錢 軍，劉 元，2，郭成旭，朱 超，承澤農(nóng)

人參對(duì)胃癌SGC-7901側(cè)群細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

錢 軍1，劉 元1，2，郭成旭1，朱 超1，承澤農(nóng)3

目的 探討人參對(duì)胃癌SGC-7901側(cè)群（SP）細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。方法 分選SP和非側(cè)群（NSP）細(xì)胞；熬制人參湯劑，制備人參含藥血清；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax表達(dá)；建立裸鼠移植瘤模型，繪制瘤體生長(zhǎng)曲線，計(jì)算抑瘤率；免疫組化法檢測(cè)瘤體Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果 SP細(xì)胞生理鹽水（NS）組移植瘤體積明顯大于NSP細(xì)胞NS組（P＜0.05），NS組移植瘤體積明顯大于相應(yīng)人參組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），SP細(xì)胞人參組移植瘤體積與NSP細(xì)胞人參組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SP組和NSP組人參的抑瘤率分別為43.04%、31.55%；Western blot及免疫組化顯示人參可抑制移植瘤Bcl-2、誘導(dǎo)Bax的表達(dá)，與相應(yīng)NS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 SP細(xì)胞的成瘤能力較NSP細(xì)胞強(qiáng)，人參可以抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。

側(cè)群細(xì)胞；非側(cè)群細(xì)胞；裸鼠移植瘤；人參

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.006.html

胃癌是臨床上較為常見的腫瘤，手術(shù)、化療的治療效果均不理想。研究［1-3］表明惡性腫瘤對(duì)化療不敏感的主要原因是側(cè)群細(xì)胞的高致瘤性以及對(duì)藥物的抵抗，側(cè)群細(xì)胞（side population，SP）是一類能通過ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)體將DNA結(jié)合的Hoechst 33342燃料外排出細(xì)胞的一群細(xì)胞［4］?，F(xiàn)已在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞，并證明具有高增殖、高致瘤性及耐藥特性［3，5］。因此有效的干預(yù)SP細(xì)胞，可以較好地控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。人參是我國(guó)較為常見的傳統(tǒng)藥材，是五加科人參屬植物，其藥理作用表現(xiàn)多樣，研究［6-7］顯示人參對(duì)胃癌是有一定的治療作用并且能夠提高胃癌患者術(shù)后的生存率，但人參對(duì)胃癌SP及非側(cè)群（NSP）細(xì)胞的研究較少。該實(shí)驗(yàn)采用藥物血清干預(yù)胃癌SGC7901分選細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化；建立裸鼠移植瘤模型，應(yīng)用免疫組化技術(shù)，來探究人參對(duì)SP細(xì)胞的移植瘤生長(zhǎng)及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 裸鼠購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，品種品系：BALB/c-nu，SPF級(jí)，4周齡，均為雌性。新西蘭大白鼠由蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及藥材 RPMI-1640不完全培養(yǎng)液（含有雙抗，青霉素：80 U/ml；鏈霉素：0.08 mg/ ml）、胰酶消化液、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自杭州四季青公司；Hocehst33342染料購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；維拉帕米購(gòu)自上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；兔抗人Bcl-2一抗、兔抗人Bax一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自韓國(guó)BIOSHARP公司；人參由蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房提供。

1.3方法

1.3.1人參湯劑、含藥血清的制備 取人參15 g，以去離子水煎煮，控制生藥濃度在0.2 g/ml。4℃保存?zhèn)溆?。選擇純種新西蘭大白兔10只，約2.0 kg，隨機(jī)分為生理鹽水（NS）組和人參組，根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”用藥劑量按如下公式計(jì)。家兔用藥量［g/（kg·d）］=人日用劑量×0.007/1.5［g/（kg·d）］。每組動(dòng)物按等體積灌胃，每天2次，連續(xù)灌胃2周，末次灌胃前禁食不禁水12 h。末次灌胃后1 h，水合氯醛催眠大白兔，無菌心臟采血，分離收集血清，過濾除菌，EP管分裝，-20℃保存。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞放入37℃、5%CO2、95%濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)至90%后予以1∶3傳代。

1.3.3SP細(xì)胞的分選 取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，消化，4℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用4℃預(yù)冷的PBS（含2%FBS）將細(xì)胞重懸。取其中兩只離心管作為加入維拉帕米的拮抗組，余下的離心管作為實(shí)驗(yàn)組，加Hoechst33342染料，培養(yǎng)箱中孵育、振蕩。孵育后4℃、1 000 r/min離心5 min，繼續(xù)用4℃預(yù)冷的PBS（含2%FBS）將細(xì)胞重懸至1×106/ml。流式細(xì)胞儀器中檢測(cè)分選，在350 nm波長(zhǎng)紫外激發(fā)Hoechst33342，得到熒光呈雙重波長(zhǎng)：藍(lán)光402～446 nm，紅光650～670 nm，分別收集SP細(xì)胞及NSP細(xì)胞。

1.3.4Western blot法檢測(cè)SP及NSP細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 將SP、NSP細(xì)胞消化、4℃、1 000 r/ min離心5 min，分4組，SP及NSP細(xì)胞NS組、SP及NSP細(xì)胞人參組，分別加入不含人參藥物血清和含10%人參藥物血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，重懸計(jì)數(shù)后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，干預(yù)24、48 h后提取蛋白，BCA法定量后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉液4℃封閉4 h，分別加入1∶200稀釋的Bcl-2、Bax抗體，4℃孵育過夜，洗膜后再加入1∶6 000稀釋的二抗，4℃孵育2 h后洗膜。應(yīng)用Quantity One軟件（Bio-Rad）分析掃描蛋白條帶的光密度，取目的蛋白條帶光密度值與相應(yīng)β-actin光密度值之比為其相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5裸鼠接種細(xì)胞懸液的制備 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞，消化離心（4℃、1 000 r/ min離心5 min）后棄上清液；用PBS重懸細(xì)胞，取0.1 ml稀釋10倍；用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色后，血球計(jì)數(shù)板記數(shù)活細(xì)胞，當(dāng)活細(xì)胞比率＞95%，稀釋細(xì)胞濃度至5×106/ml。

1.3.6裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 取裸鼠20只，隨機(jī)分為2組，SP細(xì)胞組和NSP細(xì)胞組，取相應(yīng)的細(xì)胞懸液并混勻，取0.2 ml接種于裸鼠右腋部偏后方皮下，再隨機(jī)分為SP細(xì)胞NS組、NSP細(xì)胞NS組和SP細(xì)胞人參組、NSP細(xì)胞人參組。于接種細(xì)胞24 h后，實(shí)驗(yàn)組予以0.5 ml人參，對(duì)照組予以0.5 ml NS灌胃，每日1次。觀察裸鼠狀態(tài)和移植瘤的生長(zhǎng)情況，每3 d測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)/短徑（a/b），計(jì)算瘤體體積V，V=a×b2/2；第32天處死裸鼠，剝離瘤體，稱取重量，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率（%）=（NS組相對(duì)重量-相應(yīng)人參組相對(duì)重量）/NS組相對(duì)重量×100%。

1.3.7免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中Bcl-2、Bax的表達(dá) 將瘤組織常規(guī)切片后脫蠟水化；抗原修復(fù)，用FBS代替一抗做陰性對(duì)照；加1滴3%H2O2溶液至每張切片，孵育10 min（常溫、避光）；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加1滴一抗至每張切片，常溫下孵育2 h；PBS洗3次，每次5 min；滴加1滴聚合物增強(qiáng)劑至每張切片，室溫下孵育20 min，PBS洗3次，每次3 min；滴1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物至每張切片，室溫下孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加1滴新配置的DAB液至每張切片，顯微鏡下控制發(fā)色，自來水沖洗終止顯色；Mayer蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞百分比（PP）：在400倍的顯微鏡下，選取5個(gè)不同視野，每個(gè)視野數(shù)2遍，取其平均值，作為該視野的陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)與該視野中細(xì)胞總數(shù)的比為陽性細(xì)胞百分比。然后將5個(gè)視野的陽性細(xì)胞百分比求平均值，作為該片子的PP。無陽性細(xì)胞記為0分，PP在10%以下計(jì)1分；11%～50%計(jì)2分；51%～75%計(jì)3分；75%以上計(jì)4分。染色強(qiáng)度（SI）：無色為0分，淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將每張切片的PP×SI得到該免疫組化的評(píng)分（IRS）［8］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。單因素兩均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，多均數(shù)間的比較用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1人胃癌細(xì)胞株SGC7901中SP細(xì)胞的分選流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株SGC-7901中SP細(xì)胞的比例為（1.53±0.47）%，維拉帕米阻斷后SP細(xì)胞的比例降為0.1%。見圖1。

2.2含藥血清對(duì)SP、NSP細(xì)胞中Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)影響 Western blot結(jié)果顯示，與NSP細(xì)胞NS組比較，SP細(xì)胞NS組Bcl-2表達(dá)較高（P＜0.05），Bax無明顯差異。與SP細(xì)胞NS組比較，SP人參24 h/48 h組Bcl-2逐步降低，Bax僅在SP人參48 h組出現(xiàn)明顯增高（P＜0.05）；較NSP細(xì)胞NS組，NSP人參24 h/48 h組Bcl-2無明顯變化，Bax逐漸升高（P＜0.05）。Bcl-2在含藥血清干預(yù)24 h SP細(xì)胞組和NSP細(xì)胞組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在含藥血清干預(yù)48 h SP細(xì)胞組和NSP細(xì)胞組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Bax含藥血清干預(yù)24 h/48 h NSP細(xì)胞組明顯高于SP細(xì)胞組（P＜0.05）。見圖2、表1。

圖1　胃癌細(xì)胞株SGC-7901 SP細(xì)胞檢測(cè)圖A：SP細(xì)胞；B：維拉帕米對(duì)照組

表1　含藥血清干預(yù)細(xì)胞后Bcl-2、Bax的表達(dá)值（n=3±s）

表1　含藥血清干預(yù)細(xì)胞后Bcl-2、Bax的表達(dá)值（n=3±s）

組別Bcl-2F值P值BaxF值P值SP細(xì)胞0.27±0.02 SP細(xì)胞人參（24 h）0.25±0.01417.26＜0.0010.29±0.00763.00＜0.001 SP細(xì)胞人參（48 h）0.05±0.020.48±0.01 NSP細(xì)胞NS0.31±0.050.29±0.04 NSP細(xì)胞人參（24 h）0.24±0.077.05＜0.050.54±0.0453.51＜0.001 NSP細(xì)胞人參（48 h）NS0.43±0.01 0.23±0.01 0.94±0.12

圖2　含藥血清干預(yù)細(xì)胞后Bcl-2、Bax的表達(dá)

2.3人參對(duì)裸鼠及移植瘤的影響 裸鼠情況均較好，實(shí)驗(yàn)過程中無裸鼠死亡。各組裸鼠于接種細(xì)胞后5 d可見移植瘤。在SP及NSP細(xì)胞組中，NS組移植瘤體積均大于相應(yīng)人參組，SP細(xì)胞NS組瘤體體積明顯大于NSP細(xì)胞NS組（P＜0.01，P＜0.05），SP細(xì)胞人參組與NSP細(xì)胞人參組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。處死裸鼠后，稱瘤體重量，SP細(xì)胞NS組、人參組瘤體重量分別為（3.09± 0.45）、（1.76±0.14）g，NSP細(xì)胞NS組、人參組瘤體重量分別為（2.06±0.06）、（1.41±0.35）g。SP細(xì)胞NS組瘤體重量大于NSP細(xì)胞NS組、SP細(xì)胞NS組，NSP細(xì)胞NS組的重量均大于相應(yīng)人參組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.05、6.28、4.10，P＜0.001）；兩人參組間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.09，P＞0.05），計(jì)算得出SP細(xì)胞組及NSP細(xì)胞組人參的抑瘤率分別為43.04%、31.55%。見表2。

圖3　人參對(duì)胃癌分選細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響A：SP細(xì)胞NS組與NSP細(xì)胞NS組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線間的比較；B：SP細(xì)胞NS組與SP細(xì)胞人參組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線間的比較；C：NSP細(xì)胞NS組與NSP細(xì)胞人參組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線間的比較；D：SP細(xì)胞人參組與NSP細(xì)胞人參組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線間的比較

2.4移植瘤組織中Bcl-2、Bax的表達(dá) 免疫組化檢測(cè)結(jié)果見圖4，各蛋白染色為黃色、深棕黃色、棕褐色不等，均在胞質(zhì)內(nèi)著色。Bcl-2在SP細(xì)胞NS、NSP細(xì)胞NS組的表達(dá)均高于相應(yīng)人參組，并且在SP細(xì)胞NS組的表達(dá)比NSP細(xì)胞NS組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），兩人參組的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bax在SP細(xì)胞NS組、NSP細(xì)胞NS組的表達(dá)均低于相應(yīng)的人參組，在SP細(xì)胞NS組的表達(dá)比NSP細(xì)胞NS組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），而兩人參組的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

圖4　人參對(duì)腫瘤組織中Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 SP×400A：SP細(xì)胞NS組；B：SP細(xì)胞人參組；C：NSP細(xì)胞NS組；D：NSP細(xì)胞人參組；1：Bcl-2；2：Bax

表3　各組腫瘤組織Bcl-2、Bax的IRS平均分值（n=5，±s）

表3　各組腫瘤組織Bcl-2、Bax的IRS平均分值（n=5，±s）

組別Bcl-2t值P值Baxt值P值SP細(xì)胞NS7.4±1.348.22＜0.0012.8±0.844.49＜0.01 SP細(xì)胞人參2.2±0.458.0±2.45 NSP細(xì)胞NS5.6±0.898.53＜0.0011.4±0.556.78＜0.001 NSP細(xì)胞人參1.6±0.556.0±1.41

3　討論

近些年來就中國(guó)傳統(tǒng)藥物對(duì)胃癌治療的研究已成為研究熱點(diǎn)，其原因歸結(jié)于中藥對(duì)腫瘤的治療有效、藥物副作用低、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，隨著對(duì)中藥的不斷研究，其抗腫瘤機(jī)制也有一定的了解，如對(duì)溶酶體的影響［9］、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［10］、激活免疫系統(tǒng)間接抑制腫瘤［11］等。人參被稱為“百草之王”，是國(guó)內(nèi)外著名的滋補(bǔ)類稀有藥材。其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖均具有抑制作用［12］。

本實(shí)驗(yàn)顯示胃癌細(xì)胞SGC7901含有少量的SP細(xì)胞，灌胃后的兔血清中含有人參的有效成分，可以應(yīng)用于細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相同數(shù)量的SP細(xì)胞較NSP細(xì)胞的成瘤能力強(qiáng)，與研究結(jié)果［3］相符。凋亡通路主要有線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，而最主要的是線粒體通路［13］，由Bcl-2蛋白家族引起線粒體膜通透性增加，進(jìn)而引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)［14］，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2蛋白家族成員，其比例最終決定了細(xì)胞的存亡［11］。Fan et al［15］發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞較NSP細(xì)胞有更強(qiáng)的抗凋亡能力與其高表達(dá)Bcl-2有關(guān)，本研究Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SP細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)較NSP細(xì)胞高。在人參作用于細(xì)胞不同的時(shí)間段，人參對(duì)SP細(xì)胞、NSP細(xì)胞均有一定的誘導(dǎo)凋亡的作用，總體表現(xiàn)在降低Bcl-2/Bax的比值，與實(shí)驗(yàn)［11］結(jié)果一致。但人參可以更明顯地誘導(dǎo)NSP細(xì)胞Bax的表達(dá)，這可能與Hoechst 33342染料引起NSP細(xì)胞狀態(tài)差有關(guān)。

在免疫組化結(jié)果中，SP細(xì)胞NS組與NSP細(xì)胞NS組比較，高表達(dá)Bcl-2，低表達(dá)Bax，經(jīng)人參干預(yù)后，兩細(xì)胞組Bcl-2的表達(dá)均較相應(yīng)NS組低、Bax表達(dá)較NS組高，與Western實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符，表明SP細(xì)胞在體內(nèi)具有較強(qiáng)的成瘤與其抗凋亡能力有一定的關(guān)系，人參可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡存在一定的聯(lián)系。

在體外細(xì)胞層面，人參誘導(dǎo)NSP細(xì)胞Bax的表達(dá)較SP細(xì)胞強(qiáng)，而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)卻未見這種現(xiàn)象，這種差異可能與裸鼠的藥物代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，就體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)的區(qū)別將予以進(jìn)一步研究。

綜上所述，胃癌細(xì)胞SGC-7901中有少量的SP細(xì)胞，SP細(xì)胞在裸鼠成瘤方面要強(qiáng)于NSP細(xì)胞，這與SP細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗凋亡能力有關(guān)。人參對(duì)SP、NSP細(xì)胞裸鼠成瘤具有一定的抑制作用，其機(jī)制與抑制腫瘤細(xì)胞Bcl-2，上調(diào)Bax的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡存在一定的相關(guān)性。由于目前對(duì)于人參的研究尚處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，確切機(jī)制尚待探討，希望不久人參對(duì)胃癌的治療可以應(yīng)用于臨床。

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Effect of Ginseng on human gastric cancer SGC-7901 side population cells xenograft tumor in nude mice and the expression of Bcl-2，Bax

Qian Jun1，Liu Yuan1，2，Guo Chengxu2，et al
（1Dept of The Third Tumor Surgical，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000；2Dept of Graduate，Bengbu Medical College，Bengbu 233000）

Objective To explore the affection of Ginseng on the growth of humangastric cancer SGC-7901 side population（SP）cells xenografts in nude mice and expression of Bcl-2，Bax.Methods Sorting out SP cells and non-side population（NSP）cells by flow cytometry；preparation of Ginseng decoction；tumor volume were measured to draw tumor growth curves and the tumor weight inhibition rates were calculated with tumor weight.The expressions of Bcl-2，Bax were detected by immunohistochemical technology，preparation containing Ginseng drug serum，Western blot technique was used to detect the expression of Bcl-2，Bax.Results The volume of transplanted tumors in SP cells NS group was bigger than group of NSP cells NS group（P＜0.05）.The tumor volume of NS was bigger than Ginseng group（P＜0.01）.The tumor inhibitory rates in the group of Ginseng in SP cells and NSP cells were 43.04%，31.55%，respectively.The results of Western blot and immunohistochemical staining showed that Ginseng could inhibit the expression of Bcl-2 and induce the expression of Bax，the difference was statistically significant（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion The tumorigenicity of SP cells is stronger than NSP cells.Ginseng can restrain the growth of the nude mouse transplanted tumor，and the mechanism may be associated with inducing cell apoptosis.

side population cells；non-side population cells；nude mice transplantated tumor；Ginseng

R 965.2

A

1000-1492（2016）06-0773-05

2016-02-22接收

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81173386）

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1腫瘤外三科、3病理科，蚌埠2330002蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生部，蚌埠 233000

錢 軍，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：qianjun215036@sina.com