correlation between cell uptake and the concentration, incubation time and environment temperature of PA-FITC NPs.

pullulan； BeWo b30； nanomedicine； drug delivery in pregnancy

國(guó)家自然科學(xué)基金(81301322)，天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(15JCQNJC14400)。 This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81301322)， Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(15JCQNJC14400).

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.04.002]

R 318

2016-06-15)

*Corresponding author， E-mail：fcyydym@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-07-2021∶18網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160714.2118.050.html